הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64090

⸱

28 ביולי 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שחזור ללא תאים היה כלי מרכזי להבנת הרכבת השלד של הציטוסקלטון, והעבודה בעשור האחרון ביססה גישות לחקר דינמיקת ספטין במערכות מינימליות. מוצגות כאן שלוש שיטות משלימות לצפייה בהרכבת ספטין בהקשרים שונים של ממברנות: דו-תאיים מישוריים, תומכים כדוריים ותמיכות מוטות.

תקציר

רוב התאים יכולים לחוש ולשנות את צורתם כדי לבצע תהליכים בסיסיים בתאים. אצל אאוקריוטים רבים, שלד ספטין הוא מרכיב אינטגרלי בתיאום שינויי צורה כמו ציטוקינסיס, צמיחה מקוטבת והגירה. ספטינים הם חלבונים יוצרי נימה המתאספים ליצירת מבנים מגוונים מסדר גבוה יותר, ובמקרים רבים נמצאים באזורים שונים של קרום הפלזמה, בעיקר באזורים של עקמומיות חיובית בקנה מידה של מיקרון. ניטור התהליך של הרכבת ספטין in vivo מעוכב על ידי המגבלות של מיקרוסקופיית אור בתאים, כמו גם את המורכבות של אינטראקציות עם ממברנות ואלמנטים ציטוסקטליים, מה שמקשה על כימות דינמיקת ספטין במערכות חיות. למרבה המזל, בעשור האחרון חלה התקדמות משמעותית בשחזור שלד ספטין ציטוסקלטון במערכת נטולת תאים כדי לנתח את המנגנונים השולטים בהרכבת ספטין ברזולוציות מרחביות וטמפורליות גבוהות. שלבי הליבה של הרכבת ספטין כוללים אסוציאציה של ספטין הטרוליגומר ודיסוציאציה עם הממברנה, פולימריזציה לחוטים, והיווצרות מבנים מסדר גבוה יותר באמצעות אינטראקציות בין חוטים. כאן אנו מציגים שלוש שיטות לצפייה בהרכבת ספטין בהקשרים שונים: דו-תאיים מישוריים, תומכים כדוריים ותמיכות מוטות. שיטות אלה יכולות לשמש לקביעת הפרמטרים הביופיזיים של ספטינים בשלבים שונים של הרכבה: כאוקטמרים בודדים הקושרים את הממברנה, כחוטים, וכמכלולים של חוטים. אנו משתמשים בפרמטרים אלה בשילוב עם מדידות של דגימת עקמומיות וספיחה מועדפת כדי להבין כיצד חישת העקמומיות פועלת במגוון קני מידה של אורך וזמן.

מבוא

צורות התאים ורבים מהתאים הפנימיים שלהם תלויים בקרום השומנים המקיפים אותם. ממברנות הן מבנים ויסקואלסטיים שניתן לעוות באמצעות אינטראקציות עם חלבונים, מיון שומנים, והפעלת כוחות פנימיים וחיצוניים ליצירת מגוון צורות 1,2,3,4. צורות אלה מתוארות לעתים קרובות במונחים של עקמומיות הממברנה. תאים משתמשים בחבילה מגוונת של חלבונים המסוגלים להרכיב באופן מועדף על עקמומיות ממברנה מסוימת, או "לחוש", כדי להבטיח שליטה מרחבית-טמפורלית מוגדרת על תהליכים, כולל סחר בתאים, ציטוקינאזיס והגירה 5,6. הדינמיקה של מנגנוני התאים בממברנה קשה במיוחד לצפייה בשל הקושי לאזן בין זמן ורזולוציה מרחבית לבין בריאות התא. בעוד שטכניקות סופר-רזולוציה יכולות להציע תצוגה מפורטת של מבנים כאלה, הן דורשות רכישות ארוכות שאינן נוחות ללוחות הזמנים של הרכבה/פירוק עבור רוב המכונות. בנוסף, המורכבות המולקולרית של מכלולים אלה בסביבתם הטבעית ושלל התפקידים שרכיב יחיד יכול למלא הופכים את מערכות השיקום המינימליות לכלי רב ערך לחקר היכולת התפקודית של מולקולות.

פנטומימה מינימלית של ממברנות פותחה כדי לחקור את תכונות הממברנה ואת האינטראקציות בין חלבונים לממברנה מחוץ לתא. פנטומימה של ממברנה משתנה מדו-שכבתי שומנים העומדים בפני עצמם, כגון ליפוזומים או שלפוחיות יונילאמלריות ענקיות, ועד דו-שכבתיים נתמכים של שומנים (SLBs)7,8,9,10. SLBs הם ממברנות ביומימטיות המעוגנות לתמיכה בסיסית, המורכבות בדרך כלל מזכוכית, נציץ או סיליקה11,12. ניתן להשתמש במגוון גיאומטריות, כולל משטחים מישוריים, כדורים, מוטות, ואפילו מצעים גליים או מיקרו-מפולפלים כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים לממברנה על עקמומיות קעורה וקמורה בו זמנית13,14,15,16,17,18 . היווצרות דו-שכבתית מתחילה בספיגת שלפוחית על משטח הידרופילי, ולאחר מכן בהיתוך וקרע ליצירת דו-שכבתי רציף (איור 1)19. דו-שכבתיים נתמכים נוחים במיוחד למיקרוסקופיית אור ואלקטרונים, ומספקים גם זמן טוב יותר וגם רזולוציה מרחבית טובה יותר ממה שניתן להשיג לעתים קרובות בתאים. SLBs מעוקלים במיוחד מספקים אמצעי אטרקטיבי לבדיקת רגישות לעקמומיות חלבונים בהיעדר דפורמציה משמעותית של הממברנה, ומאפשרים להבחין בין חישת עקמומיות לבין אינדוקציה של עקמומיות, שלעתים קרובות בלתי אפשרי להפריד במערכות העומדות בפני עצמן.

ספטינים הם סוג של חלבוני שלד ציטוסקטליים היוצרים נימה הידועים ביכולתם להרכיב על ממברנות מעוקלות חיוביות 6,18,20. במהלך מחזור התא בשמרים, ספטינים מתקבצים לטבעת ועליהם להתארגן מחדש כדי ליצור את שעון החול ואת מבני הטבעת הכפולה הקשורים להופעת ניצנים וציטוקינסיס, בהתאמה21. בעוד שעבודה יפה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים משוכפל פלטינה כדי לצפות בארכיטקטורת ספטין בשלבים משתנים של מחזור התא22, צפייה במכלול ספטין לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיית אור בשמרים נתקלה ברזולוציה מרחבית מוגבלת. עבודה קודמת על ספטינים באמצעות מונו-שכבות ליפידים שהומחשה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) הצליחה לשחזר מספר מבני ספטין מעניינים כגון טבעות, צרורות וגאוזים23. עם זאת, טכניקות EM מוגבלות גם הן ברזולוציה הטמפורלית שלהן, בניגוד למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. על מנת לפתור טוב יותר את הפרמטרים הקינטיים של התהליך הרב-ממדי של הרכבת ספטין, פנינו לפנטומיסטיקות ממברנה נתמכות, שבהן ניתן לשלוט בזהירות בגיאומטריה של הממברנה, בתנאי הדגימה ובשיטת ההדמיה.

הפרוטוקולים המתוארים כאן משתמשים ב-SLBs מישוריים או מעוקלים, בחלבון מטוהר ובשילוב של טכניקות מיקרוסקופיה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית פלואורסצנטית כמותית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) שימשו למדידת קשירת חלבונים בתפזורת על עקמומיות ממברנה שונות, כמו גם למדידת הקינטיקה הקושרת של מולקולות בודדות. יתר על כן, פרוטוקול זה הותאם לשימוש במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) כדי לבחון מבנה-על של חלבונים על עקמומיות ממברנה שונה. בעוד שהמיקוד של פרוטוקולים אלה הוא על שלד ספטין ציטוסקלטון, ניתן לשנות את הפרוטוקולים בקלות כדי לחקור את רגישות העקמומיות של כל חלבון שהקורא מוצא מעניין. בנוסף, אלה העובדים בתחומים כגון אנדוציטוזה או סחר בשלפוחית עשויים למצוא טכניקות אלה שימושיות לבדיקת מכלולים תלויי עקמומיות של קומפלקסים מרובי חלבונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: יצירת דו-שכבתי שומנים נתמכים דורשת הכנת שלפוחיות חד-שכבתיות חד-שכבתיות קטנות (רכבי שטח) חד-ממדיות חד-ממדיות. אנא עיין בפרוטוקול24 שפורסם בעבר על היווצרות רכבי שטח. בקצרה, כל רכבי השטח נוצרים על ידי סוניקציה של גשושית במשך 12 דקות בסך הכל באמפליטודה של 70% באמצעות תקופות סוניקציה של 4 דקות ולאחר מכן תקופות מנוחה של 2 דקות במי קרח. פתרונות SUV חייבים להיות מובהרים היטב ומונודיספרים בגודלם. ניתן למדוד התפלגויות גודל של רכבי שטח, למשל, על ידי פיזור אור דינמי25.

1. דו-שכבתי שומנים מישוריים

  1. ניקוי פלזמה של המגלשות
    הערה: ניקוי פלזמה מסיר מזהמים אורגניים ומגביר את ההידרופיליות של הזכוכית, ומבטיח ספיגת שומנים יעילה. ייתכן שהשלבים הבאים ישתנו או שיהיה צורך לייעל אותם בהתאם למנקה הפלזמה ולכיסויי הזכוכית שבהם נעשה שימוש.
    1. טהרו את מנקה הפלזמה במשך 5 דקות עם חמצן כדי להסיר אוויר מהקווים ומהתא. זאת כדי להבטיח שכאשר מנקה הפלזמה מופעל, יש בעיקר חמצן בקווים ובתא, המספק תכשירים דו-שכבתיים עקביים יותר.
    2. בעת הניקוי, הזרימו גז אינרטי, כגון N2 או Ar, מעל מגלשות הזכוכית של מיקרו-כיסוי כדי להסיר אבק וחלקיקים.
      אופציונלי: ניתן לשטוף מגלשות זכוכית כיסוי על ידי התזת כל צד עם 100% איזופרופנול ואחריו מים. חזור על שטיפת האיזופרופנול-מים 3x ולאחר מכן יבש עם זרם N2 .
    3. סידור מגלשות זכוכית כיסוי יבשות לעריסה קרמית. הניחו את העריסה בחלק האחורי של תא הפלזמה כך שהכיסויים יהיו מקבילים לקצה הארוך של התא (זה שומר אותם במקומם במהלך ניקוי הפלזמה). הפעל את מנקה הפלזמה במשך 15 דקות עם חמצן בהספק מרבי.
  2. הכנת קאמרית
    הערה: השיטה המתוארת כאן משתמשת בתאים תוצרת בית מצינורות PCR מפלסטיק כדי לתמוך בנפחי התגובה, אך גם חומרים אחרים בעלי הידבקות נמוכה, כגון בארות סיליקון, עשויים להתאים.
    1. באמצעות סכין גילוח או מספריים, חתכו את המכסה ממש מתחת לחלק הקפוא של צינור PCR של 0.2 מ"ל (איור 2).
    2. צבעו את שפת צינור ה-PCR בדבק המופעל באמצעות UV, תוך הימנעות מהחלק הפנימי של הצינור. הניחו בעדינות את דבק צינור ה-PCR כלפי מטה במרכזו של כיסוי שנוקה בפלזמה.
      הערה: כדי להימנע מדבק בתוך התא, השתמש בכמות המינימלית של דבק כדי לקבל אטימה, וטפל מיד עם UV מבלי להתנגש או להפריע לתא.
    3. הניחו את התא תחת אור UV באורך גל ארוך למשך 5-7 דקות כדי לרפא את הדבק.
  3. היווצרות דו-שכבתית
    הערה: יש להשתמש ברכבי שטח חד-ממדיים בשלב זה ליצירת דו-שכבתי יעיל. טבלה 1 מספקת מתכונים לכל המאגרים המשמשים בתצורת הדו-שכבתי, כולל מלאי וריכוזי מאגר סופיים.
    1. הוסף 40 μL של מאגר דו-שכבתי שומנים נתמך (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl2; טבלה 1), 10 μL של 5 mM רכבי שטח, ו 1 μL של 100 mM CaCl2 לבאר. יש לנער בעדינות את התאים מצד לצד כדי לשבש את רכבי השטח, ולאחר מכן לדוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      הערה: כדי להגביל את האידוי, דגירה בצלחת פטרי מכוסה עם מגבון לח.
  4. שטיפת שומנים עודפים
    הערה: שלב זה מסיר עודפי רכבי שטח ופועל כשלב החלפת מאגר. חשוב מאוד לא לגרד את הדו-שכבתי עם קצה הפיפטה בזמן הכביסה; אם הכוס נחשפת, ספטינים וחלבונים רבים אחרים ייקשרו באופן בלתי הפיך, מה שיפחית את ריכוז החלבון היעיל.
    1. לאחר הדגירה, שטפו את הדו-שכבתי 6x עם 150 μL של SLBB, תוך צנרת למעלה ולמטה כדי לערבב בכל פעם תוך הימנעות מבועות.
      הערה: הוסף 150 μL ישירות ל- 50 μL של מאגר ורכבי שטח שכבר קיימים עבור סך של 200 μL בתגובה היטב.
    2. כאשר אתם מוכנים להתחיל לדגר עם הספטינים או עם חלבון אחר לפי בחירה, שטפו את הדו-שכבתי 6x עם 150 μL של מאגר תגובה (RXN: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1.4 מ"ג/מ"ל BSA, 0.14% מתילצלולוז, 1 mM BME).
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפוך את מאגר התגובה לרענן והיה זהיר מאוד בעת ערבוב התגובה היטב כדי למנוע בועות.
    3. בשלב הכביסה האחרון, הסר 125 μL של מאגר תגובה, והשאר 75 μL בבאר. הוסף 25 μL של ספטינים מדוללים במאגר אחסון ספטין (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME) בריכוז הרצוי ובתמונה על ידי TIRF מיקרוסקופיה26.
      הערה: בעת הגדרת בדיקה זו בפעם הראשונה או שילוב הרכב שומנים חדש, מומלץ לוודא שהשומנים מתפזרים בחופשיות על פני השטח באמצעות התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנת תמונות (FRAP). בעוד שקצב ההחלמה יהיה שונה עבור הרכבי שומנים שונים ונמוך מטבעו מאשר עבור מערכות העומדות בפני עצמן, השומנים לא צריכים להיות חסרי תנועה.

מאגר דו-שכבתי שומנים נתמך (SLBB)
מניותנפחריכוז סופי
2 M KCl1.5 מ"ל300 mM
1 M HEPES200 μL20 mM
500 mM MgCl2 20 μL1 מ"מ
מים8 מ"ל
מאגר טרום תגובה (PRB)
מניותנפחריכוז סופי
2 M KCl166 μL33.3 מ"מ
1 M HEPES500 μL50 mM
מים9.33 מ"ל
מאגר תגובות
מניותנפחריכוז סופי
2 M KCl166 μL33.3 מ"מ
1 M HEPES300 μL50 mM
10 מ"ג/מ"ל BSA1.39 מ"ל1.39 מ"ג/מ"ל
1% מתילצלולוז1.39 מ"ל0.0014
מיםעד 10 מ"ל
BME0.7 מיקרול1 מ"מ
מאגר אחסון ספטין (SSB)
מניותנפחריכוז סופי
2 M KCl1.5 מ"ל300 mM
1 M HEPES500 μL50 mM
מיםעד 10 מ"ל
BME0.7 מיקרול1 מ"מ

טבלה 1: רכיבי Buffer להכנת דו-שכבת שומנים נתמכת ותגובות. מוצגים נפחים של פתרונות מלאי המשולבים במאגרים והריכוזים הסופיים של כל רכיב. SLB ו- PRB ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ולעשות בהם שימוש חוזר בין ניסויים. מאגר תגובה ו-SSB מיוצרים טריים עבור כל ניסוי.

2. דו-שכבתי שומנים נתמכים כדוריים

הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרו-כדוריות סיליקה המרחפות במים אולטרה-פוריים בצפיפות של 10%. עבור כל עבודה על הפרמטרים הקינטיים של מכלול חלבונים, חשוב לשלוט בקפדנות על שטח הפנים הכולל של הממברנה בין ניסויים ועקמומיות. טבלה 2 מציגה את הנפחים המתוקנים של חרוזים וחיץ כדי לשמור על 5 מ"מ2 של שטח הפנים הכולל של הממברנה. פרוטוקול זה מרחיב על שיטהשפורסמה בעבר 8,18.

  1. היווצרות דו-שכבתית
    הערה: באשר לדו-תאיים מישוריים, חשוב שיהיו רכבי שטח באיכות גבוהה להיווצרות דו-שכבתית חזקה. טבלה 2 מפרטת את נפח החרוזים מתמיסת צפיפות של 10% ואת נפחי ה- SLBB המתאימים שלהם המשמשים להשגת שטח פנים סופי של 5 מ"מ2 עבור טווח קוטרי חרוזים.
    1. מיקרוספרות סיליקה (המכונות גם חרוזים) נוטות להתיישב ולהתגבש יחד; כדי לערבב את החרוזים ולפרק את כל האשכולות, לסובב את הבקבוק במשך 15 שניות, ואז לעשות זאת באמבטיה-סוניקט במשך דקה אחת, ולסובב שוב במשך 15 שניות.
    2. ערבבו את הנפח המתאים של חרוזים (טבלה 2) עם הנפח המתאים של SLBB ו-10 μL של רכבי שטח של 5 mM בצינור מיקרו-צנטריפוג' בהדבקה נמוכה של 0.5 מ"ל.
    3. מנדנדים את תערובת החרוזים-שומנים מקצה לקצה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ודא כי דגירה זו נעשית על סיבוב כדי למנוע משקעים.
  2. הכן תאים על כיסויי PEGylated
    הערה: באשר לדו-תאיים מישוריים, תאים תוצרת בית מצינורות PCR מפלסטיק משמשים לתמיכה בנפחי התגובה, אך חומרים אחרים בהדבקה נמוכה, כגון בארות סיליקון, עשויים לעבוד באותה מידה.
    1. בזמן שהחרוזים מתנדנדים, הפשירו כיסוי PEGylated בטמפרטורת החדר. חותכים צינור PCR של 0.2 מ"ל ומדביקים אותו לכיסוי כפי שמתואר בשלב 1.2. עבור שקופיות של 24 מ"מ x 50 מ"מ, עד 10 תאים יכולים להתאים באופן ריאלי לשקופית אחת.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש בכיסויי זכוכית PEGylated בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ המוכנים מראש. בקצרה, כיסויי זכוכית מנוקים ביסודיות באמצעות סוניקציה באצטון, מתנול ו-3 M KOH. לאחר מכן, הכיסויים מתפקדים עם n-2-אמינואתיל-3-אמינופרופילטרימתוקסיסילן ומקושרים באופן קוולנטי ל-mPEG סוקינימידיל ולראט. כיסויי PEGylated מוגמרים מאוחסנים אטומים בוואקום בטמפרטורה של −80 °C (80 °F). לקבלת פרוטוקול פסיבציה דומה, ראה את עבודתם של Gidi et al.27. בעוד שכיסויי זכוכית PEGylated מוצעים כאן, אמצעים אחרים של פסיביזציה, כגון BSA או שיטות פולי-L-ליזין, עשויים להיות יעילים.
  3. שטיפת שומנים עודפים
    הערה: שלב זה פועל להסרת רכבי שטח עודפים ולביצוע החלפת מאגר. חרוזים נשטפים פי 4 בסך הכל עם מאגר טרום תגובה (PRB: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4). טבלה 3 מפרטת את מהירויות הספין ב-RCF עבור טווח של קוטרי חרוזים.
    1. חרוזי ספין ב- RCF המיועד למשך 30 שניות (טבלה 3). אם אתם משתמשים במספר גדלי חרוזים, הקפידו על נדנדת חרוזים עד שיגיע הזמן שלהם להישטף.
      הערה: לא כדאי להקדיש חרוזים גדולים יותר באותו סיבוב כמו חרוזים קטנים יותר עם מהירות שקיעת החרוזים הקטנה יותר כדי לחסוך זמן. זה יכול לגרום לחרוזים להיצמד זה לזה ולפגוע בשלמות הדו-שכבתי.
    2. לאחר הספין הראשון, הסר 50 μL של סופרנאטנט והוסף 200 μL של PRB. לאחר הסיבוב השני והשלישי, הסר 200 μL והוסף 200 μL של PRB. לאחר הסיבוב הרביעי, הסר 200 μL והוסף 220 μL של PRB. פיפטה במרץ לכל שטיפה.
      הערה: נפח ההחייאה הסופי שונה מהשטיפות. אין לסובב את החרוזים לאחר הדגירה עם השומנים מכיוון שהדבר עלול להשאיר רווחים בדו-שכבתיים. כדי להימנע ממשקעים תוך כדי עבודה עם גדלי החרוזים האחרים או הגדרת חלקים אחרים של הבדיקה, הניחו את תערובות החרוזים בחזרה על המסובב מקצה לקצה.
  4. הכנת התגובה
    הערה: תגובה זו נועדה לשמר את שטח הפנים הכולל של הממברנה של התגובה ב-5 מ"מ2 ולייצר מצב תגובה סופי של 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0.1% מתילצלולוז ו-1 mM BME.
    1. אם אתם מבצעים בדיקת תחרות עם מספר גדלי חרוזים, הכינו תערובת של 1:1 על ידי ערבוב נפחים שווים של כל גודל חרוז יחד. לאחר מכן, יש לערבב 29 μL של תערובת החרוזים הרצויה (או של חרוז יחיד) עם 721 μL של מאגר RXN.
      הערה: חשוב לערבב ביסודיות את החרוזים בכל צעד עם פיפטה כדי למנוע אשכולות צפופים של חרוזים; התוצאה תהיה התפלגות חרוזים אחידה יותר ושטח פנים כולל מדויק.
    2. מערבבים 75 μL של חרוזים מדוללים ו-25 μL של חלבון מדולל ב-SSB לבארות.
      הערה: המחברים בדרך כלל מדמיינים קומפלקסים של ספטין שמרים ב-1-50 ננומטר.
    3. אם מודדים ספטינים במצב יציב, דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן תמונה על ידי מיקרוסקופיה קרובה ל-TIRF או קונפוקלית.
קוטר חרוז (μm)נפח של חרוזים מעורבבים היטב (μL)נפח של מאגר SLB (μL)נפח רכבי שטח (μL)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

טבלה 2: נפחים מנורמלים של מיקרוספרות. על מנת לשמור על שטח פנים שווה של כל גודל חרוז ולשמור על עקביות שטח הפנים הכולל של הממברנה בין הניסויים, חושבו נפחים עבור כל גודל חרוז וחיץ שנרמלו את שטח הפנים הכולל.

קוטר חרוז (μm)מהירות שקיעה (RCF)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

טבלה 3: מהירויות שקיעה למיקרו-ספירות בקטרים משתנים. עבור כל קוטר חרוז, מהירויות המשקע המינימליות המוצגות שימשו כדי להעיף את החרוזים לשטיפת ליפוזומים לא מאוגדים.

3. דו-שכבתי שומנים הנתמכים על ידי מוט

הערה: בניגוד למבחנים האחרים שהוצגו כאן, בדיקת המוט אינה מאפשרת שליטה זהירה על שטח הפנים הכולל של הממברנה. אפשר להיות עקביים בכמויות ובנפחים בין הניסויים, אך מכיוון שהתוצאה היא מוטות באורכים ובקטרים שונים, קשה לבצע אקסטרפולציה של שטח הפנים הכולל של הממברנה בתגובה. לפיכך, בעוד שמדובר במבחן מצוין לחקר חישת העקמומיות עם עקמומיות מרובה על משטח יחיד והיה שימושי לחקר מבנה-העל של ספטין, הוא אינו מומלץ למדידות קינטיות. שיטה זו דווחה בעבר18 והיא מורחבת כאן.

  1. השגת מוטות בורוסיליקט ממסנני מיקרופייבר מזכוכית
    1. קרעו מסנן מיקרופייבר זכוכית יחיד בדרגה GF/C בקוטר 42.5 מ"מ לחתיכות קטנות והכניסו אותן לכוס של 100 מ"ל עם 60 מ"ל של 100% אתנול. באת'-סוניקט עד שהתמיסה הופכת אטומה; זה יכול לקחת רק 20-30 דקות עם מסנן מגורר דק.
      הערה: סוניקט ביסודיות כדי לשבור נתחים גדולים; כמה שיותר מנותק / אטום, יותר טוב.
    2. מכסים את הפתרון עם פילם ומאחסנים את הפתרון בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  2. יצירת דו-שכבתיים על המוטות
    הערה: שלב זה מבוצע עם שומנים עודפים כדי להשיג כיסוי מוט מלא מכיוון שלא ניתן לכמת את שטח הפנים הכולל בשיטה זו.
    1. למחרת תמיסת האתנול תוסדר (שלב 3.1.2.), לכן ערבבו אותה היטב לפני השימוש. שלב 10 μL של תמיסת מוט ו- 70 μL של SLBB.
    2. סובב במהירות שיא בצנטריפוגה קטנה במשך 30 שניות והסר 50 μL של הסופרנטנט. בצעו החייאה בעוד 50 μL של SLBB וחזור על הספין במשך ארבע שטיפות בסך הכל כדי לדלל את האתנול.
      הערה: תומכי מוט לא ייצרו כדור מוצק בתחתית הצינור. במקום זאת הם מרוחים לאורך צד הצינור; זה מקשה עליהם לשמור לחלוטין בעת כביסה. מכיוון ששטח הפנים הכולל במבחן זה אינו נשלט, זה בסדר אם הם מופרעים.
    3. שלבו 10 μL של פתרון מוט מעורב היטב עם 50 μL של 5 mM רכבי שטח ו-20 μL של SLBB. דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, תוך סיבוב מקצה לקצה כמו בעת יצירת דו-שכבתיים במיקרו-ספירות.
  3. שטיפת שומנים עודפים
    1. בדומה לשלב 3.2.2.2., סובבו את תמיסת מוט השומנים במהירות המרבית בצנטריפוגה קטנה במשך 30 שניות כדי להוציא את המוטות המצופים בממברנה מהתמיסה.
    2. לאחר הספין הראשון, הסר 50 μL של הסופרנאטנט והוסף 200 μL של PRB. לאחר הסיבוב השני והשלישי, הסר 200 μL והוסף 200 μL של PRB. לאחר הסיבוב הרביעי, הסר 200 μL, הוסף 220 μL של PRB, ופיפט במרץ לערבב.
  4. הכנת התגובה
    1. בצינור microcentrifuge בגודל 1.5 מ"ל, יש לערבב 721 μL של מאגר תגובה עם תמיסת מוט של 29 μL. מערבבים היטב.
    2. בצינור PCR של 0.2 מ"ל, שלבו 75 μL של מוטות במאגר תגובה ו-25 μL של ספטינים בריכוז הרצוי, מדולל ב-SSB. אפשרו לו לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות.
  5. הכנה לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים
    1. לאחר הדגירה, מוסיפים את תערובת מוטות הספיגין בנפח 100 μL על מעטפת עגולה, מצופה PEG בקוטר 12 מ"מ, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת בצלחת פטרי סגורה.
    2. תקן את הדגימה על ידי מילוי החלק התחתון של צלחת פטרי (10 מ"ל צריך להיות מספיק) עם 2.5% glutaraldehyde ב 0.05 M נתרן cacodylate (NaCo), pH 7.4, במשך 30 דקות. לשאוף את הנוזל עם פיפטה זכוכית. שטפו את הדגימה על ידי דגירה ב-10 מ"ל של 0.05 M NaCo למשך 5 דקות וחזור על הפעולה במשך שתי שטיפות בסך הכל.
    3. פוסטפיקס ב 0.5% OsO4 cacodylate buffer למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף 3x ב 0.05 M NaCo (5 דקות / לשטוף).
    4. דגירה של הדגימה עם 1% חומצה טאנית למשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב NaCo 3x. דגירה למשך 15 דקות ב-0.5% OsO4 ושטיפה 3x עם NaCo.
    5. לייבש את הדגימות באמצעות ריכוזי אתנול הולכים וגדלים: 30% EtOH למשך 5 דקות, 2x; 50% EtOH למשך 5 דקות; 75% EtOH למשך 5 דקות; ו-100% EtOH למשך 5 דקות, 2x. המשיך עם עוד 10 דקות דגירה.
    6. דגירה בנוזל מעבר (הקסמתילדיזלאזאן) 3x (5 דקות, 10 דקות, ואז 5 דקות).
    7. אפשרו להתייבש באוויר, ואז הניחו את הדגימות במייבש עד לציפוי מתפזר. ציפו את שכבת ה-4 ננומטר בסגסוגת זהב/פלדיום ולאחר מכן תמונה על מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר הכנת כל SLB, ספטינים או החלבון המעניין עשויים להיות דוגרים עם התמיכה הרצויה ולהצטלם באמצעות TIRFM, מיקרוסקופיה קונפוקלית או SEM. התוצאות המוצגות כאן משתמשות בספטינים המבוטאים באופן רקומביננטי ומטוהרים מ- E. coli17. באמצעות TIRFM על SLBs מישוריים, ניתן לקבוע את אורך החוטים ואת גמישותם, למדוד את מקדמי הדיפוזיה ולצפות בהרכבה לאורך זמן28,29. על מנת לאסוף את המדידות האיכותיות ביותר, יש צורך תחילה לברר את איכות הדו-שכבתיים, במיוחד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קרום התאים לובש צורות, עקמומיות ותכונות פיזיקוכימיות רבות ושונות. על מנת לחקור את המנגנונים בקנה מידה ננומטרי שדרכם תאים בונים מכלולים בקנה מידה של מיקרומטר, יש צורך לתכנן מערכות שחזור מינימליות של פנטומימה של ממברנות. פרוטוקול זה מציג טכניקות השולטות במדויק הן בעקמומיות הממברנה והן בהרכבן, תוך מתן אפשרות למשתמש לבצע בקלות מדידות פלואורסצנטיות כמותיות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה זמינות באופן נרחב.

המרכיבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם הרכבת בארות על המשטח המתאים וטיפול בשומנים. הבארות המתואר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). R01 GM-130934 והקרן הלאומית למדע (NSF) מענק MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., ו- K.S.C. נתמכו בחלקם על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תחת הפרס T32 GM119999.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות PCR של 0.2 מ"ל עם מכסה שטוח, טבעיWatson137-211C(EX)
0.5 מ"ל צינורות הידבקות נמוכיםUSA Scientific1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
Coverglass להכנת כיסויים PEGylatedThermo Scientific152450ריצ'רד-אלן סיינטיפיק SLIP-RITE כיסוי זכוכית 24x50 #1.5
DOPCAvanti Polar Lipids850375
Egg Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipids810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM GradeVWR16220
EMS נתרן קקודילאט מאגרVWR11652
אתנול, 200 הוכחהפישר סיינטיפיק04-355-223EA
HEPESסיגמא אולדריץ'H3375-1KG
Hexamethyldisilazaneסיגמא-אולדריץ'440191
מגנזיום כלורידVWR7791-18-6
מתיל צלולוז 4000cpסיגמא-אולדריץ'M052-100G
כיסויי זכוכית לשכבות דו-שכבתיות מישוריותמטסונאמיהופסק22x22
מיני צנטריפוגה
סיליקה מיקרוספירות סיליקה לא מתפקדותBangs Laboratories, Inc.תלוי בגודל: SS0200*-SS0500*סיליקה במתלה מימי
דבק אופטיNorland ThorlabsNOA 68דבק גמיש לזכוכית או פלסטיק
אוסמיום טטרוקסידMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
מנקה פלזמהתחריט פלזמהPE-25מתח: 120V, 60Hz. זרם: 15 אמפר
אשלגן כלוריVWR0395-1 ק"ג
כיסוי עגול, #1.5 12 מ"מ   VWR64-0712
אמבט סוניקטורברנסון1510R-MTמנקה אולטרסאונד ברנסוני. 50-60 הרץ. פלט: 70W
סויה PIאוונטי שומנים קוטביים840044
צנטריפוגה שולחניתEppendorf22331
מנורת UVספקטרוליןENF-260C115 וולט, 60 הרץ, 0.20 AMPS
נייר מסנן מיקרופייבר WhatmanGlassVWR28455-030קוטר 42.5 מ"מ, דרגה GF/C

מקורות

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916(2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420(2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TIRF
שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.