הביופסיה הנוזלית חוללה מהפכה בגישה שלנו למחקרים תרגומיים אונקולוגיים, כאשר איסוף הדגימות, האיכות והאחסון היוו שלבים מכריעים ליישום הקליני המוצלח שלה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מתוקנן ומאומת ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם, שניתן ליישם ברוב מעבדות המחקר התרגומיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול קדם-אנליטי של ביופסיה נוזלית סטנדרטית ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם
במאמר זה
סיכום
תקציר
המונח ביופסיה נוזלית (LB) מתייחס למולקולות כגון חלבונים, דנ"א, רנ"א, רנ"א, תאים או שלפוחיות חוץ-תאיות בדם ובנוזלי גוף אחרים שמקורם בגידול הראשוני ו/או הגרורתי. LB התגלתה כעמוד תווך במחקר תרגומי והחלה להפוך לחלק מהפרקטיקה האונקולוגית הקלינית, המספקת חלופה זעיר פולשנית לביופסיה מוצקה. ה- LB מאפשר ניטור בזמן אמת של גידול באמצעות מיצוי דגימה זעיר פולשנית, כגון דם. היישומים כוללים גילוי מוקדם של סרטן, מעקב אחר מטופלים לגילוי התקדמות המחלה, הערכה של מחלה שיורית מינימלית, וזיהוי פוטנציאלי של התקדמות מולקולרית ומנגנון עמידות. על מנת להשיג ניתוח אמין של דגימות אלה שניתן לדווח עליהן במרפאה, יש לשקול בזהירות את ההליכים הקדם-אנליטיים ולעקוב בקפדנות. איסוף דגימות, איכות ואחסון הם שלבים חיוניים שקובעים את התועלת שלהם ביישומים במורד הזרם. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים סטנדרטיים ממודול העבודה שלנו בביופסיה נוזלית לאיסוף, עיבוד ואחסון דגימות פלזמה וסרום לניתוח ביופסיה נוזלית במורד הזרם בהתבסס על דנ"א ללא מחזור הדם. הפרוטוקולים המוצגים כאן דורשים ציוד סטנדרטי והם גמישים מספיק כדי להיות מיושמים ברוב המעבדות המתמקדות בהליכים ביולוגיים.
מבוא
המונח "ביופסיה נוזלית" הוגדר בשנת 20101 כנוכחות של מולקולות (למשל, חלבון, חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA), חומצה ריבונוקלאית (RNA)), תאים או שלפוחיות חוץ-תאיות (למשל, אקסוזומים) בדם ובנוזלי גוף אחרים שמקורם בגידול הראשוני. השימוש בדגימות ביופסיה נוזלית חולל מהפכה במחקר האונקולוגי התרגומי, שכן ביופסיות רקמות, המוגבלות לאזור מסוים ברגע מסוים, עלולות להחמיץ שיבוטים רלוונטיים בשל הטרוגניות הגידול. בנוסף, ביופסיה נוזלית ממלאת תפקיד רלוונטי בסוגי גידולים שבהם הרקמה הראשונית נדירה או אינה נגישה, שכן היא עשויה למנוע ביופסיה פולשנית, ולהפחית עלויות וסיכון לחולים. יתר על כן, המאפיינים המולקולריים של הגידול מתפתחים ללא הרף בעיקר בשל לחץ הטיפול, ודגימות ביופ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אישור אתי מוקדם התקבל מהמרכזים המשתתפים לפני הפקת דגימות הדם. הפרוטוקולים הבאים לבידוד סרום ופלזמה בוצעו בהתאם לעקרונות האתיים למחקר ביו-רפואי.
הערה: שיקולים קודמים לפני תחילת הפרוטוקול מובאים כאן. נדרש אישור אתי מוקדם לשימוש בדגימות אנושיות במחקר ביו-רפואי, בהסכמה מדעת מתאימה. ארון בטיחות ביולוגית מדרגה II נדרש כדי לטפל בדגימות דם. יש ללבוש מעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים לאורך כל ההליך כדי למנוע זיהום על ידי פתוגנים הנישאים בדם. נדרש מינימום של 30 דקות לעיבוד דגימות סרום. לאחר שאיבת הדם בצינורות ללא נוגדי קרישה, יש לשמור על טמפרטורת החדר (RT) במשך 30-45 דקות כדי לאפשר היווצרות קרישי דם. לפחות 40 דקות נדרשות להכנת פלזמה, ויש לעבד דגימות תוך....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר צנטריפוגה של צינורות הדם ללא נוגדי קרישה, הפאזה העליונה נראית צהובה בהירה ומתאימה לשבר הסרום (איור 2). חלק זה מוסר בקפידה ומועבר לניתוח הבא.
המוליזה עשויה להיות נוכחת בחלק הפלזמה או הסרום, והפאזה העליונה תהיה בעלת מראה אדמדם, מה שמעיד על נוכחות ומידת ההמוליזה (איור 3).
לאחר צנטריפוגה של צינורות EDTA, מספר שלבים או שכבות יהיו גלויים; השלב העליון (צהוב חיוור) הוא שבר הפלזמה, המהווה 55% מנפח הדם הכולל; המ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לביופסיה הנוזלית יש יישומים פוטנציאליים רבים בזמנים שונים במהלך ניהול הסרטן. ראשית, באבחון כדי לזהות סמנים מולקולריים של גידולים שיצביעו על נוכחות של נגע פוטנציאלי בגידול שעשוי להיחקר עוד יותר מבחינה קלינית. שנית, במהלך הטיפול לניטור בזמן אמת של המחלה, הערכת התגובה המולקולרית של הטיפול, אבולוציה קלונלית וגילוי מוקדם של הישנות המחלה או עמידות לטיפול. לבסוף, לאחר הטיפול הכירורגי, ככלי לזיהוי מחלה שיורית מינימלית. האגודה האירופית לאונקולוגיה רפואית (ESMO) פרסמה לאחרונה הנחיות ליישום בדיקות מוטציות ctDNA בסרטן ריאה גרורתי של.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ביאטריס בלוסיו (BB): BB קיבלה כבוד על תפקיד הדוברת, הייעוץ או הייעוץ מאמג'ן, אסטרה-זנקה, ביוקרטיס, יאנסן, מרק-סרונו, נוברטיס, קיאג'ן, רוש דיאגנוסטיקה, רוש פארמה, תרמופישר, פייזר ו-BMS. שרה לופס-טרואלה (SL): SL קיבלה תואר כבוד על תפקיד הדוברת, הייעוץ או הייעוץ של אסטרה-זנקה/דאיצ'י-סנקיו, MSD, נוברטיס, פייזר, רוש פארמה, גיליאד, לילי, פייר פברה, סיגן, גלקסו סמית'קליין ו-Veracyte. נוליה טרזונה (NT): NT קיבלה תואר כבוד על תפקיד הדוברת, הייעוץ או הייעוץ מאמג'ן, פייזר, מרק-סרונו, Servier, SEOM ו-ESMO. חוויאר הרננדז-לוסה (JHL): קיבל תואר כבוד על תפקיד הדובר, הייעוץ או הייעוץ של אסטרה-זנקה, יאנסן, נוברטיס, רוש דיאגנוסטיקה, רוש פארמה, תרמופישר, לילי ודיאצ'וטיקה. רודריגו טולדו (RT) מדווח על קבלת מענקי מחקר הקשורים למחקר זה מנוברטיס ומענקי מחקר שאינם קשורים למחקר זה מ-AstraZeneca ו-Beigene. לשאר המחברים אין גילויים לגבי כתב היד.
תודות
ברצוננו להודות לרשת המחקר הביו-רפואי בסרטן (CIBERONC) על תמיכתם ועל מענק הפרויקט הבא: LB CIBERONC PLATFORM: פלטפורמת CIBERONC לתקנון וקידום ביופסיה נוזלית. PI רודריגו טולדו, (CIBERONC), 2019-2021.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 מ"ל צינורות אפנדורף | Eppendorf | 0030 120.086 | ניתן להשתמש בכל צינורות/ציוד סטנדרטי |
| 10 מ"ל פיפטות חד פעמיות סרולוגיות | BIOFIL | GSP010010 | ניתן להשתמש בכל צינורות/ציוד סטנדרטי 10 |
| מ"ל Vacutainer K2 EDTA צינור | Becton Dickinson | 367525 | צינורות אלה יכולים לשמש לאיסוף פלזמה |
| 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן | BIOFIL | CFT411150 | ניתן להשתמש בכל צינורות/ציוד סטנדרטי |
| ואקוטיינר BD 3.5 מ"ל ללא נוגד קרישה | Becton Dickinson | 368965 | ניתן להשתמש בצינורות של 8.5 או 3.5 מ"ל לאיסוף סרום |
| בקבוקון קריוגני 4 מ"ל פוליפרופילן, תחתית עגולה, | 430662 קורנינג | ניתן להשתמש בכל צינורות/ציוד סטנדרטי ניתן להשתמש ב-4 | |
| מ"ל Vacutainer K2 EDTA צינור | Becton Dickinson | 367864 | ניתן להשתמש בצינורות אלה לאיסוף פלזמה |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | מספר שיטות כימות זמינות עם a יישום ספציפי עבור cfDNA |
| 5 מ"ל פיפטות חד פעמיות סרולוגיות | BIOFIL | GSP010005 | ניתן להשתמש בכל צינורות/ציוד סטנדרטי |
| 8.5 מ"ל BD Vacutainer שפופרת ללא נוגד קרישה | Becton Dickinson | 366468 | ניתן להשתמש בצינורות של 8.5 או 3.5 מ"ל לצנטריפוגה לאיסוף סרום |
| , המסוגלת ל-~3000 x g עם רוטור דלי נדנדה | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | ניתן להשתמש בכל צינורות/ציוד סטנדרטיים |
| קופסאות אחסון מקפיא עבור 1– 4 בקבוקונים מ"ל קריוגניים | קורנינג | 431120 | יש צורך בקופסאות אלה בעת שימוש בבקבוקונים של 4 מ"ל לאחסון |
| קצות פיפטה p1000 | קורנינג | 4809 | ניתן להשתמש בכל צינורות/ציוד סטנדרטי |
| חומצות גרעין במחזור QIAamp | Qiagen | 55114 | ניתן להשתמש בכל ערכה זמינה מסחרית הספציפית לבידוד cfDNA עם פרוטוקול זה לבדיקת דם. |
| סטרק צינורות DNA BCT CE נטולי תאים 10 מ"ל | פס | 218997 | ניתן להשתמש בצינורות אלה לאיסוף פלזמה |
| מקפיא טמפרטורה (-80 ° ג) | ESCO | 2180104 | ניתן להשתמש בכל צינורות/ציוד סטנדרטי |
מקורות
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
