קיבוע רקמת עכבר עוברית לניתוח ציטונמה

ההתפתחות העוברית מתוזמרת באמצעות הפעלה מתואמת של מסלולי איתות מורפוגן. מורפוג'נים הם חלבונים קטנים ומופרשים המסווגים לקיפוד סוניק (SHH), מה שהופך את גורם הגדילה β (TGF-β)/חלבון מורפוגני עצם (BMP), אתר אינטגרציה ללא כנפיים (WNT) ומשפחות פיברובלסטים וגורמי גדילה אפידרמליים (FGF/EGF). מורפוגנים מיוצרים ומשתחררים ממרכזי התארגנות תאית במהלך התפתחות הרקמות ויוצרים שיפועי איתות על פני שדות מארגנים של תאים כדי ליידע את מורפוגנזה של רקמות ^1,2,3,4,5. ייצוג אחד של גרדיאנטים של מורפוגן נמצא במערכת העצבים המתפתחת, שם מערכת העצבים המרכזית המשוערת מעוצבת באמצעות הפעלת מסלול מורפוגן. רקמה זו, המכונה הצינור העצבי, מורכבת משיפועים מנוגדים של SHH המופרשים על ידי הנוטוקורד הגחוני ביותר ולוח הרצפה, ו- WNTs / BMPs המופרשים מלוח הגג הגבי, כדי לעצב אזורי אב עצביים מובחנים⁶. הצינור העצבי משמש בדרך כלל לחקר שלמות השיפוע של מורפוגן במחקר התפתחותי.

היווצרות גרדיאנט מורפוגן מסתמכת על ויסות הדוק של פיזור^{האותות 7}. מנגנון תאי אחד שבאמצעותו זה מתרחש הוא באמצעות היווצרות של פילופודיה איתותית ארוכה הנקראת ציטונמות המאפשרות העברה ישירה של מורפוגנים מתאים המייצרים אותות לאוכלוסיות ספציפיות של תאי מטרה. ציטונמים נצפו מרחיבים מאות מיקרומטרים כדי להפקיד מורפוגנים על קרומי תאים קולטים אותות ^8,9. שיבוש בהעברת מורפוגן בתיווך ציטונמה מוביל לאנומליות התפתחותיות הן בזבובים והן בבעלי חוליות, ומדגיש את חשיבותן במהלך דפוס הרקמות 10,11,12,13,14.

עד כה תועדו ציטונמים במודלים של דרוזופילה, אפרוחים ודגי זברה, אך הדמיה של המבנים בעוברי יונקים מתפתחים נותרה מאתגרת ^8,9,15. מכשול להדמיה יעילה של ציטונמים ברקמות יונקים מורכבות באתרם הוא אופיים הדק והשברירי, מה שהופך אותם לרגישים לנזק בשיטות קיבוע קונבנציונליות⁸. בעבר פיתחנו ועשינו אופטימיזציה של פרוטוקולים למיקרוסקופיית אלקטרונים מתוקנת (MEM-fix) כדי לשמר ציטונים בתאים בתרבית ולאפשר את המחקר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית^16,17.

השימוש בטכניקת MEM-fix אפשר זיהוי של חלק מהמולקולות המעורבות ביצירת ציטונמות המושרות על-ידי SHH^{ותפקודן} 11,16,17. עם זאת, אישור הממצאים הללו בהקשר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית של דפוס הצינורות העצביים הצריך פיתוח של טכניקות חדשניות לתיקון ותמונה של רקמה עוברית של עכבר. כאן מתואר פרוטוקול לתיקון עוברי עכברים באופן שישמור על שלמות הציטונמה ויאפשר חיסון וחיתוך לאחר מכן של רקמה עוברית לצורך ניתוח קונפוקלי. פרוטוקול זה פותח באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק הקשור לממברנה (GFP) כדי לתייג הרחבות ממברנה מהתאים המייצרים SHH בתעלה העצבית המתפתחת. יישום פרוטוקול זה יעסוק בשאלות שלא נענו הנוגעות לשכיחותם ומשמעותם של ציטונמים בפיתוח מערכות יונקים.

פרוטוקול זה תואם את ההנחיות המאושרות לטיפול בבעלי חיים של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ובית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד. כל הזנים הוחזרו חמישה דורות לזן C57BL/6J.

1. בידוד העוברים וכתמי הרכבה שלמה

1. לגדל נקבות בנות 6 שבועות ולפקח על נוכחות של תקע הנרתיק.
2. הרדמה את הסכר ההרה על ידי שאיפת CO₂ בתא CO₂ ואחריה פריקה צוואר הרחם על פי הנחיות AVMA¹⁸. בצע חתך Y לחלל הצפק באמצעות מספריים ומלקחיים מנתחים. הבלו על הרחם המכיל את עוברי E9.5 בהתאם להנחיות המוסדיות המאושרות.
3. נתחו את העוברים במדיום גדילה מלא (מדיום הנשר המהונדס של Dulbecco, בתוספת חומצות אמינו לא חיוניות, Na-pyruvate, L-גלוטמין ו-10% סרום בקר עוברי). השתמשו במלקחיים כדי להסיר את שק החלמון, השליה והממברנות הסובבות אותה.
   הערה: בעת הצורך, שמור כל שק חלמון לגנוטיפ עוברי.
4. שטפו את העוברים המבודדים בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) כדי להסיר כל רקמת מי שפיר ודם שיורית.
5. הכן את הקיבוע. הוסף paraformaldehyde (PFA) ל- HBSS לריכוז עבודה סופי של 4% PFA.
   אזהרה: PFA הוא כימיקל רעיל, ולכן יש להימנע משאיפה או מחשיפה ישירה לעור. הכנת הפתרון המקבע מתבצעת תחת מכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים של כפפות ומעיל מעבדה.
6. הוסיפו 1 מ"ל של קיבוע לכל באר של צלחת בת 24 בארות והניחו כל עובר בבאר בודדת. דגירו את העוברים באופן קבוע במשך 45 דקות עם תסיסה עדינה על נדנדה.
   הערה: קריטי: כל השטיפות והדגירות חייבות להיעשות בתסיסה עדינה (מקסימום 20 סל"ד) על נדנדה או שייקר עגול, שכן טיפול פתאומי או תנועה של העוברים יהרסו את הציטונמות הקבועות. השתמש בפיפטה כדי להסיר בעדינות את כל הפתרונות.
7. הסר את הקיבוע ושטפו את העוברים 3 x 30 דקות במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) עם Ca²⁺ ו- Mg²⁺ עם תוספת של 0.1% טריטון.
8. לאחר הכביסה, דגירו את העוברים בתמיסת חסימה (PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, 0.1% טריטון ו-5% סרום עיזים) עם תסיסה עדינה. בלוק 2 x 1 שעות. לאחר הדגירה השנייה לחסימה, יש לבצע שטיפה מהירה אחת של העוברים באמצעות תמיסת חסימה טרייה.
9. במהלך שלב החסימה השני, להכין את פתרון הנוגדן העיקרי¹¹. דיללו את הנוגדנים לריכוז הממוטב ב-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים.
   הערה: להדמיה משופרת של GFP ממברנה, ניתן להשתמש באנטי-GFP של עוף (1:250).
10. הסר את תמיסת החסימה והוסף 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר. אינקובציה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך 3 ימים.
11. לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, שטפו את העוברים 5x1 שעות ב-20 סל"ד על נדנדה ב-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים.
12. הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית באמצעות מקטעים משניים של F(ab')₂ בדילול של 1:1,000 ב-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים.
    הערה: שימוש בשברי F(ab')₂ משפר מאוד את חדירת הנוגדנים לדגימה.
13. הוסף 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית לכל באר. דגירה עם נדנדה עדינה ב 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך 3 ימים.
    הערה: חשוב: מנקודה זו ואילך, צמצם את חשיפת העוברים לאור ישיר. אופציונלי: כדי למנוע צמיחה של חיידקים, יש להוסיף 0.2% נתרן אזיד לתמיסת הנוגדנים המשנית.
14. הסירו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את העוברים 3 x 30 דקות ב-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים. אם לא מבצעים צביעת אקטין עם פאלואידין או צבעי אקטין אחרים, לאחר הכביסה הראשונה, יש להוסיף 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) ל-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, 0.1% Tween-20, ו-5% סרום עיזים ודגירה למשך שעה אחת, ולאחר מכן שטיפות של 3x30 דקות כמתואר לעיל.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב- PBS או HBSS בחושך עד לשלב ההטבעה למחרת. עם זאת, מומלץ להטמיע את העוברים ולחלקם באופן מיידי.

2. הטמעה, חתך והרכבה של עוברים

1. הכינו תמיסת אגרוז של 4% עם נקודת התכה נמוכה (LMP) המומסת ב-HBSS או ב-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺ לנפח סופי של כ-3 מ"ל לעובר. הוסיפו את המשקל המתאים של אגרוז LMP ל-HBSS או ל-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺ ומיקרוגל עד שהאגרוז LMP מומס.
   הערה: לאחר התמוססות האגרוז LMP, אחסנו את התמיסה באמבט חרוזים, אינקובטור או אמבט מים המוגדרים ל-55 מעלות צלזיוס כדי למנוע את התמצקות האגרוז של LMP.
2. השתמשו בצלחת של 12 קידוחים כתבנית ההטבעה לעוברים. הניחו את הצלחת בת 12 הבאר באמבט החרוזים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. הוסיפו 2.5-3 מ"ל של 4% אגרוז LMP לכל באר שתחזיק עובר.
   הערה: למרות שניתן להשתמש בתבניות אחרות, נפחי צלחת של 12 בארות הם אופטימליים להכנת בלוק האגרוז בשלבים מאוחרים יותר לצורך חתך.
3. באמצעות כפית מחוררת, העבירו את העוברים לבארות בודדות המכילות תמיסת אגרוז LMP של 4% (איור 1A).
   1. העבירו את הצלחת בת 12 הבאר מאמבט החרוזים לספסל. השתמשו בקצות פיפטה כדי להטמיע ולכוון בעדינות את העובר כך שיהיה ממורכז בתוך התמיסה. לאחר שהעוברים מכוונים, הניחו את הצלחת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר התמצקות מהירה של הבלוק.
      קריטי: ודא שהעובר ממוקם במרכז הבלוק. עוברים ששוקעים לתחתית או קרובים מדי לקצה העובש ככל הנראה יסולקו מגוש האגרוס תוך כדי חתך.
4. מוציאים את כל גוש האגרוס מהבאר באמצעות אזמל וחותכים גוש מלבני סביב העובר ומשאירים כ-0.3 ס"מ של בלוק בכל צד. אפשרו אורך נוסף לאורך הקצה הקאודאלי של העובר. כאשר הוא מותקן על הוויברטום, כוון את העובר למיקום זקוף בחלק העליון של הבלוק (איור 1B).
5. מרחו רצועת סרט על מחזיק הדגימה של הוויברטום והעבירו את גוש האגרוס לקלטת, בכיוון שהלהב ייצור חלקים ציריים של העובר ברצף קדמי (גולגולתי) עד אחורי.
6. מלאו את תא הוויברטום ב-HBSS קר כדי לוודא שהדגימה שקועה במלואה, ולאחר מכן הקיפו את התא בקרח.
7. הגדר את מהירות הרטט ל - 0.2 מ"מ לשנייה ותדר בין 5 ל - 7 (50-70 הרץ) כאשר עובי החתך מוגדר ל - 100 מיקרומטר. בצע חתך צירי סדרתי של העובר.
   הערה: השתמש במהירות איטית לצורך חתך. אם מהירות החיתוך מוגברת מעל 0.25 מ"מ לשנייה, החתך עלול לקרוע את העובר או לעקור את העובר מהגוש.
   1. במהלך סדרת החתכים, השתמש במלקחיים כדי להעביר בעדינות מקטעים בודדים לצלחת נפרדת של 60 מ"מ במילוי HBSS. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הבלוק, לא את הרקמה, כדי למנוע נזק לרקמות והרס של ציטונמים.
      הערה: מקטעי רקמות צריכים להישאר בתוך גוש האגרוז. אם הרקמה נופלת מהגוש לתוך תא הוויברטום, מעבירים בעדינות על ידי הרמת הקטע החוצה. אין לתפוס או לצבוט את הרקמה. קריטי: כל קיפול של חלקי רקמות או טיפול פתאומי יהרוס ציטונמים קבועים בחתכי הרקמה.
8. אם לא מבצעים צביעת F-אקטין, המשיכו לשלב 2.10.
   1. כדי לבצע צביעת F-אקטין, יש להסיר את מקטעי ה-HBSS והדגירה למשך 40 דקות עם תמיסת אקטין-אדום ו-DAPI המדוללת ב-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים בטמפרטורת החדר.
9. שטפו מקטעים 3 x 20 דקות ב- PBS עם Ca²⁺ ו- Mg²⁺ ו- 0.1% Tween-20.
10. באמצעות עט סמן הידרופובי, ציירו מחסום הידרופובי סביב הקצוות של מגלשת מיקרוסקופ טעונה והוסיפו נפח קטן של HBSS כדי למלא את האזור.
11. השתמש במלקחיים או בכפית מחוררת כדי להעביר חלקים לשקופית.
    הערה: ניתן להעביר את כל חלקי הרקמות שאינם עטופים באגרוז באמצעות פיפטת העברה.
12. הסר עודף בלוק אגרוז באמצעות מלקחיים.
13. לאחר שכל החלקים הועברו למגלשה, הסר עודפי נוזלים באמצעות צנרת ופינת מגבת סופגת, ולאחר מכן הוסיפו מספר טיפות של מדיום הרכבה למגלשה. השתמש במדיום הרכבה מספיק כדי לכסות את כל אזור הכיסוי כאשר הוא נרפא. הרכיבו את הכיסוי על ידי הצבתו בעדינות על המגלשה.
    הערה: הימנעו מהפעלת לחץ או כיסויים מטרידים עד שמדיום ההרכבה יירפא.

3. הדמיה

1. בצע הדמיה של מקטעי רקמות על כל מיקרוסקופ קונפוקלי או ברזולוציה גבוהה יותר¹¹. לנתח מינימום של שלושה עוברים לכל גנוטיפ.
   הערה: תמונות של מקטעי רקמות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי TCS SP8 STED 3x, ואחריו פירוק LIGHTNING.

השימוש בתבנית גדולה יותר של צלחת בעלת 12 בארות עם תמיסת אגרוז בגודל 2.5-3 מ"ל לבאר היה אידיאלי להטבעה ולהשעיה של מספר עוברים בפרק זמן קצר (איור 1A). השטח העודף מאפשר כיוון נכון בעת חיתוך גוש האגרוז לצורך חתך. בעת חיתוך גוש האגרוס, חשוב לשמור על עודף אגרוז לאורך החלק התחתון של הבלוק שבו הוא יודבק לסרט על מחזיק האובייקט. העובר צריך להיות בחצי העליון של הבלוק (איור 1B). עם זאת, החלק התחתון לא צריך להיות גדול מדי מכיוון שעודף בלוק מגדיל את הסיכויים לשנות את זווית החיתוך כאשר הלהב דוחף לתוך הבלוק בזמן החתך. מוצגות דוגמאות למקטעים בעלי אוריינטציה נכונה (איור 1C,D).

בעת פיתוח פרוטוקול זה, חתך הוויברטום הושווה לחתך קריוסטאט. חתך קריוסטאט של הרקמה כמעט ולא השתמר על הרחבות תאיות (איור 2 קריוסטאט ואיור 3A,B ויברטום). מקטעי Cryostat אפשרו זיהוי של כמה מקטעי ממברנה חיוביים ל-GFP בין תאי הנוטוקורד והתעלה העצבית (איור 2A ראש חץ) ובין תאי הצינור העצבי הסמוכים (ראשי חץ איור 2B,B). עם זאת, צביעת F-אקטין של שלוחות תאיות בתאים המזנכימליים בעלי החוטים הגבוהים המקיפים את הצינור העצבי נפגעה בקטעי קריוסטאט (איור 2C,C' arrow, לעומת איור 3C,D). תוצאות קריוסטאט אלה מצביעות על כך שרק כמה עקבות של שלוחות תאיות שבורות נותרו בשיטה זו. לפיכך, חתך ויברטום עדיף לשמר ביעילות את ההרחבות העדינות הללו לניתוח הבא.

הפרעה מינימלית של מקטעי עובר שלמים ורקמות בודדות חיונית להדמיה באיכות גבוהה של שלוחות תאיות. מקטעי רקמה שעברו קיפול או אבזם כלשהם יהיו ניכרים בהיעדר הנוטוקורד או בהפרדה גדולה (>30 מיקרומטר) בין הנוטוקורד ללוח הרצפה הגחונית של הצינור העצבי (איור 3B). זה בדרך כלל מלווה באובדן של תאים מזנכימליים שבדרך כלל מקיפים את הצינור העצבי (איור 3A, חץ). מקטעים פגומים גם יגרמו לאובדן של הרחבות ממברנות תאיות נראות לעין הנודדות בין תאי אפיתל (איור 3B בהשוואה לאיור 3A, ראשי חץ). אפילו עיוותים קלים בחתכים עלולים לגרום לפיצול של הרחבות מבוססות אקטין ולמרווחים גדולים להיווצרות בין התאים (איור 3D, ראשי חץ, בהשוואה לאיור 3C שהשתמר היטב), מה שמדגיש את הצורך בטיפול עדין בכל השלבים.

איור 1: דוגמה של E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG מוכתם, מוטבע ומחותוך עובר. (A) עובר יחיד בצלחת של 12 בארות, משובץ באגרוז 4% LMP. (B) דוגמה לעובר בעל אוריינטציה נכונה בתוך גוש האגרוז שנחתך לגודלו לצורך הרכבה על ויברטום. עודף גוש אגרוז קיים לאורך החלק התחתון. (C) תמונת שדה בהיר של חתך עובר בעובי 100 מיקרומטר המוטבע באגרוז LMP. (D) הדמיה אימונופלואורסצנטית של מקטע לאחר הסרת אגרוז. mGFP מוכתם נגד GFP (ירוק) מייצג תאים המבטאים Shh ברקמה, כאשר שושלות תאים אחרות מבטאות את הממברנה עגבנייה (אדום), DAPI בכחול. הצינור העצבי (סוגריים) ונוטוקורד חיובי mGFP (חץ) נראים בבירור. פסי קנה מידה = 1 ס"מ (A), 5 מ"מ (B) ו- 100 מיקרומטר (C, D). קיצורים: LMP = נקודת התכה נמוכה; mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: דוגמה לצלחת רצפת הצינור העצבית בחתך קריוסטאט ולנוטוכורד עם הרחבות ממברנה מקוטעות. Rosa26 mTmG 19,20,21 קטע מוכתם עבור GFP (ירוק), F-אקטין (אדום) ו- DAPI (כחול). mGFP puncta נראים בין הנוטוקורד לבין לוח הרצפה (ראש החץ) ו-(B,B') הנודדים בין תאים סמוכים של הצינור העצבי. (ג,ג') צביעת F-actin אינה מצליחה לזהות ציטונומים ברורים על תאים מזנכימליים המקיפים את הצינור העצבי (חץ). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: דוגמאות למקטעי רקמת ויברטום אופטימליים ולא אופטימליים ולכתמים של צלחת רצפת הצינור העצבי, הנוטוקורד והתאים הסובבים אותה. דוגמאות למקטעים שטופלו בעדינות (A,C), בהשוואה ל-(B) מקטע רקמה מקופלת ו-(D) מקטע שטופל בצורה גרועה מ-Shh-Cre; Rosa26 mTmG ועובר ShhGFP/+ 19,20,21. מקטעים המטופלים בצורה אופטימלית מאפשרים זיהוי של ציטונמות בין תאי אפיתל עצביים של לוחות רצפה סמוכים (A, ראשי חץ). יש לראות את הנוטוקורד הסמוך לצינור העצבי (A, מבטא mGFP) ותאים מזנכימליים (A, חץ). (ג,ד) מקטעים מוכתמים ב-F-אקטין וב-DAPI צריכים לכלול ריווח עקבי של תאים מזנכימליים וציטונמים מבוססי F-אקטין (חצים) המקיפים את הצינור העצבי ואת נוטוכורד (C). כל קיפול או הפרעה קלים של החלקים עלולים לגרום למרווחים ולשברי F-אקטין שבורים (D, ראשי חץ). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.