בעבודה זו פותחה שיטת זיהוי מהירה, רגישה וניידת עבור Candidatus Liberibacter asiaticus המבוססת על הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הגילוי המוקדם של קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas) על ידי מגדלי הדרים מקל על התערבות מוקדמת ומונע את התפשטות המחלה. כאן מוצגת שיטה פשוטה לאבחון מהיר ונייד של הואנגלונגבינג (HLB) המשלבת הגברה של רקומבינאז פולימראז וכתב פלואורסצנטי המנצל את פעילות הנוקלאז של מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות המקובצים באופן קבוע/מערכת 12a (CRISPR-Cas12a) הקשורה לקריספר. הרגישות של טכניקה זו היא הרבה יותר גבוהה מאשר PCR. יתר על כן, שיטה זו הראתה תוצאות דומות ל- qPCR כאשר נעשה שימוש בדגימות עלים. בהשוואה לשיטות גילוי CLas קונבנציונליות, ניתן להשלים את שיטת האיתור המוצגת כאן תוך 90 דקות ועובדת במצב איזותרמי שאינו דורש שימוש במכונות PCR. בנוסף, ניתן להמחיש את התוצאות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח.
מבוא
הואנגלונגבינג (HLB) היא אחת ממחלות ההדרים הבעייתיות ביותר בעולם1. HLB נגרם על-ידי החיידק המתיישב והמחזק של פלום קנדידטוס ליבריבקטר spp., כולל קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas), Ca. L. africanus, ו- Ca. L. americanus2. המין הנפוץ ביותר הקשור ל-HLB בסין ובארה"ב הוא CLas, המועבר על ידי פסילידים של הדרים אסייתיים (Diaphorina citri) או באמצעות השתלה3. לאחר שנדבקו ב-CLas, עצי הדר מפגינים ירידה בגדילה עד מוות2. התסמינים השכיחים של עלי הדר הנגועים ב-CLas הם כתמים עזים, איים ירוקים (נקודות ירוקות כהות עגולות קטנות), ורידים מורמים על עלי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בניית ה-CLas-DETECTR
הערה: הבנייה של CLas-DETECTR היא תהליך בן ארבעה שלבים: הכנת תמיסה, בידוד DNA כולל של הדרים, הגברה איזותרמית של דנ"א והדמיית תוצאות. הסכימה של בדיקת CLas-DETECTR מודגמת באיור 1A.
- הכנת פתרונות
- הכן מאגר A: 20 mM NaOH ב 6% PEG 200. עבור 100 מ"ל, יש להוסיף 113 מ"ג של NaOH ו-6 גרם של PEG 200 ל-80 מ"ל של H2O בבקבוק. לדגור את הבקבוק באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס עד כל PEG 200 מומס. לאחר מכן, הוסף H2O לנפח של 100 מ"ל.
- הכן פתרון B: עבור כל תגובה, הוסף 10 μL של מאגר RPA, 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של R-RPA-RNRr, ו- 3.9 μL של ddH2O לנפח סו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן תיארנו פלטפורמה ניידת, CLas-DETECTR, המסרקת את מערכות ה-RPA וה-CRISPR-Cas12a כדי לאבחן HLB בשטח. הסכימה של CLas-DETECTR מודגמת באיור 1A.
כאשר דגימות עלים מעצי ניוהול הנגועים ב-HLB ומעצי ניוהול שאינם נגועים ב-HLB (איור 1B), שעבורם נוכחות ה-CLas אושרה על-ידי PCR (איור 1C), היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR, אות פלואורסצנטי ירוק נצפה בדגימה הנגועה ב-HLB, אך לא בדגימה הלא נגועה ב-HLB ובבקרה השלילית (איור 1D).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה מציג שיטה מהירה וניידת לזיהוי CLas בשם CLas-DETECTR, המשלבת את מערכות ה-RPA וה-CRISPR-Cas12a. זרימת העבודה מודגמת באיור 1. CLas-DETECTR מזהה CLas עם ספציפיות ורגישות (איור 2 ואיור 3). יתר על כן, באמצעות דגימות עלים של Newhall, CLas-DETECTR מזהה CLas באותה רגישות כמו qPCR (איור 4). יש לציין כי ניתן להמחיש את תוצאות הזיהוי ישירות באמצעות מכשיר נייד כף יד שאינו תלוי במכשירים מבוססי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית R & D המפתח הלאומית של סין (2021YFD1400805), תוכנית המדע והטכנולוגיה הגדולה R&D של מחוז ג'יאנגשי (20194ABC28007), פרויקטים של מחלקת החינוך של ג'יאנגשי (GJJ201449), והחדשנות השיתופית של המחקר המדעי החקלאי המודרני במחוז ג'יאנגשי (JXXTCX2015002(3+2)-003).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת מיצוי ג'ל DNA AxyPrep | קורנינג | 09319KE1 | |
| ערכת מיצוי DNA גנומי חיידקי | בסין Solarbio | D1600 | סין |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | סין |
| Ex Taq גרסה 2.0 פלוס צבע | TaKaRa | RR902A | סין |
| מכשיר לזיהוי פלורסנט כף יד | LUYOR | 3415RG | |
| מנקב חורים בסין | מעדנייה | 114 | סין |
| מגנזיום אצטט, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | בריטניה |
| NaOH | SCR | 10019718 | סין |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | ארה"ב |
| צינורות רצועת PCR | LABSELECT | PST-0208-FT-C | סין |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | ארה"ב |
| PrimeSTAR Max DNA פולימרים | TaKaRa | R045A | סין |
| טעינה מהירה סגול 1 kb פלוס סולם DNA | ניו אינגלנד Biolabs | N0550S | ארה"ב |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | סין |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | בריטניה |
מקורות
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529(2022).
- Bové, J. M. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
