זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a

הואנגלונגבינג (HLB) היא אחת ממחלות ההדרים הבעייתיות ביותר בעולם¹. HLB נגרם על-ידי החיידק המתיישב והמחזק של פלום קנדידטוס ליבריבקטר spp., כולל קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas), Ca. L. africanus, ו- Ca. L. americanus². המין הנפוץ ביותר הקשור ל-HLB בסין ובארה"ב הוא CLas, המועבר על ידי פסילידים של הדרים אסייתיים (Diaphorina citri) או באמצעות השתלה³. לאחר שנדבקו ב-CLas, עצי הדר מפגינים ירידה בגדילה עד מוות². התסמינים השכיחים של עלי הדר הנגועים ב-CLas הם כתמים עזים, איים ירוקים (נקודות ירוקות כהות עגולות קטנות), ורידים מורמים על עלים עבים ועוריים יותר, ויורה מצהיבים לא אחידים². בנוסף, פירות נגועים CLas נראים קטנים lopsided².

מכיוון שאף זן הדרים אינו עמיד בפני HLB ואין תרופה טיפולית ל-HLB, מניעת HLB דורשת הסגר ובידוד של עצי הדר חיוביים ל-CLas ^2,3. לכן, גילוי מוקדם הוא קריטי לניטור והסגר כדי למנוע את התפשטות CLas ולמזער הפסדים כלכליים³. בנוסף, יש צורך בזיהוי CLas רגיש בשל טיטר נמוך של CLas בצמחים בשלב המוקדם של ההדבקה³. בסין, זיהוי CLas מתבצע בדרך כלל על ידי מרכזי בדיקה מוסמכים מסוימים. עם זאת, תהליך האיתור אורך בדרך כלל לפחות שבוע אחד, ודמי האיתור יקרים. לכן, כדי לסייע במעקב אחר שכיחות ה-HLB

טכנולוגיות שונות יושמו כדי לאבחן HLB 4,5,6,7,8,9. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ו-PCR כמותי (qPCR) הם הכלים הנפוצים ביותר לזיהוי CLas בשל הרגישות והספציפיות הגבוהה שלהם ^4,5. עם זאת, טכנולוגיות אלה מסתמכות במידה רבה על מכשירים יקרים וכוח אדם מיומן ביותר. בנוסף, מספר שיטות הגברה איזותרמיות, כגון הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP), פותחו כחלופות אטרקטיביות לשיטות PCR קונבנציונליות בשל פשטותן, מהירותן ועלותן הנמוכה ^8,9,10. עם זאת, מאתגר ליישם אותם כדי לזהות במדויק CLas בשל אותות ההגברה הלא ספציפיים, שעלולים לגרום לתוצאות חיוביות שגויות.

קריספר/Cas מונחה RNA (אשכולות קבועים בין פלינדרומיים קצרים חוזרים / הקשורים לקריספר) זיהוי חומצות גרעין מבוססות אנדונוקלאז פותח כטכנולוגיית אבחון מולקולרית מהדור הבא הודות לרגישות, הספציפיות והאמינות הגבוהה שלה ^11,12,13,14. טכנולוגיות אבחון אלה של CRISPR/Cas מסתמכות על פעילות הנוקלאז הבטוחה של חלבוני Cas כדי לבקע דנ"א חד-גדילי (ssDNA) ששונה באמצעות כתב פלואורסצנטי ומתקן פלואורסצנטי בכל קצה של האוליגונוקלאוטידים, כמו גם מכשיר לזיהוי פלואורסצנטי כדי ללכוד את המדווח הפלואורסצנטי^{המשוחרר 11,12} . פעילות הנוקלאז של מספר אפקטים של Cas המופעלים על-ידי דופלקס המטרה של CRISPR RNA (crRNA) יכולה לבקע ללא הבחנה את ה-ssDNA¹¹ שאינו מטרה. CRISPR-Cas12a (נקרא גם Cpf 1), מערכת V-A CRISPR/CAS מסוג 2, מדגים מספר יתרונות בהשוואה ל-Cas9, כגון סובלנות נמוכה יותר לאי-התאמה וספציפיות גבוהה יותר¹³. מערכת Cas12a/crRNA יושמה לזיהוי רגיש וספציפי של חומצות גרעין של פתוגנים אנושיים ופיטופתוגנים 14,15,16,17,18. לכן, שימוש במערכת Cas12a/crRNA אמור לאפשר זיהוי מדויק ורגיש של חומצת הגרעין של CLas.

Cas12a לבדו אינו רגיש מספיק מבחינה תיאורטית כדי לזהות רמות נמוכות של חומצות גרעין. לכן, כדי לשפר את רגישות הגילוי שלו, זיהוי CRISPR-Cas12a משולב בדרך כלל עם שלב הגברה איזותרמי^14,15. הגברת רקומבינאז פולימראז (RPA) מאפשרת הגברה של DNA איזותרמי רגיש ומהיר בטווח טמפרטורות שבין 37 °C ל-42 °C¹⁹.

פלטפורמת זיהוי בשם DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) המשלבת את פעילות ה- DNase של Cas12a עם RPA וקריאת פלואורסצנציה פותחה^{לאחרונה 12} והוכחה כמזהה חומצת גרעין עם רגישות גבוהה יותר²⁰. יתר על כן, ניתן לצפות באות הפלואורסצנטי הנפלט מהדגימות החיוביות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח.

מאחר שהגברנו את הדנ"א באמצעות RPA, תכננו crRNA המכוון לגן nrdB בעל חמישה עותקים (ריבונוקלאוטיד רדוקטאז β- תת-יחידה) הספציפי ל-CLas²¹, והשתמשנו בפעילות ה-DNase של חלבון Cas12a, קראנו לשיטת זיהוי CLas זו CLas-DETECTR. בהשוואה לשיטות זיהוי CLas קיימות, CLas-DETECTR הוא מהיר, מדויק, רגיש וניתן לפריסה.

1. בניית ה-CLas-DETECTR

הערה: הבנייה של CLas-DETECTR היא תהליך בן ארבעה שלבים: הכנת תמיסה, בידוד DNA כולל של הדרים, הגברה איזותרמית של דנ"א והדמיית תוצאות. הסכימה של בדיקת CLas-DETECTR מודגמת באיור 1A.

1. הכנת פתרונות
   1. הכן מאגר A: 20 mM NaOH ב 6% PEG 200. עבור 100 מ"ל, יש להוסיף 113 מ"ג של NaOH ו-6 גרם של PEG 200 ל-80 מ"ל של H₂O בבקבוק. לדגור את הבקבוק באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס עד כל PEG 200 מומס. לאחר מכן, הוסף H₂O לנפח של 100 מ"ל.
   2. הכן פתרון B: עבור כל תגובה, הוסף 10 μL של מאגר RPA, 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של R-RPA-RNRr, ו- 3.9 μL של ddH₂O לנפח סופי של 15.5 μL.
      הערה: F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr הם הפריימרים המשמשים בבדיקה נגד הגן NRDB . ראו טבלה 1 לרצף.
   3. הכן פתרון C: עבור כל תגובה, הוסף 1 μL של מדווח ssDNA, 3 μL של מאגר NEB 3.1, 1 μL של crRNA, 4 μL של Cas12a, ו 11 μL של ddH₂O לנפח סופי של 20 μL.
      הערה: אם יש דוגמאות רבות לזיהוי, צור נפח גדול של פתרון B ופתרון C, ו- aliquot מאוחר יותר.
2. בידוד דנ"א כולל בהדרים
   הערה: כדי לחסוך זמן ולהפוך שיטה זו למתאימה לזיהוי CLas בשדה, הגישה המבוססת על פוליאתילן גליקול אלקליין (PEG) שימשה להשגת תמציות צמחים גולמיות להגברת DNA^22,23
   1. עלי הדר שימשו בפרוטוקול זה. ראשית, אגרוף חמישה דיסקיות עלה מתוך עלה. לאחר מכן, הכניסו את דיסקיות העלים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, והוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ A.
      הערה: בשטח, נקו תחילה את העלים אם יש אבק המכסה אותם. ניתן לחתוך את דיסקיות העלים באמצעות המכסה של צינור 1.5 מ"ל כדי למנוע זיהום צולב. רקמות הדרים אחרות, כגון שורשים, גבעולים, פירות ופרחים, יכולות לשמש גם בפרוטוקול זה.
   2. טוחנים את דיסקי העלים באופן ידני עד לקבלת מוט פלסטיק.
   3. השאירו את הצינור ללא הפרעה למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש בסופרנטנט להגברת DNA.
      הערה: ניתן להשהות את הבדיקה כאן, וניתן לאחסן את תמציות הצמחים הגולמיות שהופקו בשיטת אלקליין-PEG בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך שנה אחת לפחות. עצי התפוז המתוק של ניוהול (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) המוצגים בסרטון גודלו בעציץ מלא בתערובת של 9/3/1 (v/v/v) אדמת כבול / ורמיקוליט / פרלייט ונשמרו בבית זכוכית הממוקם בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. העצים הנגועים ב-HLB חוסנו על ידי השתלה עם ניצני ניוהול חיוביים ל-CLas. העצים הנגועים ב-HLB והלא נגועים ב-HLB אושרו על ידי PCR. CLas זוהה באמצעות זוג הפריימרים (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) המכוון לגן הסמן הספציפי ל-CLas nrdB. בצד השני, ניתן למצוא תסמינים אופייניים של HLB, כתמים ועלים מצהיבים על עצים חיוביים ל-CLas, אך לא על עצים שליליים ל-CLas.
3. הגברה איזותרמית של דנ"א
   1. הוסף 1 μL של סופרנטנט משלב 1.2.3 ו-1 μL של MgOAc (ריכוז סופי של 14 mM) לתמיסה B וערבב היטב.
   2. במעבדה, דגרו אותם באינקובטור פשוט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: בשטח, החזק את הצינורות ביד למשך 15 דקות. כמו כן, מומלץ לדגור צינורות באינקובטור פשוט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות אם התנאים מאפשרים זאת.
4. תצוגה חזותית של תוצאות
   1. מוסיפים 10 μL מהתערובת משלב 1.3.2 לתמיסה C ומערבבים היטב.
   2. לדגום אותם בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
   3. הרכיבו משקפי מגן וצפו באות הפלואורסצנטי הירוק המשתחרר מכתב ה-ssDNA המסומן ב-5' 6-פלואורסצין ב-5' וב-quencher הפלואורסצנטי ב-3' באמצעות מכשיר לגילוי פלואורסצנטי ידני (אורך גל עירור: 440 ננומטר, אורך גל פליטה: 500 ננומטר).
      הערה: אות פלואורסצנציה ירוק יכול להימשך מספר ימים, עדיף
      התראה: האור הנפלט על-ידי ההתקן לזיהוי פלואורסצנציה מזיק לעיניים. הקפידו להרכיב משקפי מגן לפני שתתבוננו בתוצאות.

2. מבחן ספציפיות

הערה: כדי לבדוק את הספציפיות של CLas-DETECTR, חיידק הריזוספרה אגרובקטריום טומפצ'ינס GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), וזן Burkholderia stabilis 1440 שבודד במעבדה²⁴ היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR.

הערה: לא ניתן לתרבת קנדידטוס ליבריבקטר (CLas). ניתן להשיג דנ"א CLas רק מהפקת דנ"א גנומי מרקמות הדרים הנגועות ב-CLas. Xcc הוא הגורם הסיבתי של מחלת הדרים חשובה אחרת, קנקן הדרים. זן Burkholderia stabilis 1440 הוא חיידק אנטי-Xcc שבודד במעבדה. לכן, נעשה שימוש בזנים טהורים לכל שלושת החיידקים האלה

1. חלץ את הדנ"א הגנומי החיידקי (gDNA) באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית חיידקית בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש במים כבקרה שלילית.
2. בצע PCR באמצעות רצועות צינור PCR של 0.2 מ"ל עם מכסים אופטיים בתערובת תגובה של 25 μL המכילה 1 μL של F-RPA-RNRf, 1 μL של R-RPA-RNRr, 12.5 μL של Ex Taq גרסה 2.0 בתוספת צבע, 1 μL של תבנית DNA, ו- 9.5 μL של H₂O.
   1. השתמש בתנאי התגובה הבאים של מחזור תרמי: דקה אחת ב- 98 °C (88 °F); ואחריו 35 מחזורים של 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, 15 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; ואז 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ולהחזיק ב 16 מעלות צלזיוס.
   2. הפעל את מוצרי ה- PCR על ג'ל אגרוז 1% ב- 120 V למשך 15 דקות.
3. בצע qPCR בתערובת תגובה של 20 μL המכילה 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של R-RPA-RNRr, 10 μL של 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL של תבנית ה- DNA, ו- 7.4 μL של H₂O.
   1. השתמש בתנאי התגובה הבאים של מחזור תרמי: 30 שניות ב- 95 °C; ואחריו 45 מחזורים של 5 שניות ב-95 מעלות צלזיוס ו-32 שניות ב-60 מעלות צלזיוס; ואז שלב עקומת התכה של 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס ו-15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס.
   2. כלול שלוש חזרות טכניות בכל חזרה.
4. בצע את פעולת השירות CLas-DETECTR בהתאם לשלבים 1.1-1.4.

3. השוואת רגישות

1. כדי לבדוק את הרגישות של CLas DETECTR, זהה סדרה של דילולים של מקטעי DNA של CLas באמצעות PCR, CLas-DETECTR ו- qPCR, כמתואר לעיל.
2. הגבר מקטע דנ"א באורך של 1,060 bp מ- nrdB באמצעות קבוצת הפריימרים F-RNR ו- R-RNR בתערובת תגובה של 100 μL המכילה 4 μL של F-RNR, 4 μL של R-RNR, 50 μL של PrimeSTAR Max Premix, 2 μL של תבנית DNA, ו- 40 μL של H₂O, בעקבות תנאי תגובת המחזור התרמי (30 שניות ב- 98 °C; ואחריו 35 מחזורים של 10 שניות ב- 98 °C, 15 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; ואז 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ומחזיקים ב-16 מעלות צלזיוס).
   הערה: הגן nrdB (ריבונוקלאוטיד רדוקטאז β- תת-יחידה) הוא ספציפי ל-CLas²¹. ניתן להשיג בקלות את האמפליקון nrdB מ-gDNA הדרים חיובי ל-CLas באמצעות ערכת הפריימרים F-RNR ו-R-RNR. קבוצת הפריימרים F-RNR ו-R-RNR מגבירה מקטע nrdB של 1,060 bp, ואילו קבוצת הפריימרים F-RPA-RNR ו-R-RPA-RNR מגבירה מקטע של 104 bp של הגן nrdB, שהוא החלק של מקטע nrdB של 1,060 bp.
3. טהרו את מוצרי ה-PCR עם ערכת מיצוי ג'ל DNA בהתאם למדריך היצרן.
4. דלל את מוצרי ה-PCR המכילים את אמפליקונים nrdB עם ddH₂O מעוקר.
5. חשב את מספר ההעתקה של הגן nrdB באמצעות מספר עותק DNA מקוון זמין מסחרית ומחשבון דילול.
6. הכן דילולי DNA המכילים 2.01 × 10⁶ עותקים / μL, 2.01 × 10⁵ עותקים / μL, 2.01 × 10⁴ עותקים / μL, 2.01 × 10³ עותקים / μL, 2.01 × 10 2 עותקים / μL, 2.01 × 10 1 עותקים^/ μL, 2.01 × 10 0 עותקים / μL, ו-^2.01 × 10^{−1 עותקים /} μL של מקטע DNA CLas.

4. זיהוי מדגם

הערה: לאחר בדיקת הספציפיות והרגישות, נעשה שימוש בשיטת CLas-DETECTR כדי לזהות נוכחות של CLas בדגימות עלי השדה שנאספו מעצי תפוז מתוקים של Newhall שגדלו במשתלת משאבי הנבטים בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. בוצע qPCR כדי לאמת את התוצאות.

1. בדוק בסך הכל 15 עצים. השתמש במים כבקרה שלילית.
2. בצע את השיטות CLas-DETECTR ו- qPCR כמתואר לעיל.
   הערה: בשל מאפייני ההפצה הלא אחידים של CLas בהדרים, עלים המראים תסמיני HLB נאספו כעדיפות. אם עץ נראה בריא, העלים נאספו באופן אקראיCLas-DETECTR המערכת פועלת כראוי.

כאן תיארנו פלטפורמה ניידת, CLas-DETECTR, המסרקת את מערכות ה-RPA וה-CRISPR-Cas12a כדי לאבחן HLB בשטח. הסכימה של CLas-DETECTR מודגמת באיור 1A.

כאשר דגימות עלים מעצי ניוהול הנגועים ב-HLB ומעצי ניוהול שאינם נגועים ב-HLB (איור 1B), שעבורם נוכחות ה-CLas אושרה על-ידי PCR (איור 1C), היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR, אות פלואורסצנטי ירוק נצפה בדגימה הנגועה ב-HLB, אך לא בדגימה הלא נגועה ב-HLB ובבקרה השלילית (איור 1D).

קבענו את הספציפיות של CLas-DETECTR באמצעות חומצות גרעין המופקות מחיידקים אחרים. ערכת הפריימרים של F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr המשמשת בבדיקת CLas-DETECTR שימשה גם ב-PCR וב-qPCR. ניתן היה לראות רצועה באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כאשר היא מוגברת באמצעות gDNA של עלי הדרים חיוביים ל-CLas, אך לא באמצעות gDNA חיידקי אחר במבחני ה-PCR (איור 2A). במבחני qPCR, ערך מחזור הסף הממוצע (Ct) של CLas היה 24 ± 0.7, בעוד שערכי ה-Ct הממוצעים של A. tumefaciens GV3101, Xcc ו-B. stabilis strain 1440 היו 38 ± 0.7, 39 ± 1.4 ו-39 ± 0.7, בהתאמה (איור 2B). בדרך כלל, התוצאה נחשבת שלילית כאשר ערך Ct גבוה מ- 38. תוצאות אלה מראות כי זוג הפריימרים F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr הם ספציפיים ל-CLas. בבדיקת CLas-DETECTR, רק CLas gDNA הדגים אותות פלואורסצנטיים ירוקים; ה-gDNA שחולץ מזן A. tumefaciens GV3101, Xcc ו-B. stabilis 1440 לא (איור 2C), מה שאומר ש-CLas-DETECTR יכול לזהות CLas באופן ספציפי.

בדקנו גם את הרגישות של CLas-DETECTR באמצעות סדרה של דילולי דנ"א של CLas. PCR יכול לזהות 2.01 × 102 עותקים/μL (איור 3A). מצד שני, CLas-DETECTR יכול לזהות 2.01 × 100 עותקים/μL, מה שמרמז על כך שזה בר קיימא כאבחון שדה רגיש (איור 3B). ה-qPCR יכול היה לזהות 2.01 × 10− 1 עותקים/μL, אך ערך ה-Ct היה גבוה מ-36 (איור 3C). לכן, CLas-DETECTR הוא שני סדרי גודל רגישים יותר מ-PCR מסורתי וסדר גודל אחד פחות רגיש מ-qPCR כאשר נעשה שימוש באמפליקונים מדוללים (איור 3).

לבסוף, בחנו את ההיתכנות של CLas-DETECTR לדגימות שדה והשווינו את הרגישות שלו ל-qPCR, גישה מבוססת ורגישה לזיהוי חומצות גרעין21. בדרך כלל, ערך Ct של זיהוי CLas על-ידי qPCR גבוה מ-36 פירושו שריכוז ה-CLas נמוך מ-2.01 ×-10− 1 עותקים/μL, שהוא ריכוז נמוך מאוד (איור 3C). מבין 15 הדגימות, ערך ה-Ct של דגימות 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ו-14 שזוהו על-ידי qPCR היה נמוך מ-36, ונצפו אותות פלואורסצנטיים ירוקים לכאורה (איור 4). מצד שני, כאשר ערכי Ct של דגימות 6, 7, 9, 12 ו-15 שזוהו על-ידי qPCR לא נקבעו, לא נצפו אותות פלואורסצנטיים ירוקים (איור 4). יתר על כן, אותות פלואורסצנטיים ירוקים חלשים נצפו כאשר ערכי ה-Ct של מדגם 5 ומדגם 11 שזוהו על-ידי qPCR היו גבוהים מ-36 (איור 4). התוצאות מצביעות על כך שהפלטפורמה שלנו היא כלי מהיר, חזק ורגיש לאבחון HLB בתחום.

טבלה 1: חומצת גרעין ששימשה במחקר זה. ה-ssDNA-FQ הוא דנ"א חד-גדילי המסומן ב-5' 6-FAM (פלואורסצין) ב-5' ו-5' החור השחור Quencher 1 (BHQ1) ב-3'. קיצורים: F = כתב פלואורסצנטי; Q = קונצ'ר פלואורסצנטי.

איור 1: תכנון ואימות של CLas-DETECTR. (A) סכמת בדיקת CLas-DETECTR. שלב 1: הכן חיץ A המכיל 20 mM NaOH ב 6% PEG 200 למיצוי gDNA מהיר; תמיסה B המכילה 10 μL של מאגר RPA, 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של F-RPA-RNRr, ו-3.9 μL של ddH2O בכל תגובה להגברת DNA איזותרמית; תמיסה C המכילה 1 μL של כתב ssDNA, 3 μL של מאגר NEB 3.1, 1 μL של crRNA המכוון ל- nrdB, 4 μL של Cas12a, ו- 11 μL של ddH2O בכל תגובה לשחרור כתב פלואורסצנטי. שלב 2: חמישה דיסקי עלים שנוקבו מעלים שימשו לחילוץ הדנ"א הכולל של ההדרים עם 200 μL של חיץ A. שלב 3: חומצות הגרעין הספציפיות ל-CLas הוגברו באמצעות הפריימרים F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr המכוונים לגן הסמן הספציפי ל-CLas nrdB בתמיסה B עם 1 μL של סופר-נטנט משלב 2 ו-1 μL של MgOAc בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. שלב 4: תמיסה C עם 10 μL של התערובת משלב 3 הודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, ואת האות הפלואורסצנטי הירוק נצפה באמצעות מכשיר גילוי פלואורסצנטי כף יד. ה-ssDNA-FQ סומן ב-5' 6-FAM (פלואורסצין) ב-5' וב-5' ב-3'. קיצורים: F = כתב פלואורסצנטי; Q = קונצ'ר פלואורסצנטי. (B) העץ הנגוע ב-HLB (משמאל) מראה כתמים ועלים צהובים, אך העץ הלא נגוע ב-HLB (מימין) נראה ירוק. (C) נוכחות CLas אושרה באמצעות זוג הפריימרים F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr. (D) הדגימה הנגועה ב-HLB מדגימה אותות פלואורסצנטיים ירוקים, בעוד שה-HLB-uninfected ו-H2O אינם מופיעים בבדיקת CLas-DETECTR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: בדיקת הספציפיות של CLas-DETECTR. (A) אלקטרופורזה בג'ל Agarose של תוצאות ה-PCR, (B) ערך ה-Ct של תוצאות ה-qPCR, ו-(C) תוצאות ה-CLas-DETECTR מוגברות עם זוג הפריימרים של F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr באמצעות gDNA המופק מעלי ניוהול חיוביים ל-CLas ושלושה חיידקים אחרים. שוב, H2O שימש כבקרה שלילית. M: סולם DNA; gDNA המופק מעלי ניוהול חיוביים ל-CLas (1), אגרובקטריום טומפצ'ינס GV3101 (2), קסנתומונס ציטרי תת-קרקעי (Xcc, 3), וזן Burkholderia stabilis 1440 שבודד במעבדה שלנו (4). ערך Ct מייצג את ערך ה- Ct הממוצע של שלוש חזרות טכניות ± שגיאת תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: השוואת רגישות של CLas-DETECTR עם PCR ו-qPCR. ניתוח זיהוי של סדרה של דילולים ספציפיים של אמפליקון דנ"א CLas באמצעות (A) PCR, (B) CLas-DETECTR ו-(C) qPCR. (A) מתוך 25 μL של מוצרי PCR, 5 μL הועמסו לתוך הג'ל. (B) התמונות צולמו במצלמת סמארטפון באמצעות משקפי מגן מתחת לאור הנפלט על ידי מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני (אורך גל עירור: 440 ננומטר, אורך גל פליטה: 500 ננומטר). אותם פריימרים שימשו בכל המבחנים. מוצרי ה-PCR המטוהרים באורך של 1,060 bp מוגברים עם ערכת הפריימר F-RNR ו-R-RNR המכוונת לגן nrdB הספציפי ל-CLas דוללו באמצעות H2O לריכוזים של 2.01 × 106 עותקים/μL (1), 2.01 × 105 עותקים/μL (2), 2.01 × 104 עותקים/μL (3), 2.01 × 103 עותקים/μL (4), 2.01 × 102 עותקים/μL (5), 2.01 × 101 עותקים/μL (6), 2.01 × 100 עותקים/μL (7), ו-2.01 × 10−1 עותקים/μL (8). H2O שימש כבקרה שלילית. M: סולם DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: זיהוי CLas באמצעות דגימות שדה. CLas ב-15 דגימות עלים שנאספו מעצי תפוז מתוקים של ניוהול נבדקו על ידי מבחני CLas-DETECTR ו-qPCR שתוארו לעיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.