Method Article

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

DOI:

10.3791/64074

⸱

July 20th, 2022

1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology, State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן מסורתי, שלדי האקטין והמיקרוטובול נחקרו כישויות נפרדות, מוגבלים לאזורים או תהליכים תאיים ספציפיים, ומווסתים על ידי חבילות שונות של חלבונים קושרים ייחודיים לכל פולימר. מחקרים רבים מראים כיום כי הדינמיקה של שני הפולימרים הציטוסקטליים שלובים זה בזה, וכי הצלבה זו נדרשת עבור רוב ההתנהגויות התאית. מספר חלבונים המעורבים באינטראקציות אקטין-מיקרוטובול כבר זוהו (כלומר, טאו, MACF, GAS, פורמינים ועוד) והם מאופיינים היטב ביחס לאקטין או למיקרוטובולים בלבד. עם זאת, מחקרים מעטים יחסית הראו בדיקות של תיאום אקטין-מיקרוטובול עם גרסאות דינמיות של שני הפולימרים. זה עשוי לחסום מנגנוני קישור מתפתחים בין אקטין למיקרוטובולים. כאן, טכניקת שיקום מחדש של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) המבוססת על מיקרוסקופיה במבחנה מאפשרת הדמיה של דינמיקה של אקטין ומיקרוטובולים הן מהתגובה הביוכימית האחת. טכניקה זו משמרת את דינמיקת הפילמור של חוט אקטין או מיקרוטובולים בנפרד או בנוכחות הפולימר האחר. חלבון טאו הזמין באופן מסחרי משמש להדגמת האופן שבו התנהגויות של אקטין-מיקרוטובולים משתנות בנוכחות חלבון קלאסי של קישור צולב של שלד ציטוסקטלי. שיטה זו יכולה לספק תובנות פונקציונליות ומכניסטיות מהימנות לגבי האופן שבו חלבונים רגולטוריים בודדים מתאמים דינמיקה של אקטין-מיקרוטובולים ברזולוציה של חוטים בודדים או קומפלקסים מסדר גבוה יותר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחינה היסטורית, אקטין ומיקרוטובולים נתפסו כישויות נפרדות, שלכל אחת מהן קבוצה משלה של חלבונים רגולטוריים, התנהגויות דינמיקה ומיקומים תאיים נפרדים. ראיות רבות מראות כיום כי אקטין ופולימרים של מיקרוטובולים עוסקים במנגנוני crosstalk פונקציונליים החיוניים לביצוע תהליכים תאיים רבים, כולל נדידה, מיקום ציר מיטוטי, הובלה תוך-תאית ומורפולוגיהשל תאים 1,2,3,4. ההתנהגויות המתואמות המגוונות העומדות בבסיס דוגמאות אלה תלויות באיזון מורכב של גורמי צימוד, אותות ותכונות פיזיקליות. עם זאת, הפרטים המולקולריים העומדים בבסיס מנגנונים אלה עדיין אינם ידועים במידה רבה מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בפולימר ציטוסקטלי יחיד בכל פעם 1,2,5.

אקטין ומיקרוטובולים אינם מתקשרים ישירות 6,7,8. הדינמיקה המתואמת של אקטין ומיקרוטובולים הנראים בתאים מתווכת על ידי גורמים נוספים. חלבונים רבים שנחשבו לווסתים את ההצלבה של אקטין-מיקרוטובול זוהו ופעילותם מאופיינת היטב ביחס לפולימר ציטוסקטלי בלבד 1,2. ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שגישת פולימר יחיד זו הסתירה את הפונקציות הכפולות של חלק מהחלבונים/קומפלקסים המאפשרים אירועי צימוד אקטין-מיקרוטובול 7,8,9,10,11,12,13. ניסויים שבהם שני הפולימרים נוכחים הם נדירים ולעתים קרובות מגדירים מנגנונים עם פולימר דינמי יחיד וגרסה מיוצבת סטטית של 6,8,9,10,10,11,14,15,16,17,18 . לפיכך, יש צורך בשיטות כדי לחקור את התכונות המתפתחות של חלבונים מתאמי אקטין-מיקרוטובולים, שניתן להבין אותם במלואם רק במערכות ניסיוניות המשתמשות בשני הפולימרים הדינמיים.

השילוב של גישות לסימון חלבונים ישירים, תגי זיקה מקודדים גנטית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית (TIRF) יושם בהצלחה רבה במערכות שחזור ביומימטיות 19,20,21,22,23. תוכניות רבות מלמטה למעלה אינן מכילות את כל הגורמים המווסתים חלבונים בתאים. עם זאת, טכנולוגיית "ביוכימיה על כוסית" עידנה מנגנונים רבים של דינמיקת אקטין ומיקרוטובולים בקני מידה מרחביים וטמפורליים גבוהים, כולל הרכיבים הדרושים להרכבה או לפירוקשל פולימרים, ותנועת חלבונים מוטוריים 5,12,23,24,25,26,27 . כאן מתוארת גישה מינימלית של רכיב יחיד לחקר צימוד אקטין-מיקרוטובול במבחנה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם חלבונים מטוהרים זמינים מסחרית או טהורים מאוד, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי, תאי פרפוזיה, ומורחבים לסכימות מסובכות יותר המכילות תמציות תאים או מערכות סינתטיות. כאן, חלבון טאו הזמין באופן מסחרי משמש להדגמת האופן שבו הדינמיקה של השלד הציטו-שלדי משתנה בנוכחות חלבון צימוד אקטין-מיקרוטובול, אך ניתן להחליף אותו בגורמים מתאמים אחרים של אקטין-מיקרוטובול. היתרון העיקרי של מערכת זו על פני גישות אחרות הוא היכולת לנטר בו זמנית את הדינמיקה של פולימרים ציטוסקטליים מרובים בתגובה אחת. פרוטוקול זה גם מספק למשתמשים דוגמאות וכלים פשוטים לכימות שינויים בפולימרים של שלדיים. לפיכך, משתמשי הפרוטוקול יפיקו נתונים אמינים, כמותיים, בעלי רזולוציה של נימה אחת, כדי לתאר מנגנונים העומדים בבסיס האופן שבו חלבונים רגולטוריים מגוונים מתאמים את הדינמיקה של אקטין-מיקרוטובול.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שטיפת הכיסויים

הערה: שטיפה (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מכסה את הליפסים על פי Smith et al., 201328.

  1. ארגנו כיסויים במיכל דואר שקופיות מפלסטיק.
  2. טבילה מכסה כיסויים ברצף בתמיסות הבאות וסוניקאט במשך 30-60 דקות, שטיפה עם ddH2O 10 פעמים בין כל תמיסה: ddH2O עם טיפה אחת של סבון כלים; 0.1 מ' קוה. החנויות מכסות ב-100% אתנול למשך עד 6 חודשים.
    הערה: אין לגעת במשטחי זכוכית באצבעות לא אהובות. במקום זאת, השתמש במלקחיים.

2. ציפוי מנוקה (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מכסה כיסויים עם mPEG- וביוטין-PEG-סילאן

הערה: פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי במערכת ביוטין-סטרפטווידין כדי למקם אקטין ומיקרוטובולים בתוך מישור ההדמיה של TIRF. ניתן להשתמש בציפויים ומערכות אחרות (למשל, נוגדנים, פולי-L-ליזין, מיוזין NEM וכו ').

  1. הפשרת אליקוטים של אבקות PEG-סילאן וביוטין-PEG-סילאן.
  2. ממיסים אבקות PEG ב-80% אתנול (pH 2.0) כדי ליצור תמיסות ציפוי של 10 מ"ג/מ"ל mPEG-סילאן ו-2-4 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן, ממש לפני השימוש.
    הערה: אבקות PEG נראות לעתים קרובות מומסות אך ייתכן שאינן ברמה המיקרוסקופית. החייאה נכונה אורכת כ-1-2 דקות עם צנרת קבועה. משתמשים מוזמנים לטפט 10 פעמים נוספות בעקבות הופעת פירוק אבקה.
    אזהרה: לבשו כפפות כדי להגן על העור מפני HCl מרוכז בעת ביצוע 80% אתנול (pH 2.0).
  3. הסר את הכיסוי הנקי (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מאחסון אתנול באמצעות מלקחיים. מייבשים בגז חנקן ומאחסנים בצלחת פטרי נקייה.
  4. ציפוי מכסה תמיסת ציפוי של 100 μL: תערובת של 2 מ"ג/מ"ל mPEG-סילאן (MW 2,000) ו-0.04 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן (MW 3,400) ב-80% אתנול (pH 2.0).
    הערה: לציפוי דליל (מומלץ) יש להשתמש ב-2 מ"ג/מ"ל mPEG-silane וב-0.04 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן. לציפוי צפוף יש להשתמש ב-2 מ"ג/מ"ל mPEG-סילאן, 4 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן.
  5. הדגירה מכסה כיסויים בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות לפחות או עד לשימוש.
    הערה: כיסויים מצופים מתפרקים אם הם מאוחסנים בטמפרטורה של 70 °C (70 °F) למשך יותר משבועיים.

3. הרכבת תאי זרימה להדמיה

  1. חותכים 12 רצועות של סרט דו-צדדי בעל גב כפול לאורך של 24 מ"מ. הסר צד אחד של גיבוי הקלטת ותקן פיסות נייר דבק הסמוכות לששת החריצים הנמצאים בתא הדמיה נקי.
    הערה: קלטת חייבת להיות שטוחה להרכבה נכונה, אחרת תאי הדמיה ידלפו. הסר בזהירות את גיבוי הקלטת כדי למנוע בליטות. מומלץ להחליק תאים מודבקים על משטח נקי כדי להחליק מגעים של תאי קלטות.
  2. הסר את פיסת הגב השנייה של הקלטת כדי לחשוף את הצד הדביק של הקלטת לאורך כל חריץ תא. מניחים את סרט התא בצד על משטח נקי.
  3. ערבבו את תמיסות השרף וההקשחה 1:1 (או על פי הוראות היצרן) בסירת שקילה קטנה.
  4. השתמש בקצה P1000 כדי למקם טיפה של אפוקסי מעורב בין רצועות הקלטת בסוף כל חריץ של תא הדמיה (חץ אדום; איור 1A). מניחים סרט דביק/אפוקסי בצד על משטח נקי.
  5. הסר כיסוי מצופה מחממה של 70 °C. יש לשטוף משטחים מצופים ולא מצופים של כיסויים עם ddH2O שש פעמים, יבשים עם גז חנקן מסונן, ולאחר מכן מודבקים לתא ההדמיה עם ציפוי הכיסוי בצד לכיוון הסרט.
  6. השתמש בקצה פיפטה P200 או P1000 כדי להפעיל לחץ על ממשק הזכוכית-קלטת כדי להבטיח אטימה טובה בין הקלטת לבין הכיסוי.
    הערה: עם אטימה מתאימה, סרט הדבקה דו-צדדי הופך להיות שקוף. תאי הדמיה ללא מגעים מספיקים של תאי קלטות ידלפו.
  7. דגירה של תאים מורכבים בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות לפחות כדי לאפשר לאפוקסי לאטום באופן מלא בארות תאים לפני השימוש. תאי פרפוזיה פוקעים תוך 12-18 שעות מההרכבה.
    הערה: בהתאם למיקום הקלטת ולעובי של סרט הדבקה הדו-צדדי שבו נעשה שימוש, התא המורכב יהיה בעל נפח סופי של 20-50 μL.

4. התניה של תאי פרפוזיה

  1. השתמש במשאבת פרפוזיה (קצב מוגדר ל- 500 μL/min) כדי להחליף ברצף פתרונות התניה בתא פרפוזיה באופן הבא:
    1. זרימה של 50 μL של 1% BSA כדי להכין את תא ההדמיה. הסר את המאגר העודף ממאגר התאמת נעילת Luer.
    2. זרימה 50 μL של 0.005 מ"ג /מ"ל סטרפטווידין. דגירה למשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. הסר חיץ עודף מהמאגר.
    3. זרימה של 50 μL של 1% BSA לחסימת קשירה לא ספציפית. דגירה למשך 10-30 שניות. הסר חיץ עודף מהמאגר.
    4. זרימה 50 μL של חיץ TIRF חם (37 °C) 1x (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM גלוקוז, 0.25% (v/v) מתילצלולוז (4,000 cp)).
      הערה: אין להסיר את המאגר העודף מהמאגר. זה מונע מהתא להתייבש, מה שעלול להכניס בועות אוויר למערכת.
    5. אופציונלי: זרימה של 50 μL של זרעי מיקרוטובולים מיוצבים של29 ו-50% ביוטינילציה המדוללים ב-1x buffer TIRF.
      הערה: הדילול הנכון חייב להיקבע באופן אמפירי ולהכיל השתנות מאצווה לאצווה. פרוטוקולים מתוך27,29 מומלצים כנקודות התחלה. דילול המניב 10-30 זרעים לכל שדה ראייה עובד היטב עם הגדרה זו.

5. הכנת מיקרוסקופ

הערה: תגובות ביוכימיות המכילות חוטי אקטין דינמיים ומיקרוטובולים מוצגות/מבוצעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת הפוכה (TIRF) המצויד בלייזרים במצב מוצק של 120-150 מ"וואט, מטרת TIRF טבילת שמן מתוקנת בטמפרטורה של 63x, ומצלמת EMCCD. חלבונים בדוגמה זו מוצגים באורכי הגל הבאים: 488 ננומטר (מיקרוטובולים) ו-647 ננומטר (אקטין).

  1. הגדר את מכשיר החימום לבמה/מטרה כדי לשמור על 35-37 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות לפני הדמיית התגובה הביוכימית הראשונה.
  2. הגדר את הפרמטרים של רכישת התמונה באופן הבא:
    1. הגדר את מרווח הרכישה לכל 5 שניות למשך 15-20 דקות.
    2. הגדר חשיפות לייזר של 488 ו- 647 ל- 50-100 אלפיות השנייה בהספק של 5%-10%. הגדר זווית TIRF מתאימה למיקרוסקופ.
      הערה: ללא קשר להתקנת מיקרוסקופ, הדרך הפשוטה ביותר להגדיר את עוצמת הלייזר, החשיפה וזווית ה-TIRF היא לבצע התאמות בתמונות של כל אחד מהפולימרים בלבד (ראו 5.2.2.1 ו-5.2.2.2.2, להלן). מומלץ מאוד למשתמשים להשתמש בהספק הלייזר הנמוך ביותר ובהגדרות החשיפה שעדיין מאפשרות זיהוי.
      1. התאם את תגובת הפילמור (איור 1C) כדי ליזום מכלול חוטי אקטין ולרכוש תמונות במהירות של 647 ננומטר. בצע התאמות מתאימות.
      2. התאימו את תגובת הפילמור בזלוף מותנה שני היטב כדי להתחיל מכלול מיקרוטובולים (איור 1C) והדמיינו ב-488 ננומטר. בצע התאמות מתאימות.

6. הכנת תערובות תגובה חלבונית

  1. הכן תמיסת מלאי של טובולין עם תווית פלואורסצנטית.
    1. קבע את הריכוז של טובולין ללא תווית תוצרת בית באמצעות ספקטרופוטומטריה ב- Abs280, כדלקמן:
      1. ספקטרופוטומטר ריק עם 1xBRB80 חסר GTP.
      2. חשב את ריכוז טובולין באמצעות מקדם ההכחדה שנקבע של 115,000 M-1 cm-1 והנוסחה הבאה:
        figure-protocol-1
    2. 488-טובולין ל-10 מיקרומטר (1 מ"ג/מ"ל; 100 מ"ל; 100% תווית) עם תווית של 20 מיקרול' של 1x BRB80 חסר GTP.
    3. להפשיר 7.2 μL aliquot של 100 μM ללא תווית טובולין ממוחזר29 על קרח.
      הערה: טובולין ממוחזר הוא קריטי להרכבה מוצלחת של מיקרוטובולים במבחנה מכיוון שהוא מסיר דימרים חסרי יכולת פולימריזציה הנוצרים במלאי חלבון קפוא29,30.
    4. שלבו 3 μL של 10 μM 488-tubulin עם 7.2 μL aliquot של 100 μM ללא תווית tubulin, לא יותר מ 15 דקות לפני השימוש.
  2. הכן את תמיסת המלאי של אקטין המסומן באופן פלואורסצנטי.
    1. עבור חלבונים תוצרת בית, קבע את הריכוז ואת תווית האחוזים של אקטין באמצעות ספקטרופוטומטריה Abs290 ו- Abs650, כדלקמן:
      1. ספקטרופוטומטר ריק עם מאגר G.
      2. חשב את הריכוז של אקטין ללא תווית באמצעות מקדם ההכחדה שנקבע של 25,974 M-1 cm-1 והנוסחה הבאה:
        figure-protocol-2
      3. חישוב ריכוז הליזין המסומן Alexa-647-actin באמצעות מקדם ההכחדה של אקטין ללא תווית, מקדם תיקון הפלואור של 0.03, והנוסחה הבאה:
        [Alexa-647 actin], μM = (Abs290 - figure-protocol-3
      4. חשב את תווית האחוזים של Alexa-647-actin באמצעות ε שנקבע עבור Alexa-647 מתוך 239,000 M-1 cm-1, כדלקמן:
        % תווית של אלקסה-647-אקטין = (Abs290 - (figure-protocol-4
    2. להפשיר 2 μL aliquot אחד של 3 μM 100% מסומן ביוטין-אקטין (מסומן על שאריות ליזין). דילול פי 10 על ידי הוספת 18 μL של G-buffer.
    3. שלבו 3 μL של אקטין ביוטינילי מדולל, נפחים מתאימים של אקטין ללא תווית ומסומן (לעיל) כך שהתערובת הסופית תהיה 12.5 μM סה"כ אקטין עם תווית פלואורסצנטית של 10%-30%.
      הערה: יותר מ-30% אחוז מונומרים של אקטין פלואורסצנטי (סופי) יכולים לפגוע ברזולוציית ההדמיה מכיוון שקשה להבחין בחוטים מהרקע.
  3. הכינו תערובות תגובות (איור 1C).
    1. הכן את תערובת השלד של ציטוסקלטון (Tube A) על ידי שילוב של 2 μL של ציר תערובת אקטין של 12.5 μM (6.2.3) עם תערובת ציר טובולין (6.1.4), לא יותר מ -15 דקות לפני ההדמיה. יש לאחסן על קרח עד לשימוש.
    2. הכינו את תערובת תגובת החלבון (Tube B) על ידי שילוב של כל המרכיבים והחלבונים הניסיוניים האחרים, כולל: 2x בופר TIRF, אנטי אקונומיקה, נוקלאוטידים, מאגרים וחלבונים נלווים. דוגמה לכך מוצגת באיור 1C.
      הערה: הדילול הסופי גורם למאגר TIRF של 1x המכיל ATP, GTP ועוצמה יונית בטווח הפיזיולוגי המשוער.
  4. דגירה צינור A וצינור B בנפרד ב 37 °C (84 °F) עבור 30-60 שניות. כדי ליזום תגובה, ערבבו והוסיפו את התוכן של Tube B לצינור A (להלן).

7. דימוי אקטין ודינמיקה של מיקרוטובולים

  1. מצב זלוף היטב (איור 1B; שלב 4, לעיל).
  2. הפעילו את הרכבת האקטין והמיקרוטובולים בו-זמנית על-ידי הוספת התוכן של Tube B (תערובת תגובה) לצינור A (תערובת שלד ציטוסקלטון) (איור 1C).
  3. זרימה של 50 μL של תגובה המכילה 1x BUFFER TIRF בתוספת טובולין חופשי 15 μM, 1 mM GTP, ו 0.5 μM אקטין מונומרים ונפחים מתאימים של בקרות מאגר.
  4. הקלט סרט בהילוך מהיר באמצעות תוכנת מיקרוסקופ כדי לרכוש כל 5 שניות למשך 15-20 דקות.
    הערה: התחלת הדינמיקה של אקטין ומיקרוטובול מתרחשת תוך 2-5 דקות (איור 2). עיכובים ארוכים יותר מצביעים על בעיות בבקרת טמפרטורה או בבעיות הקשורות לריכוז של חלבונים בתמהיל התגובות.
  5. התנו באר פרפוזיה חדשה (שלב 4) והחליפו את נפח המאגר בחלבונים רגולטוריים בעלי עניין (כלומר, טאו) ובקרות מאגר (איור 1C). רכוש כמתואר בשלב 7 (לעיל) כדי להעריך חלבונים רגולטוריים עבור פונקציות אקטין-מיקרוטובול מתפתחות.

8. לעבד ולנתח תמונות באמצעות תוכנת FIJI31

  1. פתח סרטי TIRF שמורים והצג כקומפוזיט.
  2. נתחו את הדינמיקה של המיקרו-טובולים (איור 3A), באופן הבא:
    1. צור הקרנת Z מרבית מבוססת זמן מתפריט ערימות התמונות.
    2. סנכרן את חלון הקרנת Z עם סרט TIRF המקורי מתפריט כלי ניתוח>> סינכרון Windows .
    3. צייר קו באמצעות כלי הקו הישר לאורך מיקרוטובול מעניין בתמונה המוקרנת בזמן המוקרן.
      1. פתח את מנהל אזור העניין (ROI) מתפריט הניתוח (ניתוח> כלים> מנהל ההחזר על ההשקעה).
      2. שמור מיקומי מיקרוטובולים בודדים על ידי לחיצה על "t". חזור על הפעולה עבור כל המיקרוטובולים המעניינים.
    4. להתוות קיומוגרפים של שורות נבחרות באמצעות "/" או להריץ את המאקרו מרובה קימו שיוצר וידאו וקימוגרף עבור כל מיקרוטובול במנהל ההחזר על ההשקעה31.
      1. הוסף סרגלי קנה מידה של אורך (μm) וזמן (min) לקימוגרפים מתפריט סרגלי קנה מידה של כלי ניתוח>> .
    5. מדדו את מהירויות הגדילה של המיקרוטובולים ממדרונות קימוגרף (איור 3A, 1-2; שיפוע הקווים השחורים).
    6. ספירת אירועי מיקרוטובולים דינמיים (קטסטרופה או צמיחה מחדש) מהקימוגרף שנוצר או באמצעות פקודות מאקרו של ניתוח זמין 5,8,18,25. קווים מנוקדים אדומים באיור 3A, 1-2 מייצגים אירועי קטסטרופה/פירוק מהיר.
  3. נתחו את הדינמיקה של אקטין (איור 3B), באופן הבא:
    1. מדידת נוקלאציה של אקטין, כדלקמן:
      1. ספירת מספר חוטי האקטין הנמצאים בשדה הראייה 100 שניות לאחר תחילת התגובה והבעתם על ידי האזור (חוטים לכל μm2).
      2. רשום ושמור נתונים במנהל ההחזר על ההשקעה, כמו בשלב 8.2.3.1, לעיל.
    2. מדוד את שיעורי התארכות האקטין (איור 3B), באופן הבא:
      1. ציירו קו לאורך חוט אקטין בעל עניין באמצעות הכלי מקו מקוטע.
      2. הוסף שורה למנהל החזר ההשקעה כמו בשלב 8.2.3.1, לעיל.
      3. חזור על הפעולה לאחר השורה (הוספת כל מדידה למנהל ההחזר על ההשקעה) עבור ארבעה מסגרות סרט לפחות.
        הערה: מומלץ למדוד שבע עד שמונה מסגרות רצופות, אולם תנאים מסוימים מאטים את הפילמור של אקטין מתחת לגבול הניתן לזיהוי שניתן לפתור על ידי הגדרות אובייקטיביות/מיקרוסקופיות. במקרה כזה, ניתן לבצע מדידות במרווחי זמן קבועים על פני מסגרות לא רציפות (למשל, כל חמש מסגרות).
      4. תרשים ערכי אורך שנמדדו לאורך הזמן שחלף. השיפוע של הקו שנוצר הוא קצב התארכות האקטין במיקרונים/שניות.
      5. העבר את השיעורים המחושבים הסופיים כתת-יחידות s-1 μM-1 באמצעות מקדם תיקון של 370 תת-יחידות כדי להסביר את מספר המונומרים של אקטין במיקרון של נימה32.
  4. בצע ניתוח מתאם עבור אזורים של שיוך אקטין-מיקרוטובול מקבילי (איור 3C), כדלקמן:
    1. צייר קו לאורך מיקרוטובול בעל עניין בנקודת זמן מסוימת (כלומר, 300 שניות לאחר התחלת התגובה), באמצעות כלי הקו הישר.
      1. הוסף שורה למנהל החזר ההשקעה כמו בשלב 8.2.3.1, לעיל.
    2. התווה את עוצמת הפלואורסצנציה לאורך הקו בכל ערוץ.
      1. בחר כל ערוץ עם מחוון התמונה והתווה את העוצמות לאורך הקו באמצעות "פקודה k".
      2. שמור או ייצא ערכים על-ידי לחיצה על הלחצן "רשימה" בחלון הפלט.
    3. צימוד אקטין-מיקרוטובול אקספרסי של אירועים כיחס (אקטין חופף למיקרוטובולים) מאירועים בודדים או כספירה של אירועים בשדה ראייה נתון בנקודת זמן עקבית (איור 3C).
    4. חלופה: השתמש בתוכנה כדי לקבוע את אחוז החפיפה של שני הערוצים 5,12.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם התנאים שתוארו לעיל (איור 1), פולימרים של אקטין ומיקרוטובול אמורים להיות גלויים (ודינמיים) תוך 2 דקות מרכישת התמונה (איור 2). כמו בכל פרוטוקול מבוסס ביוכימיה, ייתכן שתידרש אופטימיזציה עבור חלבונים רגולטוריים שונים או קבוצות של חלבון. מסיבות אלה, זווית TIRF וחשיפות התמונה מוגדרות תחילה עם תגובות המכילות כל פולימר בנפרד. זה מאשר כי חלבונים מאוחסנים הם פונקציונליים ומספיק חלבון מסומן נמצא לזיהוי. אמנם לא תמיד הכרחי (ולא מבוצע כאן), אך ניתן להשתמש לאחר עיבוד של סרטים (כלומר, חיסור רקע, ממוצע או טרנספורמציות פורייה) כדי לשפר את ניגודיות התמונה (במיוחד של מיקרוטובולים)5,25,33. ההדמיה הישירה של חוטי אקטין יחידים ומיקרוטובולים הניתנים על ידי מבחן זה תומכת בקביעה כמותית של מספר מדדים דינמיים עבור רכיב ציטוסקלטון לבדו או יחדיו, כולל פרמטרי פילמור (כלומר, קצב נוקלאציה או התארכות), פרמטרים של פירוק (כלומר, שיעורי התכווצות או אירועי קטסטרופה), ופחם/חפיפה של פולימרים (איור 3 ). יתר על כן, אמצעים אלה יכולים לשמש כנקודת מוצא לפענוח הקשירה או ההשפעה של ליגנדות רגולטוריות כמו טאו (איור 3). מדידות רבות של חוטי אקטין בודדים או מיקרוטובולים יכולות להיעשות מסרט TIRF אחד. עם זאת, בשל וריאציות בציפוי כיסוי, צנרת וגורמים אחרים, מדידות מהימנות צריכות לכלול גם תגובות/סרטים משוכפלים טכניים מרובים.

היבטים רבים של דינמיקת המיקרוטובולים יכולים להיקבע מקיומוגרפים לדוגמה, כולל קצב התארכות המיקרוטובולים, כמו גם תדירות אירועי הקטסטרופה וההצלה (איור 3A). השימוש בקימוגרפים למדידת דינמיקת אקטין במערכת זו אינו פשוט כל כך מכיוון שחוטים של אקטין מפותלים יותר ממיקרוטובולים. כתוצאה מכך, הפרמטרים של דינמיקת חוט אקטין נמדדים ביד, וזה גוזל זמן ועבודה אינטנסיבית. ספירות נוקלאציה נמדדות כמספר חוטי האקטין הקיימים בנקודת זמן עקבית עבור כל התנאים. ספירות אלה משתנות מאוד על פני שדות הדמיה של TIRF, אך ניתן להשתמש בהן עם שכפולים רבים או כדי להשלים תצפיות ממבחני פילמור אחרים. ספירת גרעין עשויה לשמש גם למיקרו-טובולים אם תנאי הניסוי חסרים זרעי מיקרוטובולים מיוצבים. קצבי התארכות נימה של אקטין נמדדים כאורך החוט לאורך זמן מארבעה פריימים קולנועיים לפחות. ערכי קצב מועברים לכל אקטין מיקרומולרי עם מקדם תיקון של 370 תת-יחידות כדי להסביר את מספר המונומרים של אקטין במיקרון של נימה (איור 3B)32. מדידות להגדרת ההתנהגויות המתואמות בין אקטין למיקרוטובולים מוגדרות פחות טוב. עם זאת, אנליזות מתאמיות יושמו כדי למדוד את צירוף המקרים של שני הפולימרים, כולל סריקות קו (איור 3C) או תוכנת חפיפה 5,11,34.

זמינות נתונים:
כל מערכי הנתונים הקשורים לעבודה זו הופקדו בזנודו והם זמינים עם בקשה סבירה בכתובת: 10.5281/zenodo.6368327.

figure-results-1
איור 1. סכמות ניסיוניות: הרכבת תא זרימה לרכישת תמונה. (א) מכלול תא הדמיה. מלמעלה למטה: תאי ההדמיה של IBIDI מודבקים לאורך בארות פרפוזיה (מסומנים בחץ); השכבה השנייה (הלבנה) של גיבוי סרט הדבקה (שנשארה בתמונה המוצגת למשתמשים בעלי אוריינטציה טובה יותר) מוסרת ואפוקסי מוחל בקצה תא ההזלפה (חץ). הערה: כדי לכוון את המשתמשים ביתר קלות היכן למקם את האפוקסי, הגב הלבן הושאר בתמונה זו. הכיסוי המנוקה והמצופה מחובר לתא ההדמיה כאשר צד הציפוי פונה אל פנים באר הזלוף. (B) תרשים זרימה הממחיש את השלבים להתאמת תאי הדמיה עבור קשרים ביוטין-סטרפטווידין. (C) דוגמאות לתגובות המשמשות לרכישת סרטי TIRF של מיקרוטובולים דינמיים וחוטים אקטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2. רצפי תמונה של חוטי אקטין גדלים ומיקרוטובולים בהיעדר או נוכחות של טאו. מונטאז' תמונה בהילוך מהיר ממבחני TIRF המכיל 0.5 μM אקטין (10% Alexa-647-actin ו-0.09% ביוטין-אקטין מסומן) ו-15 μM ללא טובולין (4% HiLyte-488 מסומן) בהיעדר (A) או נוכחות (B) של 250 ננומטר טאו. הזמן שחלף מתחילת התגובה (ערבוב צינור A וצינור B) מוצג. סרגלי קנה מידה, 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3. מדידות לדוגמה של מיקרוטובולים ודינמיקת חוט אקטין. (A) הקרנת זמן ממוצעת של תעלת טובולין ממחישה ביעילות את אורכי המיקרוטובולים הכוללים עבור סריקות הקו המשמשות ליצירת תרשימי קימוגרף. קווים מנוקדים שחורים מתאימים לשני הקימוגרפים לדוגמה של מיקרוטובולים דינמיים המוצגים מימין. גדילה (קווים שחורים מוצקים) ופאזות פירוק (קווים ורודים מנוקדים; שניים מסומנים בחצים ורודים) של מיקרוטובולים מוצגים על כל קיומוגרף. סרגל קנה מידה של זמן, 3 דקות. סרגל קנה מידה אורך, 10 מיקרומטר. התגובה מכילה 0.5 μM אקטין (10% 647-תווית) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte). רק ערוץ טובולין מוצג. (B) שני מונטאז'ים לדוגמה של תמונות בהילוך מהיר המתארים חוטים חד-אקטיןים המפולימרים באופן פעיל. שיעורי התארכות מחושבים כשיפוע של חלקות באורך חוטי אקטין לאורך זמן לכל אקטין מיקרומולרי אקטין. לפיכך, יש להחיל מקדם תיקון של שניים על תגובות אקטין של 0.5 μM לצורך השוואה לשיעורים הנקבעים בדרך כלל בריכוז אקטין של 1 μM. דוגמאות מחמישה חוטים מוצגות מימין. מוטות קנה מידה, 10 מיקרומטר. התגובה מכילה 0.5 μM אקטין (10% 647-תווית) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte). רק ערוץ האקטין מוצג. (C) תמונות TIRF של מיקרוטובולים דינמיים (MT) (ירוק) וחוטים אקטין (סגול) פולימריזציה בהיעדר (שמאל) או נוכחות של 250 ננומטר טאו (באמצע). קווים וחצים מנוקדים כחולים מסמנים היכן צויר קו עבור החלקות של סריקת הקו המתאימות לכל תנאי (מתחת לכל תמונה). ניתן להבקיע חפיפה בין מיקרוטובולים לאזורי אקטין (המוצגים כשחורים) בנקודת זמן מוגדרת לכל אזור (מימין). מוטות קנה מידה, 25 מיקרומטר. התגובות מכילות אקטין 0.5 μM (10% 647-label) ו-15 μM ללא טובולין (4% תווית 488-HiLyte) עם או בלי 250 ננומטר טאו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית (TIRF) כדי לדמיין חלבונים מטוהרים היה גישה פורה ומשכנעת לנתח מנגנונים ייחודיים של ויסות ציטוסקטלי 5,23,24,25,26,27,35. בהשוואה למבחנים ביוכימיים מסורתיים, תגובות TIRF דורשות נפחים קטנים מאוד (50-100 μL), ומדידות כמותיות של דינמיקה ציטוסקטלית יכולות להילקח מבדיקה בודדת. רוב המחקרים על דינמיקה של שלד ציטוסקטלי מתמקדים במערכת פולימרית בודדת (כלומר, חוטי אקטין או מיקרוטובולים), ולכן מדידות מפורטות של ההצלבה או ההתנהגויות המתפתחות בין חוטי אקטין למיקרוטובולים הנראים בדרך כלל בתאים נותרו חמקמקות וקשות לשחזור במבחנה. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרוסקופיה TIRF בעלת נימה אחת המאפשרת הדמיה ישירה של אקטין דינמי ופולימרים מיקרוטובולים באותה תגובה ביוכימית. לפיכך, שיטה זו חורגת מעבר למבחנים מסורתיים המסכמים את ההתנהגות הדינמית של חוטי אקטין או מיקרוטובולים בלבד. טכניקה זו בוצעה גם עם טאו כדוגמה לאופן שבו מספר תכונות דינמיות משתנות בנוכחות גורם צימוד ציטוסקטון. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם חלבונים נוספים הידועים או החשודים כמתאמים אקטין או דינמיקה של מיקרוטובולים, כולל (אך לא רק) MACF, GAS, פורמינים ועוד. לבסוף, ניתן להשתמש בניתוחים לדוגמה כמדריך לכימות נתונים שנרכשו באמצעות פרוטוקול זה.

"לראות זה להאמין" היא סיבה משכנעת לבצע בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה. עם זאת, נדרשת זהירות בביצוע ובפענוח של ניסויי מיקרוסקופיה של TIRF. אחד האתגרים הגדולים של מבחני הרכבה משותפת של ציטוסקטליים הוא שתנאי הדמיה נפוצים רבים אינם תואמים כל פולימר. למיקרוטובולים ולאקטין יש בדרך כלל דרישות שונות של מאגר, טמפרטורה, מלח, נוקלאוטיד וריכוז לפולימריזציה. אקטין, טובולין, חלבונים רגולטוריים בעלי עניין, והמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה רגישים למחזורי הקפאה-הפשרה. לכן, טיפול זהיר בחלבונים ובמאגרים נחוץ כדי לבצע בהצלחה פרוטוקול זה. כדי להפיג רבים מהחששות הללו, מומלץ מאוד להשתמש בטובולין ממוחזר טרי (קפוא למשך <6 שבועות), ולפנות מראש אקטינים קפואים/מוחזרים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. שיקולים אלה חלים גם על שלל החלבונים הרגולטוריים שיש להעריך בהליך זה, אשר עשויים להיות רגישים למחזורי הפשרה בהקפאה או לריכוז מלחי החיץ 5,11,36.

למרבה הצער, לא קיים מאגר אחד שמתאים לכולם ללא פשרות ניסיוניות. כדי להתאים נפח גדול יותר לחלבונים בעלי ריכוז נמוך יותר, ATP ו-GTP עשויים להיכלל בתמיסת המאגר 2x TIRF (איור 1C). עם זאת, מכיוון שהנוקלאוטידים האלה רגישים מאוד למחזורי הפשרה בהקפאה, זה לא מומלץ. תרכובות טיהור החמצן המשמשות כאן (כלומר, קטלאז וגלוקוז-אוקסידאז) נחוצות כדי להמחיש חלבונים לפרקי זמן ארוכים (דקות עד שעות), אך ידוע שהן מגבילות פילמור מיקרוטובולים בריכוזים גבוהים5. בהקשר לשיקולי מאגר אלה, מגבלה של פרוטוקול זה היא שחלק מהחלבונים הרגולטוריים הקשורים למיקרוטובולים קנוניים עשויים לדרוש פחות או יותר מלח כדי לשחזר פונקציות שנמצאות בתאים או במבחנים באמצעות מיקרוטובולים בלבד (ללא אקטין). שינוי האופי או הריכוז של המלח כדי לתת מענה לחששות אלה ישפיע ככל הנראה על שיעורי פילמור נימה של אקטין ו/או פרמטרים של דינמיקה של מיקרוטובולים. מדידות של פרמטרים תיאוריים מרובים (מינימלי, נוקלאציה, קצב התארכות ויציבות) (איור 3) נדרשות כדי לאשר את הצלחת הפרוטוקול או לתעד במפורש את ההשפעות של מאגרים ספציפיים או חלבונים רגולטוריים. לדוגמה, יותר מדי פולימריזציה של חוטי אקטין יכולה לטשטש אירועי צימוד אקטין-מיקרוטובול תוך שניות. כתוצאה מכך, כוונון עדין של תנאי הניסוי על ידי הפחתת הריכוז הכולל של אקטין או הכללת חלבונים נוספים לדיכוי גרעין אקטין (כלומר, פרופילין) יאריך את התקופה הכוללת שבה ניתן לראות בבירור פעילויות אקטין-מיקרוטובול מתואמות. פקדים המתייחסים לתנאים מוקדמים אלה, ושכפולים טכניים (מעבר לשדות תצוגה מרובים), הם קריטיים עבור משתמשים כדי ליצור תוצאות מהימנות וניתנות לשחזור.

מחקרים מבוססי תאים מספקים הזדמנות מוגבלת לבחון יחסי חלבון-חלבון ישירים או את פעולתם של קומפלקסים רגולטוריים. לעומת זאת, חלק מהמנגנונים שנלקחו ממבחני מבחנה לא תמיד משקפים את ההתנהגויות המדויקות של חלבונים הנראים בתאים. ניתן לטפל בדילמה ביוכימאית קלאסית זו ביישומים עתידיים של טכניקה זו עם שינויים ספציפיים. לדוגמה, הוספת חלבוני צימוד פונקציונליים בעלי תווית פלואורסצנטית מרחיבה את השיטה הזו ממחקרים בעלי נימה בודדת למחקרים של מולקולה אחת. ניתן לשנות עוד יותר את הבדיקות כדי להשתמש בתמציות תאים שעשויות להוסיף את גורמי המפתח הלא ידועים "החסרים" הנדרשים כדי לשחזר תופעות דמויות תאים. לדוגמה, לבדיקות מבוססות TIRF המשתמשות בתמציות שמרים או קסנופוס יש טבעות אקטומיוזין מתכווצות37, צירים מיטוטיים 26,38, רכיבים של מכלול אקטין או מיקרוטובול39,40, ואפילו דינמיקה בסנטרוזום ובקינטוכורים 36,41,42,43 . יתר על כן, מערכות כאלה עשויות לסלול את הדרך למערכות תאים מלאכותיות שיש להן ליפידים או גורמי איתות המציגים 44,45,46.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אני אסיר תודה למארק רידילה (תיקון ביוטכנולוגיה) ובריאן הארר (SUNY Upstate) על הערות מועילות על פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (GM133485).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1% BSA (w/v)Fisher ScientificBP1600-100למטרה זו (חסימת תאי TIRF), BSA מושעה מחדש ב-ddH20 ומסונן דרך 0.22 µ מסנן M.
1 ופעמים; BRB80תוצרת בית80 מ"מ צנרת, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ EGTA, pH 6.8 עם KOH
10 מ"ג/מ"ל (1000 U) גלוקוז אוקסידאזסיגמא אולדריץ' בע"מ, סנט לואיס, MOG2133-50KUבשילוב עם קטלאז, aliquot ולאחסן ב-80 oC עד לשימוש
100 ומיקרו; M tubulinCytoskeleton Inc, Denver, COT240יש למחזר טובולינים תוצרת בית לפני השימוש כדי להסיר טובולין לא כשיר לפילמור (Hyman et al. (1992)29; לי ומור (2020)30). טובולינים הזמינים מסחרית הם לרוב מדוללים מדי למיחזור, אך מתפקדים היטב אם הם מושעים מחדש בהתאם ליצרן הוראות ואושר מראש באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (278,000 ופעמים; גרם) למשך 60 דקות, לפני השימוש.
100 מ"מ ATPGold Biotechnology Inc, Olivette, MOA-081מושעה ב-ddH20 (pH 7.5) ומעוקר במסנן.
100 מ"מ GTPFisher ScientificAC226250010הושעה ב-1& פעמים; BRB80 (pH 6.8) ומסנן מעוקר.
לייזרים במצב מוצק 120-150 mWLeica Microsystems11889151; 11889148
2 מ"ג/מ"ל קטלאזסיגמא אולדריץ' בע"מ, סנט לואיס, MOC40-100בשילוב עם גלוקוז אוקסידאז, יש לאחסן ב-80 oC עד לשימוש
פעמיים; מאגר TIRFתוצרת ביתפעמיים; BRB80, 100 מ"מ KCl, 20 מ"מ DTT, 80 מ"מ גלוקוז, 0.5% (v/v) מתיל צלולוז (4,000 cp); הערה: 1 ומיקרו; L של 0.1M GTP ו-1 ומיקרו; L של 0.1M ATP נוסף בנפרד לתגובות TIRF כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
24 & times; 60 מ"מ, #1.5 כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA22-266882יש לשטוף את הכיסוי בהרחבה לפני השימוש (Smith et al. (2014)22)
37 oC בלוק
37 oC אמבט
5 מ"ג/מ"ל סטרפטווידין (מלאי 600x)Avantor, פילדלפיה, פנסילבניהRLS000-01מושעה ב-Tris-HCl (pH 8.8); לדלל את האליקוט ל-1&; במאגר HEK ביום השימוש
5 דקות שרף אפוקסי ומקשיחLoctite, Rocky Hill, CT1365736שרף ומקשיח משולבים עשויים להימשך עד 30 דקות לריפוי.
50% זרעי מיקרו-צינורות ביוטיניליים-GpCppCytoskeleton Inc; T333Pתוצרת בית (אופציונלי) GppCpp או טקסול יכולים לתווך בצורה יעילה יותר פילמור מיקרו-צינורות. טקסול ו-GppCpp מייצבים מיקרו-צינורות בדרכים שונות שיכולות להשפיע על מבנה הסריג של המיקרו-צינוריות ועל יכולתם של חלבונים רגולטוריים מסוימים להיקשר לחלק המיוצב של המיקרו-צינורית. שיטה לייצור סוגים שונים של זרעי מיקרו-צינורות מתוארת ב-Hyman et al. (1992).
70 oC אינקובטור
אקטין מיקס סטוקתוצרת בית; פרוטוקולזה A 12.5 ומיקרו; תערובת אקטין M מורכבת מאקטין מסומן (פלואורסצנטי וביוטיניל) וללא תווית עבור עד שש תגובות. 2 ומיקרו; L של מלאי משמש בתגובת ה-TIRF הסופית. הריכוז הסופי של אקטין המשמש בכל תגובה הוא 0.5 ומיקרו; M (10% Alexa-647; 0.09% תווית ביוטין).
בקרות חיץ מתאימותתוצרת ביתשל חוצצים מכל החלבונים המוערכים
ביוטין-PEG-silane (MW 3,400)Laysan Bio Incביוטין-PEG-SIL-3400מופץ ל-2-5 מ"ג אליקוטים, ממולא בחנקן, נסגר בפרפרפילם, ומאוחסן ב-20 oC עם חומר ייבוש עד לשימוש
ב-Biotinylated actinCytoskeleton Inc; AB07מיוצר על ידי תיוג על שאריות ליזין ולכן מניחים שהוא מסומן לפחות ב-100%, אך משתנה עם אצווה/תכשירים שונים. יש לקבוע באופן אמפירי ריכוזי אקטין ביוטיניליים אופטימליים לשימושים מסוימים/עיצובים ניסיוניים. ריכוזים גבוהים יותר מאפשרים מעקב יעיל יותר, אך עלולים לעכב פילמור או אינטראקציות עם חלבונים רגולטוריים. כאן אחוז קטן (0.09% או 900 pM) אקטין ביוטיניל קיים בתגובת ה-TIRF הסופית.
סבון כליםשחר, פרוקטר אנד גמבל, סינסינטי, אוהיומסיבות לא ידועות, הגרסה הכחולה מנקה את הכיסויים בצורה יעילה יותר מצבעים זמינים אחרים.
קרח
תוכנת FIJIwww.https://imagej.net/software/fiji/downloadsSchneider et al. (2012)31.
אקטין עם תווית פלואורסצנטיתCytoskeleton Inc; AR05תוצרת בית אקטין תוצרת בית עם תווית פלואורסצנטית מאוחסן במאגר G בתוספת 50% גליצרול ב-20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). אקטין עם תווית פלואורסצנטית עובר דיאליזה כנגד מאגר G ועובר ניקוי מראש באמצעות אולטרה-צנטריפוגה למשך 60 דקות ב-278,000 פעמים; גרם לפני השימוש.
טובולין עם תווית פלואורסצנטיתCytoskeleton IncTL488M, TLA590M, TL670Mמושעה ב-20 ומיקרו; L 1 ופעמים; BRB80 (10 ומיקרו; M ריכוז סופי) וסולק מראש באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (278,000 & פעמים; גרם) למשך 60 דקות, לפני השימוש.
מאגר Gתוצרת בית3 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 מ"מ CaCl2, 0.5 מ"מ DTT, 0.2 מ"מ ATP
HEK מאגרתוצרת בית20 מ"מ HEPES (pH 7.5), 1 מ"מ EDTA (pH 8.0), 50 מ"מ KCl
דלי
קרח קרח
תאי הדמיהIBIDI, Fitchburg, WI80666הזמנת תאים ללא תחתית לשימוש בציפויי כיסוי שונים
מצלמת iXon Life 897 EMCCDאנדור, בלפסט, צפון אירלנד8114137
תוכנת מיקרוסקופ LASX פרימיוםLeica Microsystems11640611
מתיל צלולוז (4,000 cp)Sigma Aldrich IncM0512
מצויד במודול TIRFLeica Microsystems, Wetzlar, גרמניה
mPEG-silane (MW 2,000)Laysan Bio Inc, Arab, ALmPEG-SIL-2000מחולק ל-10-15 מ"ג מינואות, ממולא בחנקן, סגור בפרפילם, ומאוחסן ב-20 oC עם חומר ייבוש עד לשימוש
תנור חימום אובייקטיבי ומחומם tagהכנסמעבדות OKO, Pozzioli, איטליה8113569הגדר את בקרות הטמפרטורה ל-35-37 oC. השתמש בהצעות היצרן לכיול מדויק.
משאבת זלוףמכשיר הרווארד, הוליסטון, MA704504ניתן להחליף מזרק וצינורות.
צלחת פטרי, 100 x 15 מ"מGenesee Scientific, סן דייגו, קליפורניה32-107
מיכל דואר שקופיות פלסטיקFisher ScientificHS15986
SA-S-1L-SecureSeal בעובי 0.12 מ"מGrace Biolabs, Bend, OR620001מומלץ בחום סרט דו צדדי במידות ייצור מדויקות.
מיכל קלקר קטןAbcam, קיימברידג', בריטניהבשימוש חוזר ממשלוח
סירת משקל קטנהפישר סיינטיפיק02-202-100
ספקטרופוטומטר
TauCytoskeleton IncTA01שלושה איזופורמים של טאו קיימים בתכשיר הזמין מסחרית של טאו. הריכוז בפרוטוקול זה נקבע מרצועת המשקל המולקולרית הגבוהה ביותר (14.3 µ M, כאשר הוא מושעה לפי היצרן' המלצות עם 50 ומיקרו; L של <תת>ddH20).
הטמפרטורה תוקנה 63 פעמים; תוכנית Apo 1.47 NA טבילת שמן TIRF מטרתLeica Microsystems11506319
מלאי טובוליןתוצרת בית; פרוטוקולמלאי טובולין המורכב מ-7.2 ומיקרו; L ממוחזר 100 ומיקרו; M טובולין ללא תווית ו-3 ומיקרו; L של 10 ומיקרו; M השעתה את הזמינות המסחרית של טובולין עם תווית פלואורסצנטית. מלאי טובולין אחד משמש לכל תגובה ומופשר/מאוחסן על קרח. הריכוז הסופי של טובולין חופשי בכל תגובה הוא 15 ומיקרו; M (4% מסומן). יותר מ-15 ומיקרו; M טובולין יביא למיקרו-צינורות מיוצבים יתר על המידה (לא דינמיים), בעוד שריכוזים מתחת ל-7.5 ומיקרו; טובולין ללא M אינו מתפלמר היטב. נדרשת קביעה קפדנית של ריכוז החלבון והטיפול.
אקטין (כהה) ללא תוויתCytoskeleton Inc; אקטין AKL99נמצאים כמעט תמיד באקטינים זמינים מסחרית (ליופיליזציה) או קפואים ותורמים לשונות במדידות כמותיות (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). אקטין שריר ארנב מאוחסן ב-G-buffer ב-80 oC ומנוקה מראש באמצעות אולטרה-צנטריפוגה למשך 60 דקות ב-278,000 פעמים; גרם לפני השימוש.  מספר פתרונות מלאי אקטין מיוצרים במהלך היום (לא מספיק לשש תגובות בכל פעם  מומלץ בחום).
חוםמים זרעי מיקרו-צינורות מיוצבים שילוב ביוטין-אקטין תוצרת בית יבש בסיס מיקרוסקופ 11889146 זה גרעיני תוצרת בית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
  2. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  3. Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
  4. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
  5. Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
  6. Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
  7. Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004(2016).
  8. Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
  9. Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  10. Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
  11. Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
  12. Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
  13. Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916(2021).
  14. Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
  15. Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
  16. Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
  17. Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
  18. Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119(2022).
  19. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  20. Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
  21. Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
  22. Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
  23. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  24. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
  25. Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520(2019).
  26. King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270(2020).
  27. Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB's tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
  28. Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008(2013).
  29. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  30. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  33. Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794(2019).
  34. Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
  35. Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177(2020).
  36. Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
  37. Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
  38. Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
  39. Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
  40. Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386(2018).
  41. Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
  42. Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
  43. Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
  44. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  45. Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433(2014).
  46. Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
  47. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  48. Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212(2022).
  49. Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Microtubule DynamicsTIRF MicroscopyCytoskeletal CrosstalkIn Vitro ReconstitutionActin Filament PolymerizationMicrotubule AssemblyCytoskeletal Regulatory ProteinsTau ProteinPerfusion ChamberKymograph Analysis

Related Articles