הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אופטימלי של תרבית גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPC) לחריטה חזקה של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
עריכת גנים CRISPR/Cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
CRISPR/Cas9 הוא כלי רב-תכליתי ויעיל ביותר לעריכת גנים שאומץ באופן נרחב לתיקון מוטציות גנטיות שונות. ההיתכנות של מניפולציה גנטית של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) במבחנה הופכת את HSPCs לתא מטרה אידיאלי לריפוי גנטי. עם זאת, HSPCs מאבדים באופן מתון את פוטנציאל החריטה והריבוי שלהם בתרבות ex vivo . במחקר הנוכחי מתוארים תנאי תרבית אידיאליים המשפרים את השתלת HSPC ומייצרים מספר גדל והולך של תאים מהונדסים גנטית in vivo. הדו"ח הנוכחי מציג תנאים אופטימליים בתרבית מבחנה, כולל סוג המדיה של התרבית, תוספת קוקטיילים ייחודית של מולקולות קטנות, ריכוז ציטוקינים, צלחות תרביות תאים וצפיפות תרבית. בנוסף לכך, הליך עריכת גנים ממוטב של HSPC, יחד עם אימות אירועי עריכת הגנים, מסופקים. לצורך אימות in vivo , מוצגים עירוי HSPCs בעריכה גנטית וניתוח לאחר חריטה במקבלי עכברים. התוצאות הראו כי מערכת התרבית הגבירה את התדירות של HSCs תפקודיים במבחנה, וכתוצאה מכך השתלה חזקה של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.
מבוא
חוסר הנגישות לתורמים תואמי אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) במסגרות השתלה אלוגניות והפיתוח המהיר של כלי הנדסה גנטית רב-תכליתיים ובטוחים ביותר הופכים את השתלת תאי הגזע ההמטופוייטיים האוטולוגיים (HSCT) לאסטרטגיית טיפול מרפאת בהפרעות הדם התורשתיות 1,2. טיפול גנטי אוטולוגי בגזע המטופויאטי ובתאי אב (HSPC) כולל איסוף של HSPCs של חולים, מניפולציה גנטית, תיקון מוטציות הגורמות למחלות והשתלת HSPCs מתוקנים גנטית לחולה 3,4. עם זאת, התוצאה המוצלחת של הטיפול הגנטי מסתמכת על איכות השתל המהונדס גנטית. שלבי מניפולציית הגנים ותרביית ex vivo של HSPCs משפיעים על א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסויי in vivo בעכברים מדוכאי חיסון אושרו על ידי ובוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של המכון לבעלי חיים (IAEC), כריסטיאן מדיקל קולג', ולורה, הודו. דגימות דם היקפיות מגויסות של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF) נאספו מתורמים אנושיים בריאים בהסכמה מדעת לאחר קבלת אישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB).
1. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMNCs) וטיהור תאי CD34 +
- בצע בידוד PBMNC בהתאם לשלבים הבאים.
הערה: עבור תרבית HSPC במבחנה ועריכת גנים, התחלה של לפחות 1 x 106 HSPCs / קבוצה היא אידיאלית. עבור ניתוח תחריט in vivo , מספר תא התחלתי של לפחות 5 x 10 6 HSPCs/קבוצה הוא אידיא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המחקר הנוכחי מזהה תנאי תרבית HSPC אידיאליים המאפשרים שמירה של CD34+CD133+CD90+ HSCs בתרבית ex vivo. כדי להדגים את העשרת התרבית של HSCs יחד עם הדור המשופר של תאי HSCs מהונדסים גנטית, מסופקים ההליכים הממוטבים לבידוד PBMNC, טיהור תאי CD34+, תרבית, עריכת גנים, השתלה, אפיון השתלה ותאים מהונדסים גנטית in vivo (איור 1). לאחר הטיהור, בוצעה הערכת ציטומטריה של זרימה כדי לבדוק את סמני HSPC, ו- HSPCs תורבתו במשך 72 שעות. לאחר 72 שעות של תרבית.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התוצאה המוצלחת של טיפול גנטי HSPC מסתמכת בעיקר על האיכות והכמות של HSCs הניתנים להשתלה בשתל. עם זאת, התכונות התפקודיות של HSCs מושפעות מאוד במהלך שלב ההכנה של מוצרי ריפוי גנטי, כולל על ידי תרבית חוץ גופית ורעילות הקשורה להליך מניפולציה גנטית. כדי להתגבר על מגבלות אלה, זיהינו תנאי תרבות HSPCs אידיאליים השומרים על הגבעול של CD34+CD133+CD90+ HSCs בתרבות ex vivo. קבוצות מחקר רבות השתמשו ב-SR1 או ב-UM171 או במולקולות אחרות כמולקולות עצמאיות להרחבת דם טבורי (UCB) HSPCs במב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי לא קיימים אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים רוצים להודות לצוות של מתקן ציטומטריה זרימה ומתקן בעלי חיים של CSCR. A. C. ממומן על ידי מלגת ICMR-SRF, K. V. K. ממומן על ידי מלגת DST-INSPIRE, ו- P. B. ממומן על ידי מלגת CSIR-JRF. עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו (מענק מס' BT/PR26901/MED/31/377/2017 ו-BT/PR31616/MED/31/408/2019)
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4D-Nucleofector® X יחידה | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ ערכת X (16 בארות נוקלאוקובט וסחר; רצועות) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| אנטי-אנושי CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| אנטי אנושי CD13 PE | BD BIOSCIENCE | ||
| אנטי אנושי CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | ||
| אנטי אנושי CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| אנטי אנושי CD90 APC | BD BIOSCIENCE | ||
| אנטי אנושי CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| אנטי אנושי CD34 PE | BD BIOSCIENCE | ||
| אנטי עכבר CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (המחלקה לביוטכנולוגיה, הודו) | BI 2000 | |
| צלחת תרבית תאים (צלחות 6 בארות שטופלו על פני השטח של דלתא) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | ||
| פתרונות CrysoStor CS10 | BioLife | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60 מ"ג/10 מ"ל)- | ||
| Guide-it רקומביננטי Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| צינור צנטריפוגה-15 מ"ל | קורנינג | 430790 | |
| צינור צנטריפוגה-50 מ"ל | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | ||
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNA | טכנולוגיות תאי גזע | 6469 | |
| Dulbecco ′ s פוספט חוצץ מלח - 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ ערכת בחירה חיובית CD34 אנושית II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| מגנט EasySep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| יחידת אלקטרופורזה | כתום הודו | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | ||
| ציטומטר זרימה – אריה III | BD BIOSCIENCE- | ||
| פלואו ג'ו | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| מערכת הדמיית ג'ל | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| מגיב HighPrep DTR | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM מדיה | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| מנורת אינפרא אדום | מרפי-מזרק | ||
| אינסולין 6 מ"מ 31G | BD BIOSCIENCE | ||
| קטמין | קטמין 50 | ||
| טוען צבע | 6X TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| עכברים רסן | AVANTOR | TV-150 | |
| ספקטרופוטומטר ננו טיפה | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| תא ספירת תאים נויבאואר | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | מעבדת ג'קסון | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6. SCID Il2rγ &מינוס;/&מינוס; KitW41/W41 (NBSGW) | מעבדת ג'קסון | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| צלחת דלתא 6 בארות | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| פוליסטירן צינור תחתון עגול | BD | 352008 | |
| P3 תמיסת נוקלאופקציה של תא ראשוני | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| פיפטה פסטר | פישר סיינטיפיק | 13-678-20A | |
| ערכת ניקוי PCR | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| כלוב פאי עכבר | פישר סיינטיפיק | 50-195-5140 | |
| פוליסטירן צינור תחתון עגול (12 x 75 מ"מ) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | מכון ווייטהד למחקר ביו-רפואי | https://primer3.ut.ee/ | |
| חילוץ מהיר וסחר; תמיסת מיצוי DNA | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO- | ||
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| כלי ניתוח ICE | SYNTHEGO | a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA פתרון חיץ (TE) 1X | SYNTHEGO | מסופק עם gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| קסילזין | קסילקסין - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
מקורות
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).
- Naldini, L. G....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
