יסודות ההיסטולוגיה וזיהוי מוות תאי ברקמת דבורת הדבש

סיכום

שיטות אימונוהיסטוכימיות שימושיות במחקר דבורת הדבש כדי לזהות ולהעריך את רמת האפופטוזיס והנמק בבלוטות האמצע והלוע של דבורים בוגרות.

תקציר

דבורי הדבש (Apis mellifera L.) בתוך הכוורת (אחיות ודבורי כוורת אחרות) ומחוץ לכוורת (foragers) חשופות לשינויי אקלים ומזג אוויר, חומרי הדברה שונים, פתוגנים ותת תזונה, הנכנסים בעיקר דרך הפה ומשפיעים בעיקר על דרכי העיכול של דבורים בוגרות. כדי להבין ולמנוע את ההשפעות של גורמי לחץ חיצוניים ופנימיים כאלה על דבורי הדבש, אחת משיטות המחקר השימושיות היא השיטה האימונוהיסטוכימית. פרוטוקול בסיסי מתואר להכנת בלוטות האמצע (ventriculus) וההיפו-לוע (HPGs) של דבורים בוגרות לניתוח היסטולוגי. מתודולוגיה מפורטת מתוארת כדי להעריך את רמת הנזק לתאים ולהבחין בין נמק למוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס) כתהליך טבעי של התחדשות רקמות. תוצאות הטיפול בדבורת הדבש הבוגרת בחומצה אוקסלית ובחומרי הדברה (קוטל חרקים ואקריציד) וקביעת מוות תאי בחדר וב- HPGs מוצגות. היתרונות והחסרונות של המתודולוגיה נדונים גם הם.

מבוא

דבורי הדבש (Apis mellifera L.) הן, בין שאר מאביקות הבר, המאביקות החשובות ביותר של צמחים חקלאיים. במשך אלפי שנים, הסביבה המשתנה השפיעה על הדבורים להתאים את המורפולוגיה, הפיזיולוגיה, ההתנהגות והעמידות שלהן למספר פתוגנים וטפילים. לכן, דבורי הדבש פיתחו מגוון רחב מאוד של מינים ותת-מינים ברחבי העולם¹. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם ממצאים קודמים, שלפיהם קיימת שונות גנטית במבנה מערכת העיכול של דבורת הדבש, אך גם מצביעות על כך ששינויים במידגוט נובעים מגורמים סביבתיים ^2,3.

מערכת העיכול של דבורת הדבש כוללת שלושה חלקים עיקריים: פורגוט, מידגוט (ventriculus) והינדגו....

פרוטוקול

1. היסטולוגיה בסיסית לחקר דבורת הדבש

1. דיסקציה של רקמת דבורת הדבש
   הערה: לנתיחה של דבורים עובדות, השתמש במיקרוסקופ מנתח עם מקור אור LED. ההגדלה השימושית ביותר היא ~ 20x.
   1. מניפולציה ונתיחה
      1. בזהירות לקחת דבורה עובד עם מלקחיים ולשים אותו על קרח (או לתוך המקפיא ב -20 מעלות צלזיוס) במשך 2 דקות כדי לשתק אותו²². הצמידו את הדבורה לצלחת הפטרי באלכסון דרך החלק האחורי העליון של בית החזה פעמיים, משמאל לימין ומימין לשמאל.
      2. יוצקים חרקים מלוחים כדי לכסות את הגוף. הניחו את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ, התמקדו והתכווננו.
      3. הכינו את המכשירים (ראו טבלת חומרים).
   2. דיסק....

תוצאות

זיהוי מוות תאי במרכז הגוף
דבורים עובדות חדשות (Apis mellifera carnica) מהמכוורת הניסיונית במכון החקלאי של סלובניה בלובליאנה טופלו בנפרד ב-3% חומצה אוקסלית (OA)²³. OA משמש לעתים קרובות בגידול דבורים לבקרת הרס Varroa . לאחר הטיפול, הדבורים העובדות (שלוש מכל קבוצה) היו משותקות על הקרח. את ה-midgut ניתחו וקיבעו אותו ב-10% פורמלין. לאחר מכן התייבשה הרקמה בסדרה של תמיסות אלכוהול ולבסוף הוטמעה בשעוות פרפין. לאחר שנחתכו במיקרוטום למקטעים דקים של 7 מיקרומטר, הוכנו דגימ.......

דיון

באורגניזמים חיים, מוות תאי מוגדר כאפופטוזיס או נמק²⁵ ויכול להיות מלווה באוטופגיה²⁶. ההבדל בין תאים אפופטוטיים לנמקיים הוא שאפופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת ומופיע בתאים רגילים, בעוד נמק מתרחש עקב תנאים קטלניים (למשל, תאונה, מחלה)^27,28. ניתן לזהות אפופטוזיס באמצעות ערכות בדיקה המבוססות על טכניקת TUNEL (זיהוי פיצול DNA על ידי תיוג 3′-הידרוקסיל טרמיני בהפסקות הדנ"א הדו-גדיליות הנוצרות במהלך אפופטוזיס). ערכות שונות .......

חומרים

₂₄

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת 2-פרופנול
ApopTag Peroxidase (זיהוי אפופטוזיס באתר)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; בקרות חיוביות הכלולות ב-S7101
מכסות
מערכת TUNEL קולורימטרית ללא מוצא	Promega	G7360	Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
מיקרוסקופ חיתוך  (לנתיחת דבורים)	קלטת הטבעה של מים
EnVision System ערכת פוספטאז אלקליין	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		אתנול
			95% (או פחות טהור), 90%, 80%
	Dako		הרכבה בינונית
שולחן שיטוח	Leica	HI1220
מלקחיים  (לנתיחת דבורים)	כלי מדע עדינים	11294-00	תקן #4
פורמלין 10%			פורמלדהיד
המטוקסילין	סיגמא-אולדריץ'
HistoChoice סוכן קלירינג	סיגמא-אולדריץ'
מימן פרוקסידאז 3%
אינקובטור	סיכות חרקים BioRad
(לנתיחת דבורים)	Entosphinx	44594	סיכות חרקים נירוסטה – לבן, גודל 2
ISCDDK, AP (ערכת זיהוי מוות תאים באתר, פוספטאז אלקליין)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Lab
מיקרוסקופ אור
	יש לשמור את הקופסה עם השקופיות בניילון נצמד כדי למנוע אבק
NaCl
Paraformaldehyde 4%
Paraplast	Leica
Pasteur פיפטות			1.5 מ"ל; 3 מ"ל
PBS
צלחת פטרי  (לנתיחת דבורים)			מלא עיבוי סיליקון  (קסנטופרן L כחול ונוזל אוניברסלי פלוס מפעיל)
פרוטאינאז K	Merck	21627
תמיסת צלצולים  (לנתיחת דבורים)			7.5 גרם NaCL, 2.38 גרם Na2HPO4, 2.72 גרם KH2PO4, 1 ליטר מים מזוקקים
מספריים  (לנתיחת דבורים)	כלים מדעיים עדינים	1406-09, 14061-09	ישר ומעוקל, 9 ס"מ
נוזל אוניברסלי בתוספת אקטיבטור  (לנתיחת דבורים)	Kulzer
Watchmaker' s מלקחיים (לנתיחת דבורים)	כלים מדעיים עדינים	91100-12
אמבט מים	Leica
מברשת			2x
קסנטופרן L כחול  (לנתיחת דבורים)	קולצר

, מזוקקים Zeiss אלכוהולי מדיום הרכבה של Faramount, מימי שקופיות מיקרוסקופ Leica Microtome Leica תחנת הטמעת רקמות מודולרית Leica NaHPO צבעי מים