מאמר שיטה

בחירה חוץ גופית של Aptamers כדי להבדיל וירוסים זיהומיים ולא זיהומיים

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64127

⸱

7 בספטמבר 2022

 ,  ,  , 
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מספקים פרוטוקול שניתן ליישם באופן כללי על אפטמרים נבחרים הנקשרים לווירוסים זיהומיים בלבד ולא לווירוסים שהפכו ללא מדבקים בשיטת חיטוי או לכל וירוסים דומים אחרים. זה פותח את האפשרות לקבוע את מצב ההדבקה בבדיקות ניידות ומהירות.

תקציר

לזיהומים בנגיף יש השפעה גדולה על החברה; רוב שיטות הגילוי מתקשות לקבוע אם נגיף שזוהה הוא מדבק, מה שגורם לעיכובים בטיפול ולהתפשטות נוספת של הנגיף. פיתוח חיישנים חדשים שיכולים ליידע על יכולת ההדבקה של דגימות קליניות או סביבתיות יעמוד באתגר שלא נענה. עם זאת, מעט מאוד שיטות יכולות להשיג מולקולות חישה שיכולות לזהות וירוס זיהומי שלם ולהבדיל אותו מאותו וירוס שהפך ללא מדבק בשיטות חיטוי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבחירת אפטמרים שיכול להבחין בין וירוסים זיהומיים לעומת וירוסים לא זיהומיים באמצעות אבולוציה שיטתית של ליגנדות על ידי העשרה מעריכית (SELEX). אנו מנצלים שתי תכונות של SELEX. ראשית, SELEX יכול להיות מותאם אישית כדי להסיר מטרות מתחרות, כגון וירוסים לא זיהומיים או וירוסים דומים אחרים, באמצעות בחירה נגדית. בנוסף, הנגיף כולו יכול לשמש כמטרה עבור SELEX, במקום, למשל, חלבון פני השטח הנגיפי. וירוס שלם SELEX מאפשר בחירה של aptamers שנקשרים במיוחד למצב המקורי של הנגיף, ללא צורך לשבש את הנגיף. שיטה זו מאפשרת אפוא לקבל סוכני זיהוי על בסיס הבדלים פונקציונליים בפני השטח של פתוגנים, אשר אינם צריכים להיות ידועים מראש.

מבוא

להידבקות בנגיף יש השפעות כלכליות וחברתיות עצומות ברחבי העולם, כפי שהתברר יותר ויותר ממגפת הקורונה האחרונה. אבחון מדויק בזמן הוא בעל חשיבות עליונה בטיפול בזיהומים ויראליים תוך מניעת התפשטות וירוסים לאנשים בריאים. בעוד שיטות רבות לזיהוי וירוסים פותחו, כגון בדיקות PCR1,2 ו inmunoassays3, רוב השיטות בשימוש כיום אינן מסוגלות לקבוע אם הנגיף שזוהה הוא באמת מדבק או לא. הסיבה לכך היא שנוכחותם של רכיבי הנגיף בלבד, כגון חומצת גרעין נגיפית או חלבונים, אינה מעידה על כך שהנגיף השלם והמדבק קיים, ורמות של סמנים ביולוגיים אלה הראו מתאם גרוע עם הדבקה 4,5,6. לדוגמה, RNA נגיפי, המשמש בדרך כלל לבדיקות COVID-19 מבוססות PCR הנוכחיות, יש רמות נמוכות מאוד בשלבים המוקדמים של ההדבקה כאשר החולה מדבק, בעוד שרמת ה- RNA לעתים קרובות עדיין גבוהה מאוד כאשר החולים החלימו מהזיהום ואינם מדבקים עוד 7,8. החלבון הנגיפי או הסמנים הביולוגיים של האנטיגן עוקבים אחר מגמה דומה, אך בדרך כלל מופיעים אפילו מאוחר יותר מהרנ"א הנגיפי ולכן הם אפילו פחות מנבאים הדבקה 6,9. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פותחו כמה שיטות שיכולות ליידע על מצב ההדבקה של הנגיף, אך מבוססות על טכניקות מיקרוביולוגיה של תרבית תאים הדורשות זמן רב (ימים או שבועות) כדי להשיג תוצאות 4,10. לפיכך, פיתוח חיישנים חדשים שיכולים ליידע על יכולת ההדבקה של דגימות קליניות או סביבתיות יכול למנוע עיכובים בטיפול והתפשטות נוספת של הנגיף. עם זאת, מעט מאוד שיטות יכולות להשיג מולקולות חישה שיכולות לזהות ויריון זיהומי שלם ולהבדיל אותו מאותו וירוס שהפך ללא מדבק.

בהקשר זה, aptamers מתאימים במיוחד ככלי ביומולקולרי ייחודי11,12,13,14. Aptamers הם מולקולות DNA או RNA קצרות וחד-גדיליות עם רצף נוקלאוטידים ספציפי המאפשר להן ליצור קונפורמציה תלת-ממדית ספציפית כדי לזהות מטרה בעלת זיקה וסלקטיביות גבוהה15,16. הם מתקבלים על ידי תהליך בחירה קומבינטורי שנקרא אבולוציה שיטתית של ליגנדות על ידי העשרה מעריכית (SELEX), הידוע גם בשם בחירת מבחנה, המתבצעת במבחנות עם ספריית דגימת DNA אקראית גדולה של 10 14-1015 רצפים17,18,19. בכל סבב של תהליך איטרטיבי זה, מאגר הדנ"א נתון תחילה ללחץ ברירה באמצעות דגירה עם המטרה בתנאים הרצויים. כל הרצפים שאינם קשורים למטרה מוסרים לאחר מכן, ומשאירים מאחור רק את הרצפים המעטים שמסוגלים להיקשר בתנאים הנתונים. לבסוף, הרצפים שנבחרו בשלב הקודם מוגברים על ידי PCR, מעשירים את אוכלוסיית המאגר ברצפים הפונקציונליים הרצויים לסבב הבחירה הבא, והתהליך חוזר על עצמו. כאשר הפעילות של מאגר הבחירה מגיעה לרמה (בדרך כלל לאחר 8-15 סבבים), הספרייה מנותחת על ידי ריצוף DNA כדי לזהות את הרצפים המנצחים המפגינים את האהדה הגבוהה ביותר.

ל-SELEX יתרונות ייחודיים שניתן לנצל כדי להשיג סלקטיביות מוגברת מול יעדים דומים אחרים20,21, כגון למצב ההדבקה של הנגיף 22. ראשית, ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגים שונים של מטרות לבחירה, החל ממולקולות קטנות וחלבונים ועד פתוגנים שלמים ותאים16. לכן, כדי להשיג אפטמר שנקשר לווירוס מדבק, וירוס שלם יכול לשמש כמטרה, במקום חלבון פני השטח הנגיפי19. וירוס שלם SELEX מאפשר בחירה של aptamers שנקשרים במיוחד למצב המקורי של הנגיף, ללא צורך בשיבוש של הנגיף. שנית, SELEX יכול להיות מותאם אישית כדי להסיר מטרות מתחרות 21,23, כגון וירוסים דומים אחרים או וירוסים מומתים שאינם זיהומיים, באמצעות שלבי בחירה מונה בכל סבב של בחירה22. במהלך שלבי בחירת המונה, מאגר הדנ"א נחשף למטרות שעבורן אין צורך בקשירה, וכל הרצפים שנקשרים מושלכים.

בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול שניתן ליישם באופן כללי לבחירת אפטמרים הנקשרים לווירוס מדבק אך לא לאותו וירוס שהפך ללא מדבק על ידי שיטת חיטוי מסוימת או לווירוסים קשורים אחרים. שיטה זו מאפשרת לקבל סוכני זיהוי על סמך הבדלים פונקציונליים של פני השטח של הנגיף, אשר אינם צריכים להיות ידועים מראש, ובכך מציעה יתרון נוסף לאיתור פתוגנים חדשים או עבור מחלות שלא נחקרו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים ומאגרים

  1. הכינו 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) על ידי הוספת 0.9 M Tris-base, 0.9 M חומצה בורית, 20 mM EDTA (מלח דיסודיום) ומים נטולי יונים, לנפח סופי של 1 L. ערבבו עד שכל הרכיבים מומסים.
  2. הכינו תמיסת מלאי פוליאקרילאמיד 10% דנטורינג באופן הבא. בבקבוק זכוכית של 250 מ"ל, הוסף 120 גרם של אוריאה (8 M), 25 מ"ל של 10x TBE, 62.5 מ"ל של 40% תמיסת אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1), ומספיק מים מזוקקים כדי להגיע לנפח הסופי של 250 מ"ל. מערבבים עד שכל הרכיבים מומסים.
  3. הכן מאגר טעינה כפול באופן הבא. בצינור של 50 מ"ל, הוסף 21.636 גרם של אוריאה (8 M), 1.675 גרם של EDTA (1 mM) ו- 4.5 מ"ל של 10x TBE. ממלאים עד 45 מ"ל במים מזוקקים ומערבבים עד שכל הרכיבים מומסים.
  4. הכן את מאגר המיצוי על ידי הוספת 100 mM נתרן אצטט ו 1 mM EDTA (מלח דיסודיום). הגדר את ה- pH הסופי ל- 5.
  5. הכינו פתרונות משקעים אתנול כדלקמן. הכינו 3 M נתרן אצטט, להתאים pH 5.2, ולאחסן ב 4 ° C. הכינו 70% אתנול v/v ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הכינו 100% אתנול ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
  6. הכן 500 מ"ל של מאגר SELEX המכיל 1x PBS, 2.5 mM MgCl 2 ו- 0.5 mM CaCl2. התאם ל- pH 7.4. הכינו 100 מ"ל של חיץ SELEX עם 8 M אוריאה על ידי הוספת 1x PBS, 2.5 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl2 ו- 8 M אוריאה. התאם ל- pH 7.4.
    הערה: הבחירה במאגר SELEX היא קריטית כדי להבטיח שה-aptamer שנבחר יעבוד על הדגימה הסופית שבה יוחל ה-aptamer. לדוגמה, aptamers ספציפיים SARS-CoV-2 ישמשו דגימות ביולוגיות (למשל, רוק או מקלוני nasopharynges). לכן, חשוב לבחור ריכוזי יונים, pH וחיץ המחקים באופן הדוק תנאים אלה בדגימות הביולוגיות המיועדות.
  7. הכינו את חיץ הכריכה והכביסה באופן הבא. בצינור של 50 מ"ל, הכינו 5 mM Tris, 0.5 mM EDTA (מלח דיסודיום) ו-2 M NaCl. כוונן ל- pH 7.5.

2. תכנון וסינתזה של ספריית DNA ופריימרים

  1. עצב את ספריית ssDNA הראשונית ואת הפריימרים עם הקריטריונים הבאים (ראה טבלה 1 לדוגמה ספריית ssDNA וערכת פריימרים, כאשר N מציין מיקום נוקלאוטיד אקראי).
    1. ודא שהספרייה מכילה אזור אקראי מרכזי של 35 עד 60 נוקלאוטידים שמשני צדדיו שני רצפים קבועים בקצוות 3' ו- 5' המשמשים כאזורי פריימר להגברה. אורך ספרייה טיפוסי הוא 45 נוקלאוטידים אקראיים.
    2. ודא שהפריימר ההפוך מכיל שינוי ביוטין כדי להפריד ssDNA ממוצרי PCR דו-גדיליים מוגברים באמצעות חרוזים מצופים סטרפטווידין במהלך תהליך הבחירה במבחנה .
  2. רכשו את אוליגוס הדנ"א ממקורות מסחריים עם טיהור התפלה סטנדרטי. לטהר את ספריית ssDNA ואת הפריימרים על ידי 10% אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורינג (dPAGE), ואחריו משקעים אתנול על פי נהלים סטנדרטיים24.
    זהירות: מונומר אקרילאמיד ואתידיום ברומיד הם כימיקלים מסוכנים (מסרטנים בבני אדם), לכן יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים (מעילי מעבדה, כפפות והגנה על העיניים) בעת ביצוע PAGE. במידת האפשר, הימנעו משימוש באתידיום ברומיד והחליפו אותו בצבע בטוח יותר.
    הערה: ניתן להזמין את האוליגוס עם טיהור HPLC כדי להימנע מביצוע שלב טיהור זה, אם כי פעולה זו לא תסיר אוליגונוקלאוטידים קצרים באותה יעילות.
  3. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להשהות מחדש ssDNA לאחר משקעים אתנול עד לריכוז הרצוי (100 מיקרומטר). קבע את ריכוז ספריית ssDNA ופריימרים על ידי ספיגת UV ב λ = 260 ננומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
  4. רכוש פריימר הפוך ללא שינוי לשימוש להכנת ספריית ריצוף בתפוקה גבוהה וכימות qPCR.

3. דגימות וירוס זיהומיות ולא זיהומיות

זהירות: דגימות הנגיף הזיהומי והלא זיהומי הן דגימות ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) הדורשות טיפול נוסף כדי לטפל בהן בבטחה וכראוי. כל שלבי ההליך הכוללים דגימות אלה חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית, או שתמיסת הנגיף חייבת להיות במיכל אטום (למשל, צינורות פלסטיק סגורים).

  1. להשיג פתרון מלאי של וירוסים זיהומיות או להכין אותם, בעקבות הפרוטוקול המתאים עבור כל וירוס. הפסאודו-וירוסים SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 ו-H5N1 המשמשים כאן סופקו על ידי מעבדתו של פרופ' ליג'ון רונג (UIC) במאגר PBS, והוכנו בהתאם לפרוטוקולים המדווחים22,25,26.
    הערה: עבור וירוסים הדורשים מתקני בטיחות ביולוגית ברמה 3 כדי להתמודד עם הנגיף הזיהומי השלם, ניתן לעבוד עם פסאודו-וירוסים. וירוס פסאודוטיפי נוצר מלנטיוירוס (HIV) המציג את חלבוני פני השטח של הנגיף בתוך מעטפת הנגיף, ובכך מחקה באופן הדוק את פני השטח ואת מנגנון הכניסה של הנגיף, אך פגום בשכפול נגיפי מתמשך.
  2. השג תמיסת מלאי וירוסים לא זיהומית או הכן אותה על ידי ביצוע הליך החיטוי. מלאי הפסאודו-וירוס הבלתי פעיל של SARS-CoV-2 (p-SARS-CoV-2) המשמש כאן סופק על ידי מעבדת פרופ' רונג (UIC) במאגר PBS, והפרוטוקול שדווח בעבר שימש להשבתת UV22.
    הערה: במידת האפשר, בצע בדיקה כדי לבדוק את ההדבקה של הנגיף כדי לוודא שהווירוס הושבת לחלוטין.
  3. כימות מניות הנגיף
    1. כמת את הנגיף באמצעות בדיקת פלאק על פי נהלים סטנדרטיים27,28,29. בדיקה זו לא רק מאפשרת לכמת את הנגיף, אלא גם מציינת את מצב ההדבקה של הנגיף, המאשרת את ריכוז הנגיף המדבק.
    2. עבור פסאודו-וירוסים או וירוסים שבהם בדיקת פלאק אינה זמינה, כמת את הנגיף באמצעות ערכת ELISA כמותית זמינה מסחרית.
    3. הכן 1 x 108 עותקים / מ"ל של פתרון מלאי עבור p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 ו- p-H5N1. יש להפריד כל תמיסת מלאי באליציטוטים המכילים 50 μL כל אחד ולשמור על טמפרטורה של -80°C. הפשירו אליקוט חדש לפני כל ניסוי.

4. בחירת מבחנה או תהליך SELEX: סבב ראשוני

הערה: עבור כל השלבים באמצעות וירוס זיהומיות, עבוד בארון BSL2.

  1. נטרל את ספריית ssDNA. קח 10 μL של 100 μM של ספריית ssDNA (1 nmol) וערבב עם 240 μL של מאגר SELEX. מחממים ב 95 ° C במשך 15 דקות באמבטיה יבשה, ולאחר מכן מניחים את הצינור על קרח במשך 15 דקות.
  2. לדגור על ספריית ssDNA עם הנגיף המדבק (שלב הבחירה החיובית) כדלקמן. ערבב 250 μL של ספריית ssDNA במאגר SELEX משלב 4.1 עם 50 μL של וירוס זיהומי (1 x 108 עותקים / מ"ל). יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  3. חסום את האתרים הלא ספציפיים במסנני צנטריפוגות באופן הבא. בזמן ההמתנה לשלב 4.2, הכינו את מסנני הצנטריפוגות לשלבים הבאים.
    1. הוסף 400 μL של 1 mM T20 sequence (טבלה 1) לכל מסנן צנטריפוגות 0.5 מ"ל שישמש - מסנן צנטריפוגות אחד עם חיתוך של 100 kDa ואחד עם חיתוך של 10 kDa.
    2. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה במהירות של 14,000 x גרם למשך 10 דקות כדי להסיר את תמיסת T20 מהמסנן. שטפו 3x עם חיץ SELEX כדי להסיר רצפי T20 עודפים.
  4. שטפו רצפים לא מאוגדים באופן הבא. הוסף את התערובת המודגרת בשלב 4.2 למסנן הצנטריפוגות והצנטריפוגות החסומים של 100 kDa במהירות של 14,000 x גרם למשך 10 דקות. יש לשטוף 3x, להוסיף 400 μL של חיץ SELEX וצנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות. שמור את השבר במסנן והשמט את הזרימה.
  5. רצפים קשורים כמתואר להלן.
    1. שנה את צינור האיסוף של מסנן הצנטריפוגות והוסף 300 μL של מאגר SELEX המכיל 8 M אוריאה למסנן הצנטריפוגות בשלב 4.4. חממו את מסנן הצנטריפוגות בטמפרטורה של 95°C למשך 15 דקות באמבט יבש ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה של 14,000 x גרם למשך 10 דקות.
    2. אסוף את השבר שזרם דרך המסנן המכיל את הרצפים המדוללים. חזור על הפעולה עוד שלוש פעמים. עבדו בארון BSL2 ושטפו את כל החומרים עם אקונומיקה של 10% כדי להשבית את הנגיף לפני השלכת החומרים.
  6. לרכז ולהפיל כדלקמן. הוסף את הפתרון שנאסף ב 4.5 למסנן צנטריפוגות חסום של 10 kDa . צנטריפוגה ברזולוציה של 14,000 x גרם למשך 15 דקות. מחק את המקטע שזרם דרך המסנן.
    הערה: מכיוון שהנגיפים נשמרים ומנוטרלים עם אוריאה של 8 M במסנן בשלב הקודם, אין צורך לבצע שלב זה והשלבים הבאים בארון הבטיחות הביולוגית. יש לחזור על הליך זה אם משתמשים בצינור צנטריפוגה של 0.5 מ"ל עד שכל התמיסה נאספת כמו בשלב 4.5, 1.2 מ"ל זורם דרך המסנן.
  7. יש לשטוף 3x עם 300 μL של מאגר SELEX כדי להסיר את האוריאה על ידי צנטריפוגה של 14,000 x גרם למשך 15 דקות. מחק את המקטע שזרם דרך המסנן. לשחזר את הפתרון במסנן על ידי הפיכתו בצינור איסוף נקי צנטריפוגה במשך 5 דקות.
  8. מדוד את הנפח הסופי של התמיסה המשוחזרת מ 4.7 באמצעות פיפטה בצינור פלסטיק. פתרון זה נקרא R ia, כאשר i מתאים למספר העגול. בדרך כלל, נפחים בין 30 μL ל 50 μL מתקבלים. קח 1 μL של ssDNA מדולל כדי לכמת את כמות ה- DNA על ידי qPCR.
    הערה: זוהי נקודת השהיה אפשרית, שבה R1דגימה יכול להישמר ב -20 ° C כדי להמשיך בזמן אחר.
  9. בצע הגברה של PCR כמתואר להלן.
    1. בסבב הראשון, קחו 90% מה-R1מדגם כתבנית PCR. בסבבים הבאים, קח 60% מהנפח הכולל בשלב 4.8 כדי לבצע PCR ואחסן את החלק השני ב -20 ° C.
    2. הגדר תגובת PCR של 50 μL כאשר הריכוז הסופי הבא הוא בעל הריכוז הסופי שצוין: 1x PCR reaction buffer, 200 μM dNTPs, 10 μL של תבנית DNA(R 1 דגימה), 200 ננומטר כל פריימר, ו 1.25 U פולימראז (2.5 U/μL מלאי).
    3. מטב את תנאי ה-PCR, כולל מספר מחזורים וטמפרטורת חישול עבור כל קבוצה של פריימרים וספריית ssDNA. הימנעו משימוש במחזורים רבים מדי, אשר ייצרו תת-תוצרי PCR לא רצויים כגון פריימר-דימר. בדוק טמפרטורות חישול שונות בהתבסס על טמפרטורת ההתכה של הפריימרים.
    4. הפעל את ה- PCR בתנאים אופטימליים ב- 95 ° C למשך 5 דקות ולאחר מכן 18 מחזורים של דקה אחת ב- 95 ° C, 30 שניות ב- 52 ° C ודקה אחת ב- 72 ° C, עם שלב הארכה סופי ב- 72 ° C למשך 10 דקות, כדי להשיג את מאגר dsDNA.
      הערה: זוהי נקודת עצירה אפשרית נוספת, שבה ניתן לשמור את מוצר ה- PCR ב -20 ° C כדי להמשיך במועד אחר.
  10. שחזור ssDNA באמצעות חרוזים מגנטיים מהונדסים סטרפטווידין.
    1. קח 80% ממוצר ה- PCR. אחסן את החלק הנותר ב -20 °C.
    2. לפצל את מוצר PCR ב aliquots של 50 μL ולהוסיף אותם צינורות microfuge המכילים 50 μL של חרוזים מגנטיים מהונדסים סטרפטווידין (MB). יש לדגור במשך 30 דקות עם תסיסה קלה (למשל, להשתמש בשייקר מסתובב) בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את צינור המיקרופוגה על המדף המגנטי כדי לבודד את ה-MB ולהסיר את הסופרנאטנט על ידי פיפטינג (זה חייב להיות פתרון ברור).
    3. יש לשטוף על ידי הוספת 200 μL של חיץ קשירה ושטיפה לצינור. הסר את הצינור מהמדף המגנטי, הקש על הצינור והשהה מחדש את ה- MB לתמיסה הומוגנית על ידי צנרת. החזירו את צינור המיקרופוגה למדף המגנטי כדי לבודד את ה-MB ולהסיר את הסופרנאטנט על ידי פיפטציה. חזרו על שלב הכביסה פעמיים.
    4. לאחר השלמת הכביסה, יש להשהות מחדש את ה-MB ב-100 μL של מאגר SELEX ולחמם את התמיסה ל-95°C למשך 10 דקות. הניחו מיד את הצינור במדף המגנטי לפני שהצינור מתקרר וקחו את הסופרנאטנט המכיל את מאגר ssDNA. חזור על שלב התאוששות זה, והוסף 50 μL של מאגר SELEX.
  11. מדוד את הנפח הסופי של החלק המשוחזר מ- 4.10 באמצעות פיפטה. שבר זה נקרא R ix, כאשר i מתאים למספר העגול. באופן כללי, נפחים בין 140 ל 150 μL מתקבלים. קח 1 μL של R1x כדי לכמת את כמות ה- DNA על ידי qPCR.

5. סבבי הבחירה הבאים

  1. לנטרל את מאגר ssDNA. קח 60% מהדגימה R1x וערבב עם 50 μL של מאגר SELEX. מחממים ב 95 ° C במשך 15 דקות באמבטיה יבשה. מניחים את הצינור על קרח למשך 15 דקות.
  2. לדגור על מאגר ssDNA עם הנגיף הלא זיהומי ווירוסים מפריעים פוטנציאליים אחרים (שלב הבחירה הנגדית). ערבבו את מאגר ssDNA מפורק במאגר SELEX מ-5.1 עם 50 μL של כל וירוס (5 x 109 עותקים / מ"ל; למשל, p-SARS-CoV-2 לא זיהומי, p-SARS-CoV-1 ו-p-H5N1). יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  3. חסום אתרים לא ספציפיים במסנני צנטריפוגות. בזמן ההמתנה לשלב 5.2., הכינו את מסנני הצנטריפוגות לשלבים הבאים. בדרך כלל, השתמש בשני מסנני צנטריפוגות, אחד עם חיתוך של 100 kDa ואחד עם חיתוך של 10 kDa. בצע את אותו הליך כמו ב- 4.3.
  4. שטפו את הרצפים הקשורים לווירוסים שאינם מטרה. הוסף את התמהיל המודגר בשלב 5.2 למסנן צנטריפוגות חסום של 100 kDa . צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ולשחזר את החלק שזורם דרך מסנן הצנטריפוגה. יש לשטוף 2x, להוסיף 100 μL של חיץ SELEX וצנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות. שמור את החלק שזרם דרך המסנן.
  5. לדגור על מאגר ssDNA עם הנגיף המדבק (שלב הבחירה החיובית). קח את 300 μL של חלק משלב 5.4 ולערבב עם 50 μL של הנגיף זיהומיות (1 x 108 עותקים / מ"ל). יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בצע את שלבים 4.4 עד 4.11.

6. מעקב אחר תהליך SELEX

הערה: כדי לפקח על העשרת המאגר, qPCR משמש בשתי דרכים. ראשית, על ידי כימות מוחלט, ניתן לבדוק את העשרת הבריכות (תשואת אלוציה). שנית, על ידי ניטור עקומת ההיתוך, ניתן להעריך את מגוון הבריכות (התכנסות מיני האפטמר)30.

  1. בצע את כל בדיקות ה- qPCR עם נפח תגובה של 10 μL בצלחות 96 באר המיועדות ל- qPCR.
  2. הכינו תערובת qPCR סטנדרטית המכילה 5 μL של תערובת מאסטר, 0.3 μL של 500 ננומטר של כל פריימר ללא תווית, 3.4 μL של H2O, ו 1 μL של תבנית DNA.
    1. הכן דילולים של ספריית ssDNA מטוהרת (שלב 2.3) כדי להפעיל את העקומה הסטנדרטית.
    2. דללו את דגימות הדנ"א כדי להתאים את ריכוזן לעקומה הסטנדרטית. עבור דגימות Ria, הוסף 1 μL של הדגימה ללא דילול ו 1 μL של דילול 1:10 לתערובת qPCR. עבור דגימות Rix, כלול דילול 1:10 או 1:100.
  3. הפעל qPCR על ידי הגדרת הפרוטוקול הבא. ראשית, הגדר שלב דנטורציה ראשוני ב 98 ° C למשך 2 דקות. לאחר מכן, הגדר 40 מחזורים של דנטורציה ב 98 ° C עבור 5 שניות וחישול והרחבה ב 52 ° C במשך 10 שניות. לבסוף, הגדר ניתוח עקומת התכה מ 65 ל 95 ° C. קביעת ערכי מחזור סף (Ct) על-ידי ניתוח סף אוטומטי.
  4. באמצעות העקומה הסטנדרטית, כמת את כמות ssDNA בדגימות R i aו- Rix.
  5. חישוב תפוקת האלוציה ככמות הדנ"א הכבול (מספר השומותב-Ri a) חלקי כמות הדנ"א הראשוני (מספר השומות ב-Ri-1x). התווה את תשואת האלוציה לעומת מספר עגול כדי לראות אם נצפתה העשרה על פני הסיבובים.
  6. התווה את עקומות ההיתוך לסבבים שונים. מעבר לטמפרטורות התכה גבוהות יותר בשיא ליד 75/85 מעלות צלזיוס צפוי ככל שמספר הסבבים יגדל. המשמעות היא שהמגוון של הבריכה מצטמצם.

7. ריצוף בתפוקה גבוהה

  1. התייעץ עם מתקן הריצוף בתפוקה גבוהה לגבי סוגי הרצף וקנה המידה הזמינים, אשר יקבעו את שיטת הכנת הספרייה.
    הערה: החלטה זו תיקח בחשבון הן את אורך הבריכות שיש לרצף (כולל הפריימרים) והן את מספר הבריכות שיש להגיש (באופן כללי, יש לשאוף לפחות 1 x 105-10 6 רצפים לכל בריכה). אם סולם רצף מסוים אינו יכול לקרוא את כל אורך המאגר, ניתן להשתמש ברצף זוגי כדי לקרוא משני קצוות הרצף, בניגוד לקצה יחיד שקורא מקצה אחד בלבד.
  2. בחר ערכה מתאימה הזמינה מסחרית בהתאם לסוג הריצוף, בהתייעצות עם מתקן הריצוף. הכינו מאגרים מרובים של סבבי בחירה המייצגים העשרה גבוהה, בינונית ונמוכה, כמו גם את המאגר הסופי, באמצעות זוג אינדקסים שונים במתאמים לכל מאגר שאפשרו ניתוח מדגמי של כל הסבבים באמצעות נתיב אחד.
    הערה: ניתן להשתמש בהגברה PCR גם כדי לשלב את המתאמים והאינדקסים הדרושים לריצוף בתפוקה גבוהה, אך בדרך כלל עלות זו דומה לערכות המסחריות וביצועיה אינם טובים יותר.
    1. בצע הכנת ספרייה על ידי ביצוע השלבים הבאים: תיקון סופי של DNA מקוטע, קשירת מתאמים והגברת PCR כדי לייצר את הספריות הסופיות.
    2. לטהר את מוצר ה-PCR בחרוזי ניקוי DNA מגנטיים בהתאם להוראות היצרן.
    3. כמת את הדנ"א באמצעות ערכת כימות מבוססת פלואורסצנטיות. הימנע משימוש בשיטות פחות מדויקות, כגון מדידות UV בנפח קטן.
    4. ערבב כמויות שוות בקירוב (לפי כמות DNA, לא לפי נפח) של כל ספריית מאגר המכילה אינדקסים ספציפיים.
    5. בדוק את איכות הספרייה הסופית עם כימות qPCR ומנתח מקטעי DNA. שלב זה מבוצע לעתים קרובות על ידי מתקן הריצוף.
      הערה: צוות מתקן הריצוף יכול לספק מידע שימושי על אופן הכנת הספרייה ואילו בקרות איכות מוצעות. דיון איתם נדרש לפני הכנת הספריות.
  3. שלח את הספרייה הסופית שהוכנה למתקן הרצף בהתאם לדרישותיהם.

8. ניתוח רצף

  1. רוב התוכנות הזמינות לניתוח רצף מיועדות לרוץ בשורת הפקודה במערכת הפעלה לינוקס. עבור מערכי נתונים קטנים, הגדר את מערכת ההפעלה הרצויה של לינוקס והתקן את התוכניות הדרושות במחשב אישי; עבור מערכי נתונים גדולים יותר, ניתוח HTS מופעל על משאבי מחשוב בעלי ביצועים גבוהים או מחשבי על (מומלץ).
    הערה: יהיה צורך בגישה ובהדרכה כדי להשתמש במשאבי מחשוב בעלי ביצועים גבוהים, שהשגתם עשויה להימשך זמן מה. בנוסף, יידרש ידע בסיסי בשימוש בשורת הפקודה של UNIX. משאבים חינמיים רבים על שימוש בסיסי בשורת הפקודה זמינים באינטרנט, וסביר להניח שמשאבי המחשוב יספקו מידע נוסף לשימוש במערכות שלהם.
  2. גש לקבצי הרצף, בדרך כלל בפורמט קובץ FastQ דחוס, באמצעות המידע שסופק על ידי מתקן הרצף.
    1. השתמש בלקוח FTP כדי להעביר את הקבצים למחשב שלך ו/או למשאב המחשוב בעל הביצועים הגבוהים. תוכניות ניתוח רצפים רבות יכולות להשתמש ישירות בקבצים דחוסים, לכן שמור על הקבצים דחוסים, במידת האפשר, כדי להגביל את גודל הקבצים שלהם (קריאות רצף גדולות של רצפים של 50 M+ יכולות לתפוס 100 Gb+ של שטח קובץ כאשר הן אינן דחוסות).
    2. אם יש צורך לבטל דחיסה של קובצי רצף, השתמש בפונקציית gzip שהיא סטנדרטית ברוב התקנות לינוקס. קבל מידע נוסף על gzip והאפשרויות שלו מהמדריך המותקן על ידי הקלדת "man gzip" בשורת הפקודה.
  3. נקה את הרצפים לפני הניתוח על-ידי ביטול הריבוי, הסרת מתאמי הרצף, הסרת קריאות באיכות נמוכה והכללת קריאות בכיוון קדימה ואחורה.
    1. השתמש בתוכנית FastQC31 לאחר כל אחד מהשלבים הבאים כדי לקבל מידע בסיסי על בקרת האיכות על הרצפים כדי להעריך את היעילות של כל שלב ניקוי.
    2. בטל את המולטיפלקס של הרצפים כדי להפריד את כל הרצפים מקובץ קריאה יחיד למאגרים השונים בהתבסס על האינדקסים הכלולים במתאמי הרצף. שלב זה מבוצע לעתים קרובות על ידי מתקן הריצוף, אשר יש להתייעץ כמו ההליך המדויק יהיה תלוי מכונת רצף בשימוש.
    3. הסר את מתאמי הרצף באמצעות תוכנית שורת הפקודה, Cutadapt32. השתמש בפריימרים לבחירה (במקום במתאמי רצף) כקלט במצב מתאם מקושר. השתמש באפשרות --discard-untrimmed כדי להשמיט רצפים שאינם כוללים את פריימרים לבחירה.
    4. הגדר אפשרויות עבור שיעור השגיאה המרבי כך שיתאים למתאמים, והאורך המינימלי והמרבי של רצפים שיש לקבל. אם אתה משתמש בקריאות קצה משויכות, הזן פרמטרים ספציפיים זמינים ותן הן את קבצי הרצף Read 1 והן את Read 2. הגדר פרמטרים נוספים לפי הצורך על-ידי עיון במדריך Cutadapt32.
      הערה: קשירת מתאמי ריצוף לבריכות אינה תלויה בכיוון ותשלב כ-50% מהרצפים בכיוון קדימה ו-50% בכיוון ההפוך. כדי להימנע מאיבוד 50% מהרצפים בכיוון ההפוך, ניתן להריץ את Cutadapt פעם שנייה באמצעות ההשלמה ההפוכה של פריימרי הבחירה כקלט.
    5. (אופציונלי) אם נעשה שימוש ברצף משויך, מזג את הקבצים Read 1 ו- Read 2 עם התוכנית PEAR33.
    6. השתמש בתוכנית FASTX-Toolkit34 כדי להסיר רצפים באיכות נמוכה שיש להם איכות מתחת לסף מסוים בכל נוקלאוטיד . ציון חיתוך איכותי של 30 הוא נקודת התחלה טובה. אם האיכות הכוללת טובה בדרך כלל, ניתן לדלג על שלב זה.
    7. למיזוג קובצי רצף בכיוון ההפוך עם קובצי הכיוון קדימה, השתמשו בפונקציה FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement בקובצי הכיוון ההפוך. לאחר מכן השתמש בתוכנית החתול המובנית (סטנדרטית ברוב התקנות לינוקס) כדי למזג את המשלים קדימה והפוך - הפוך קבצים לקובץ יחיד.
  4. כדי לנתח את ההעשרה של רצפים במאגרי בחירה שונים, השתמש בערכת הכלים לניתוח FASTAptamer35.
    1. השתמש ב- FASTAptamer-Count כדי לספור את מספר הפעמים שכל רצף מופיע. לאחר מכן, דרגו ומיינו את הרצפים לפי שפע. קובץ פלט הספירה נדרש כקלט עבור כל תוכניות FASTAptamer האחרות.
    2. השתמש ב- FASTAptamer-Clust כדי לקבץ את כל הרצפים בקובץ לאשכולות של רצפים קרובים. השתמש בפרמטר "מרחק" כדי להגדיר את מספר מוטציות הנוקלאוטידים הבודדים או האינדלים המורשים לקבץ לצביר.
      הערה: תוכנית FASTAptamer-Clust יכולה להיות יקרה מאוד מבחינה חישובית אם קיים מספר גבוה של רצפים ייחודיים (במיוחד עבור סבבים מוקדמים), אשר עשוי להימשך ימים או אפילו שבועות כדי להשלים באופן מלא. ניתן להשתמש בפרמטר מסנן החיתוך כדי לא לכלול רצפי שפע נמוך באשכולות. באופן כללי, טוב להתחיל עם חתך גבוה יותר, כגון 10 או 5 קריאות למיליון (סל"ד) ולהקטין אותו אם התוכנית מסתיימת במהירות. אם הבריכות הטרוגניות מאוד, ייתכן שלא ניתן יהיה לקבץ את הרצפים בזמן סביר.
    3. השתמש ב- FASTAptamer-Enrich כדי לחשב את ההעשרה של כל רצף הקיים ביותר מסבב אחד של הבחירה. השווה את הסל"ד של הרצף מאוכלוסייה אחת לסל"ד באוכלוסייה אחרת. השתמש בתוכנית Enrich בקבצים Count או Cluster. הפלט הוא קובץ ערך מופרד באמצעות טאבים ( .tsv) שניתן לפתוח בכל תוכנת גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף ומיון קל.
      הערה: תוכנית FASTAptamer-Enrich יכולה גם להיות יקרה מאוד מבחינה חישובית אם קיים מספר גבוה של רצפים ייחודיים. ניתן להשתמש בפרמטר מסנן החיתוך כדי לא לכלול רצפי שפע נמוכים מהפלט כדי למנוע קבצים גדולים מדי לפתיחה בתוכנת גיליון אלקטרוני.
    4. (אופציונלי) אם מאגרים רבים הם הטרוגניים מדי (רצפים ייחודיים רבים ורצפים כפולים מעטים), ייתכן שלא ניתן יהיה להשתמש בתוכניות Clust או Rich. במקרה זה, בצע בדיקת העשרה ידנית באמצעות קובץ הפלט Count אשר ממיין רצפים לפי שפע (הנפוץ ביותר בחלק העליון) ומשנה את שם מזהה הרצף כך שיכלול מידע חשוב כגון RPM.
      1. השתמש בתוכנית "ראש" לינוקס סטנדרטית על קבצי ספירה כדי לקבל רשימה של הרצפים הנפוצים ביותר. לאחר מכן השתמש בתוכנת "grep" הסטנדרטית של לינוקס כדי לחפש בכל אחד מהרצפים הנפוצים ביותר בקבצי Count של כל המאגרים הרלוונטיים האחרים. אם יש התאמות, השתמש במזהה הרצף שהשתנה כדי לקבוע את הסל"ד במאגר זה, כדי לבנות ידנית את מידע ההעשרה.
        הערה: ניתן למצוא סקריפטים עבור כל שלבי ניתוח הרצף בקבצי הקידוד המשלימים 1-11.

9. אימות מחייב Aptamer ובדיקות

  1. מתוך מידע ההעשרה המתקבל באמצעות ניתוח רצפים, זהה רצפי אפטמר מועמדים בהתבסס על רצפים בעלי ההעשרה הרבה ביותר בסבבי הבחירה הבאים ו / או הרצפים הנפוצים ביותר בסבב הבחירה הסופי. בחר מספר רצפי מועמדים שונים (לפחות 10-20) לבדיקות נוספות מכיוון שהעשירים ביותר לא בהכרח יהיו האפטמרים בעלי הביצועים הטובים ביותר.
  2. בצע סינון ראשוני של מועמדים aptamers באמצעות בדיקה מחייבת שניתן לבצע במהירות עבור דגימות מרובות. בדיקת אולטרה-סינון מבוססת עמודות36 או בדיקת אוליגונוקלאוטיד מקושרת אנזים (ELONA) הן שיטות טובות לסינון ראשוני זה.
  3. נתח את הספציפיות והזיקה של הרצפים המראים את פעילות הקישור הטובה ביותר מהסינון הראשוני, באמצעות לפחות שתי בדיקות קישור עצמאיות (למשל, MicroScale Thermophoresis (MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)39, surface plasmon resonance 40, או biolayer interferometry (BLI)41).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מכיוון שניתן להשיג אפטמרים של דנ"א באמצעות SELEX במבחנה15, אסטרטגיית SELEX זו תוכננה בקפידה כדי לכלול הן שלבי ברירה חיוביים לקראת הנגיף המדבק השלם והשלם (כלומר, לשמור על מולקולות הדנ"א שנקשרות לווירוס המדבק), כמו גם שלבי בחירה נגדיים עבור אותו וירוס שהפך ללא מדבק בשיטת חיטוי מסוימת, במיוחד טיפול UV, על ידי השלכת רצפי ה- DNA שיכולים להיקשר לנגיף שאינו זיהומיות. ייצוג סכמטי של תהליך הבחירה מוצג באיור 1.

כתוצאות מייצגות של פרוטוקול זה, בחרנו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

SELEX מאפשר לא רק זיהוי של aptamers עם זיקה גבוהה, בטווח pM-nM 22,43,44,45, אלא גם עם סלקטיביות גבוהה ו tunable . על ידי ניצול הבחירה הנגדית, ניתן להשיג אפטמרים עם סלקטיביות מאתגרת. לדוגמה, קבוצת Li הדגימה את היכולת להשיג רצפים שיכולים להבדיל בין זני חיידקים פתוגניים לזנים שאינם פתוגניים21. כמו כן, Le et al. זיהו aptamer מסוגל להבדיל סרוטיפים של חיידקי סטרפטוקוקוס p...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לגב' לורה מ. קופר וד"ר ליג'ון רונג מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו על אספקת דגימות הפסאודו-וירוס המשמשות בפרוטוקול זה (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), כמו גם לד"ר אלווארו הרננדז וד"ר כריס רייט ממתקן שירותי הדנ"א של מרכז רוי ג'יי קארבר לביוטכנולוגיה באוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין על עזרתם בריצוף בתפוקה גבוהה, וחברים רבים בקבוצת Lu שעזרו לנו בטכניקות בחירה חוץ גופית ואפיון אפטמר. עבודה זו נתמכה על ידי מענק RAPID מהקרן הלאומית למדע (CBET 20-29215) ומענק זרע מהמכון לקיימות, אנרגיה וסביבה באוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין ומכון אילינוי-JITRI (JITRI 23965). א.ס.פ. מודה למלגת פיו באמריקה הלטינית על התמיכה הכספית. אנו מודים גם לקרן רוברט א. וולש (מענק F-0020) על תמיכתה בתוכנית המחקר של קבוצת Lu באוניברסיטת טקסס באוסטין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% אמוניום פרסולפט (APS)BioRad1610700
100% אתנולסיגמא-אולדריץ'E7023
1x PBS ללא סידן ומגנזיוםקורנינג21-040-CM
תמיסת 40% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1)BioRad1610146
Agencourt AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63880DNA חרוזי ניקוי - סעיף 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 יחידת מסנן צנטריפוגליMerckUFC501024ניתוק 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 יחידת מסנן צנטריפוגליMerckUFC510024חתך 100 kDa
חומצה בוריתSigma-Aldrich100165
C1000 מגע Thermal Cycler עם מודול תגובה מהירה כפול 48/48BioRad1851148
סידן כלורידסיגמא-אולדריץ'C4901
CFX Connect מערכת זיהוי PCR בזמן אמתBioRad1855201
אמבטיות יבשות דיגיטליות / מחממי בלוקThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher65001חרוזים מגנטיים שעברו שינוי סטרפטווידין - סעיף 4.9
מלח דיסודיום EDTAסיגמא-אולדריץ'
צינורות מיקרוצנטריפוגה Eppendorf Safe-LockSigma-AldrichT96611.5 מ"ל
Lenti-X p24 ערכת טיטר מהירהTakara Bio USA, Inc.632200ערכת כימות Lentivirus - סעיף 3.3.2.1
מתלה הפרדת MagJET, צינור 12 x 1.5 מ"לThermo ScientificMR02
מגנזיום כלורידSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR סרט איטום צלחות, דבק,BioRadאופטי MSB1001שאינו סופג UV
לג'ל מוכן ג'ל Precast GelsBioRad1658004EDU
Mini-PROTEAN צלחות קצרותBioRad1653308
Mini-PROTEAN צלחות מרווח עם 0.75 מ"מ מרווחים משולביםBioRad1653310
ביולוגיה מולקולרית כיתה מיםLonza51200
Multiplate 96-Well PCR צלחות PCR, פרופיל גבוה, ללא חצאית, שקוףBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA Polymeraseניו אינגלנד BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01ערכת הכנת ספריית רצף שוקת גבוהה - סעיף 7.2.
פיפטמן G (100-1000 ומיקרו; L, 20-200 ומיקרו; L, 2-20 ומיקרו; L ו-0.2-2 ומיקרו; L)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic + Class II, סוג A2 ארונות בטיחות ביולוגיתLabconco4261
Qubit dsDNA BR ערכת בדיקהInvitrogenQ32850מבוססת פלואורסצנטי   dsDNA כימות   ערכת - סעיף 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)תומאס סיינטיפיק1158U43, 1159M44, 1158U40
נתרן אצטטסיגמא-אולדריץ'S2889
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S7653
Sorvall Legend Micro 17R מיקרוצנטריפוגהתרמו סיינטיפיק75002440
SsoFast EvaGreen SupermixBioRad1725201qPCR mastermix - סעיף 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-AldrichT1503
צינורות וכובעים שקופים במיוחד, רצועות של 8צינורות PCRמדעיים בארה"בAB1183
UreaSigma-AldrichU5128
324503 תא טטרה Mini-PROTEAN

מקורות

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678(2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230(2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070(2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334(2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966(2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SELEXDNAqPCR

מאמרים קשורים