ניקוי אופטי מהיר לניתוח בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול

תרביות תאים תלת-ממדיות (3D), כגון ספרואידים, מספקות מודלים מציאותיים מבחינה ביולוגית וניתנים לשחזור של צמיחת תאים מצטברת ^1,2. מודלים אלה הופכים במהרה לדבר שבשגרה הן במחקר בסיסי והן בפיתוח תרופות, שם נבחנים הבדלים בגודל ובמבנה הספרואידים בין הטיפולים כדי לוודא את יעילות התרופה ^3,4. בהקשרים אלה, היכולת לאסוף מידע מפורט ממספר רב של כדוריים היא בעלת יתרון רב, הן מנקודת מבט של כוח סטטיסטי והן כדי לאפשר הערכה מהירה של התנהגות התאים על פני מספר טיפולים.

טכניקות נפוצות לקבלת תמונות מיקרוסקופיה מפורטות של מבנה ספרואידי גוזלות זמן רב, יקרות, או מפיקות תמונות באיכות ירודה שאינן שומרות על תכונות כמותיות מרכזיות כגון גודל ספרואיד ^4,5. לדוגמה, טכניקות היסטולוגיות המבוססות על cryosectioning יכולות לספק תמונות באיכות גבוהה אך לעתים קרובות הן גוזלות זמן רב, דורשות עבודה מיומנת, ולעתים קרובות יוצרות חפצי חתך ^6,7, בעוד שטכנולוגיות אלגנטיות, כגון מיקרוסקופ תאורה במישור יחיד (SPIM)⁸ ומיקרוסקופיה מרובת פוטון⁹ דורשות מיקרוסקופים מיוחדים שאינם זמינים בקלות. טכנולוגיות מיקרוסקופיה מודרניות אפשרו לאחרונה את מה שמכונה חתך אופטי, שבו הספרואידים ממוקמים בתוך תמיסת סליקה מותאמת למקדם שבירה ותמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ^4,5. בעוד שלטכניקות אלה יש פוטנציאל לייצר תפוקה גבוהה, בעיות נפוצות כוללות תנועה כדורית תוך כדי הדמיה, עיוות גודל בזמן ניקוי, וההוצאה הגבוהה של פתרונות סליקה קנייניים. יתר על כן, פרוטוקולים קיימים רבים חלים רק על ספרואידים קטנים יחסית בקוטר או בעומק של פחות מ-300 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר, ומגבילים את הטכנולוגיה לשלבים המוקדמים של צמיחת הגידול ^5,10,11.

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר איסוף בתפוקה גבוהה למחצה ובעלת תפוקה גבוהה של תמונות ספרואידיות מפורטות באמצעות תמיסת סליקה תואמת מקדם שבירה בעלות נמוכה הנגזרת מהליכי ניקוי איברים שלמים^12,13. כדי למנוע תנועה כדורית במהלך ההדמיה ולספק תמיכה מבנית להפחתת עיוותי גודל, הספרואידים מותקנים בג'ל agarose-PBS בצלחת תחתונה מזכוכית #1.5 בעלת 24 בארות. מכיוון שטכניקה זו מאפשרת להרכיב מספר כדוריות בכל באר בצלחת של 24 בארות, ניתן להרכיב במהירות עד 360 ספרואידים (15 ספרואידים/באר) ולדמות אותם בתנאי ניסוי שונים. תמיסת סליקה תואמת-מדד שבירה הבנויה מחומרים מתכלים זמינים בקלות משמשת לפינוי כדוריות המותקנות ועל הג'ל שמסביב באופן אופטי. לאחר תקופת התיישבות של 24 שעות, פרוטוקול זה מספק תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות באיכות גבוהה של מבנה ספרואידי, אפילו עבור ספרואידים גדולים יחסית (בקוטר של כ-700 מיקרומטר), עם עיוות בגודל של פחות מ-2%.

הפרוטוקול מתאר את ההכנה של כמות מספקת של כדוריות גידול כדי להרכיב צלחת אחת של 24 בארות (כ-240-360 ספרואידים או 10-15 ספרואידים/באר) ב-200 μL של ג'ל אגרוז לבאר ו-500 μL של תמיסת ניקוי לכל באר. ההליך המלא מודגם באיור 1.

1. 2% הכנת ג'ל אגרוז-PBS

1. שוקלים 0.5 גרם של אגרוז נמס נמוך (ראו טבלת חומרים) בבקבוק זכוכית ומוסיפים 25 מ"ל של מי מלח עם מאגר פוספט (PBS).
2. ממיסים את האגרוס על ידי הרתחת התמיסה במיקרוגל במשך 30-60 שניות עם המכסה סגור אך לא אטום ועם מערבולת מתמדת. ודא שאגרוז מומס במלואו והתמיסה אינה רותחת.
   הערה: ניתן לאחסן ג'ל בטמפרטורת החדר; בדוק את אמצעי האחסון לפני השימוש כדי להסביר את האידוי. מביאים למצב הנוזלי (מיקרוגל; 20-60 שניות עם מערבולת) לפני השימוש.

2. הכנת פתרון הסליקה

1. שקלו 9 גרם של N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl) אתילנדיאמין, 22 גרם של אוריאה, 44 גרם סוכרוז, 0.1 גרם של טריטון X-100 ו-24.9 גרם של מים שעברו דה-יוניזציה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: קל יותר לשקול את הכמות המשוערת של N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine ולהתאים את המשקל של רכיבים אחרים כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
2. מחממים את התמיסה באמבט מים של 56 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמיד וממשיכים עד שכל הגבישים מתמוססים.
3. הנח את התמיסה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לבועות שנוצרו במהלך הערבוב לעלות אל פני השטח. הפתרון יציב בטמפרטורת החדר עד חודשיים.

3. הכנת ספרואידים

1. צור כדוריות בשיטת שכבת העל של אגרוז כפי שתואר קודם לכן ^1,3,14.
   הערה: ספרואידים הנוצרים בשיטות אחרות תואמים גם הם לפרוטוקול הדמיה זה.
2. חותכים את קצה קצה הפיפטה של 1 מ"ל באמצעות אזמל להגדלת הפתח.
   הערה: כל הספרואידים טופלו באמצעות פיפטות של 1 מ"ל או 200 μL עם קצוות חתוכים.
3. באמצעות הפיפטה, שאפו את הספרואידים מהבארות והעבירו אותם לצינור חרוטי שקוף של 1.5 מ"ל. ניתן לשלב מספר כדוריות מאותם תנאים באותו צינור.
   הערה: תמיד אפשרו לספרואידים להתיישב בתחתית הצינור כדי לשאוף למדיום.
4. שטפו את הספרואידים ב-1 מ"ל PBS פעמיים, הוסיפו תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) ניטרלית של 4% שחוממה מראש, והדגירו את הספרואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
5. הסר את תמיסת ה- PFA ושטף את הספרואידים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.

4. צביעה כדורית

1. באמצעות פיפטה, מעבירים עד 15 ספרואידים לצינור PCR של 200 μL.
   הערה: עבור ספרואידים שבירים, הרכיבו את הספרואידים בג'ל (שלבים 5.1-5.4) לפני שתמשיכו.
2. חלחל את התאים באמצעות 200 μL של 0.5% Triton X-100 ב- PBS. הניחו צינורות PCR בתוך צינורות עם מכסה בורג של 50 מ"ל ודגרו את הספרואידים למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה קלה.
   הערה: כל הדגירות נעשות תוך תסיסה על רוטור, רולר או שייקר (ראה טבלת חומרים) אלא אם כן צוין אחרת. זה חשוב כדי להשיג צביעה אחידה. כדוריות קבועות ב- PBS יכולות לפעמים להיצמד לדפנות קצה הפיפטה. שטיפת הקצה ב-0.5% טריטון X-100 ממזערת את הספרואידים מלהיצמד לקצוות.
3. החלף את התמיסה (שלב 4.2) ב- 200 μL של מאגר דילול נוגדנים (ABDIL)¹⁵ ודגירה לילה בטמפרטורת החדר.
4. הסר את ABDIL, הוסף 75 μL של נוגדן ראשוני ב- ABDIL, ודגירה בטמפרטורה של 4 °C (7 °F) למשך 2.5 ימים.
5. הסר את ה-supernatant ושטוף עם 200 μL של PBS עם 0.1% Tween ו-0.1% Triton X-100 (PBS-TT) פעמיים ודגרו עם 200 μL של PBS-TT למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
6. הסר PBS-TT, הוסף 100 μL של נוגדן משני ב- ABDIL, ודגירה בטמפרטורה של 4 °C (74 °F) למשך 2.5 ימים.
   הערה: ניתן להוסיף DAPI או צבע גרעיני אחר בשלב זה. רוב הצבעים דורשים פחות זמן דגירה מאשר נוגדנים.
7. הסר את ה-supernatant ושטף עם 200 μL של PBS-TT פעמיים ודגירה עם 200 μL של PBS-TT למשך 4 שעות. הספרואידים מוכנים להרכבה.

5. הרכבה

1. באמצעות פיפטה של 200 μL, מעבירים כדוריות קבועות ומוכתמות לצינורות PCR של 500 μL בצינור אחד לכל מצב (כ-10-15 ספרואידים).
2. החלף את התמיסה ב-200 μL של 2% (w/v) ג'ל וצנטריפוגה נוזלית בספין המהיר (במהירות המרבית הקבועה, ראה טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות.
   הערה: אלא אם כן הרכבה מיידית, הניחו בלוק חימום בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס כדי למנוע התקשות ג'ל.
3. שאפו את הספרואידים בג'ל אגרוז נוזלי של כ-50 μL והוציאו פנימה היטב צלחת תחתית זכוכית בעלת 24 בארות.
4. לפני שהג'ל מתקשה, מפרידים את הספרואידים באמצעות קצה פיפטה בג'ל שמסביב, ומוודאים שהספרואידים מכוסים בג'ל. לחלופין, הניחו את הצלחת על הקרח כדי להגדיר במהירות את הג'ל.
   הערה: מספר הספרואידים לכל באר תלוי בגודל הספרואידים. ספרואידים ממוקמים רחוק זה מזה, כך שרק ספרואיד אחד נכנס לשדה הראייה בזמן ההדמיה. זה חשוב לעיבוד תמונה אוטומטי.
5. מוסיפים 500 μL של תמיסת סליקה (שלב 2) לבאר, ומבטיחים שהג'ל שקוע. דגירה ב- RT למשך 24 שעות לפחות ותמונה את הספרואידים בתמיסת הסליקה. כדוריות יציבות בתמיסה זו עד חודש בטמפרטורת החדר וכאשר הן מוגנות מפני אידוי.

6. הדמיה

1. בחר מטרה עם מרחק עבודה ארוך מספיק כדי להקיף את כל הספרואיד, כולל גובה ההרכבה של הספרואיד בכלי.
   הערה: מטרות עם מרחק עבודה של 3 מ"מ או יותר נדרשות כדי לדמות את המישור המשווני של הספרואידים. יעדי הגדלה גבוהים יותר עם NA גבוה יותר יכולים לאפשר רזולוציה טובה יותר, אך יגבילו את העומק המרבי שבו ניתן לצלם את הספרואידים.
2. כדי לזהות את מישור קו המשווה, התאם את המיקוד עד שיגיע לשטח הפנים הגדול ביותר במישור XY ותמונה עם אחוז כוח הלייזר הנדרש, מתח הגלאי, הרווח והגדרות ההיסט הנדרשות.
   הערה: אחוז כוח הלייזר, מתח הגלאי, הרווח וההיסט ישתנו מאוד בהתאם לפלואורופור, עוצמת הכתם, עוצמת הלייזר, רגישות הגלאי וכו '.
3. עבור תמונות תלת-ממדיות, הגדר את ההתחלה והסוף של הספרואידים, ובחר את עוצמת האות המתאימה בעומק z שונים באמצעות הגדרות תיקון עוצמת z לפני ההדמיה.
   הערה: לקבלת רזולוציית התמונה הטובה ביותר, השתמש בקצב הדגימה של Nyquist עבור x, y ו-z (לפרטים, ראה הפניה¹⁶).

כדי להדגים את יכולתה של שיטת סליקה זו לספק תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות באיכות גבוהה, גדלו כדוריות בקטרים של 300-600 מיקרומטר מ-Fluorescent Ubiquitination מבוסס-ביקוויטינציה Cell Cycle Indicator (FUCCI) שהתמרו קווי תאי מלנומה FUCCI-WM164 ו-FUCCI-WM983b 9,17 אשר מבטאים את החלבון המונומרי Kusabira Orange2 (mKO2) וחלבון עזאמי גרין (mAG) במונומרי כאשר הם נמצאים ב-Gap1, ואת השלב המוקדם של S-phase/Gap2/mitosis במחזור התא, בהתאמה על פי נהלים שסופקו בשלב 3 1,3,14., לאחר מכן, הספרואידים תוקנו בתמיסת פורמלדהיד של 4% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חלחלו והוכתמו באנטי-p27kip1/אנטי-ארנב Alexa Fluor 647 אנטי-פימונידזול/אנטי-עכבר אלקסה פלואור 647, DAPI או DRAQ7 (ראו טבלת חומרים) (איור 2). כל קבצי המיקרוסקופיה מועלים למאגר GitHub (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). בהשוואה לספרואידים המותקנים על-ידי PBS, פתרון הניקוי מספק תמונות בבהירות גבוהה עם עיוות גודל מינימלי (איור 2A). הפרוטוקול מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של פרטים ברמת התא עמוק יותר לתוך הספרואידים ללא חתך היסטולוגי, ותמונת החתך התקבלה ממטרת אוויר של פי 20 (0.7 NA) ברזולוציה של 4096 x 4096 x 4096 פיקסלים ללא תפירה (איור 2B). באמצעות הגדלה נמוכה יותר ומטרת צמצם מספרית נמוכה יותר עם מרחק עבודה ארוך יותר, ניתן לקבל תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות המספקות פירוט ברמת התא בעומק של לפחות 200 מיקרומטר (איור 2C). הספרואידים גם הוכתמו על פי הפרוטוקול על ידי Spoerri et al.4 והושוו לכתם ספרואידי שלם (איור 2D,E). איור 2D מראה את האזור ההיפוקסי של הספרואיד המוכתם על ידי פימונידזולה, ואיור 2E מראה צביעה p27kip1 המסמנת את עצירת מחזור התא (צהוב) ואת הכתם הגרעיני DAPI (אפור). לוקליזציה של חלבונים ותבנית הכתמים דומות בין קריו-קטציה לפינוי ולכן אינן מושפעות משיטת ניקוי זו.

תיקון עוצמת האות ב-z מאפשר הדמיה של הספרואיד כולו. עם זאת, פיזור אור עקב הליבה הנמקית מגביל את היכולת לדמות את הצד הרחוק של הספרואיד. חדירה עמוקה יותר ופיזור פחות של פלואורופור אדום-רחוק, כגון כתם גרעיני DRAQ7, מאפשרים ייצוג משופר עוד יותר של מבנה ספרואידי תלת-ממדי (איור 3). סרט 1 מציג את העיבוד התלת-ממדי של הספרואידים של FUCCI המוכתמים ב-DRAQ7. פרוסת z דקה יותר עשויה לאפשר רזולוציית z טובה יותר, אך הדבר מגדיל באופן משמעותי את זמן ההדמיה ואת ההלבנה הפוטו-אקונומיקה של הפלואורופורים.

כדי לקבוע אם תמיסת הסליקה גורמת לעיוות גודל, צולמו 12 ספרואידים בג'ל 2% agarose-PBS ב-6 שעות, 12 שעות, 24 שעות, 72 שעות ו-168 שעות לאחר הצגת תמיסת הסליקה. התמונות סוכמו על ידי קביעת קוטר הספרואיד, המוגדר על סמך כדור בעל שטח חתך זהה לזה של הספרואיד (איור 4A). בעוד שהספרואידים נצפים גדלים מעט בגודלם במהלך 6 השעות הראשונות, מה שמצוין על ידי שינוי קיפול בקוטר של בין 2% ל-6% (איור 4B), לאחר 24 שעות עד 72 שעות, הספרואידים חוזרים לגודל השווה בערך לגודל המתאים בקיבוע PBS לאחר קיבוע PFA (איור 4C).

איור 1: המחשה של פרוטוקול ההרכבה והניקוי של הספרואידים. ספרואידים קבועים ומוכתמים מועברים לצינור 500 μL; נוזל עודף מוחלף על ידי 200 μL ג'ל אגרוז-PBS וצנטריפוגה. לאחר מכן, הספרואידים מועברים לבאר בעלת תחתית זכוכית בצלחת של 24 בארות. לאחר שהג'ל מותר להתמצק, מוסיפים תמיסת סליקה של 500 μL, וכדורים מורשים להתמצק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: השוואה בין כדוריות מלנומה אנושיות של FUCCI מנוקות ולא ברורות. צביעה מציינת גרעיני תאים חיוביים עבור mKO2 (אדום), המציין תאים ברווח 1; וגרעיני תאים חיוביים ל-mAG (ירוק), המציין תאים בפער 2. (A) כדוריים שגדלו מ-5000 תאי FUCCI-WM983b, נקטפו ביום ה-10 והודגמו בג'ל אגרוז-PBS ו-24 שעות לאחר הוספת תמיסת ניקוי. השוואת תמונות שדה בהיר וקונפוקל לפני ואחרי פתרון הניקוי מראה עיוות גודל מינימלי ועלייה גדולה בבהירות. התמונות מתקבלות באמצעות מטרה של פי 10. (B) ספרואידים הגדלים מתאי FUCCI-WM164 חודרים באמצעות Triton X-100 ומוכתמים ב-DRAQ7, ומכתימים את כל גרעיני התאים. התמונה מתקבלת באמצעות מטרה של פי 20 (0.75 NA), המדגימה כי תמיסת הסליקה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של פרטים ברמת התא. (C) התקבלו תמונות תלת-ממדיות (10x, 0.4 NA) של כדוריות FUCCI-WM164 ב-PBS, ו-24 שעות לאחר הוספת תמיסת הסליקה. התאמת כוח הלייזר, המתח וההיסט במישור z שונה מאפשרת הדמיה עמוקה יותר בתוך הספרואיד. (ד,ה) השוואה בין קריוזקציה לבין ספרואיד שלם שנוקה מוכתם עבור פימונידזולה ועמ' 27קיפ1. (D) צביעת פימונידזולה במג'נטה מראה את האזור ההיפוקסי בספרואידים. אדום וירוק מציינים FUCCI. (E) קריוזקטיות וספרואידים מנוקים המציגים DAPI (אפור) ועמ' 27kip1 (צהוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: ניקוי מאפשר הדמיה עמוקה יותר לתוך הספרואיד עם אובדן אור מינימלי. תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של ספרואיד מלנומה אנושית של FUCCI בהגדלה של פי 10 ו-NA נמוך יותר (0.4), המאפשר הדמיה בעומק z גבוה יותר עם אובדן אות מינימלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: לתמיסת ניקוי יש השפעה מינימלית על גודל הספרואידים. (A) התפלגות גודל הספרואידים ההתחלתי (קוטר שווה ערך) בג'ל PBS (n = 12 ספרואידים). (B) שינוי קיפול בקוטר לאורך זמן מאז הוספת תמיסת הסליקה. ב-0 שעות, הספרואידים נמצאים בג'ל PBS בלבד. (C) התפלגות שינויי הקפל בקוטר ב-12 שעות, 24 שעות ו-72 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרט 1: עיבוד תלת-ממדי של ספרואיד FUCCI מוכתם ב-DRAQ7. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

אולימפוס תרם לעלויות הפרסום.