בידוד של תאי אנדותל גלומרולריים של עכברים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית

Summary

המאמר מתאר את השיטה לבידוד תאי אנדותל גלומרולריים מותנים מכליות של עכברים מהונדסים המבטאים את נגיף סימיאן התרמולבילי 40 ואת המיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית, PhAM^נכרת. אנו מתארים את ההליך לבידוד גלומרולי מכליות שלמות באמצעות חרוזים, שלבי עיכול, זריעה וגידול של GECs-CD31 חיובי.

Abstract

תפקוד לקוי של תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) יכול ליזום ולתרום לפירוק מחסום סינון גלומרולרי. עקה חמצונית מיטוכונדריאלית מוגברת הוצעה כמנגנון הגורם לתפקוד לקוי של GEC בפתוגנזה של מחלות גלומרולריות מסוימות. מבחינה היסטורית, הבידוד של GECs ממודלים in vivo היה מאתגר לשמצה בשל קשיים בבידוד תרבויות טהורות מגלומרולי. ל-GECs יש דרישות גידול מורכבות במבחנה ותוחלת חיים מוגבלת מאוד. במאמר זה נתאר את הליך הבידוד וההתרבות של GECs מונצחים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית, מה שמאפשר מעקב אחר ביקוע מיטוכונדריאלי ואירועי היתוך. GECs בודדו מכליות של עכבר מהונדס כפול המבטא את התרמולביל SV40 TAg (מה-Immortomouse), מקדם באופן מותנה התפשטות ודיכוי התמיינות תאים, וחלבון פלואורסצנטי הניתן להמרה (Dendra2) בכל המיטוכונדריה (מהעכבר המיטוכונדריה הניתן להפעלה פוטו-אקטיבית [PhAM^נכרת]). קו התאים היציב שנוצר מאפשר התמיינות תאים לאחר השבתה של הגן האמונטלי SV40 TAg והפעלה פוטו-אקטיבית של תת-קבוצה של מיטוכונדריה הגורמת למתג בפלואורסצנטיות מירוק לאדום. השימוש ב-mitoDendra2-GECs מאפשר הדמיה חיה של אירועי התפלגות, איחוי וביקוע של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מבלי להכתים את התאים.

Introduction

הגלומרולוס חיוני לסינון הדם על ידי הגבלת המעבר של מולקולות גדולות דרך מחסום הסינון הגלומרולרי ^1,2. הגלומרולוס מכיל ארבעה סוגי תאים: תאי אפיתל קודקודיים, פודוציטים (תאי אפיתל קרביים), תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) ותאים מסנגיאליים³. האנדותל הגלומרולרי מאופיין במבנה כלי דם ייחודי, בהתאם לנוכחות של fenestrae הנדרשת לנפחי סינון גדולים⁴. המשטח האפיקלי של האנדותל הגלומרולרי מכוסה בשכבת גליקוקליקס טעונה שלילית ובשכבה הנקראת שכבת פני השטח של האנדותל היוצרת רווח בין האנדותל לדם. מבנה זה מספק סלקטיביות מטען גבוהה המגבילה את המעבר של מולקולות טעונות שלילית כגון אלבומין ומניעת הידבקות לויקוציטים וטסיות דם⁵.

GECs רגישים מאוד לשינויים מטבוליים, כגון היפרגליקמיה הקשורה לסביבה הסוכרתית. ואכן, סוכרת מובילה לזרימת דם מוגברת של חומרים רעילים, לרוויה של מסלולי חילוף החומרים של הגלוקוז ולהפרעה במאזן החיזור התאי ^3,6. יתר על כן, העלייה בכמות החמצן הריאקטיבי גורמת לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מה שמשפיע על תפקוד האנדותל⁷.

המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לבודד תאי אנדותל גלומרולריים מונצחים עם תכונות מיטוכונדריאליות פלואורסצנטיות. ואכן, לתרבית התאים של GECs ראשוניים יש מחזור התפשטות מוגבל וסנסנציה מוקדמת⁸. בנוסף, נוכחות של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מסייעת לבחון אירועי ביקוע ואיחוי בתגובה להיפרגליקמיה או כל טיפול אחר. כשיטה חלופית, מעבדות אחרות השתמשו ב-h-TERT כדי להנציח תאים במבחנה⁹.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת בידוד של תאי האנדותל הגלומרולריים mitoDendra2 המונצחים מותנה מחיות בנות 4-6 שבועות (איור 1). פרוטוקול מפורט זה מתאר את השימוש בעכברים מהונדסים (H-2K b-tsA58) המכילים את נגיף הסימיאן 40 אנטיגן גידולי גדול (SV40 TAg) גן^10,11 ליצירת תאים אימורטליים מותנים תרמולביליים. תוצר הגן tsA58 TAg מתפקד בטמפרטורה המתירנית של 33 מעלות צלזיוס תחת שליטתו של מקדם האגפים 5' הבלתי ניתן להשראה של הגן ^{H-2K b} של העכבר, אשר מוגבר מעל הרמות הבסיסיות עם חשיפה לגמא אינטרפרון (IFNγ), ובכך שומר על פנוטיפ ההתפשטות המותנה¹². H-2K^b מתפרק במהירות בטמפרטורה הלא מתירנית של 37 מעלות צלזיוס בהיעדר IFNγ, מסיר את הפונקציה המונצחת של tsA58Tag בתאים ומאפשר לתאים לפתח פנוטיפ ממוין יותר^13,14,15. חצייה אופציונלית של עכברי H-2Kb-tsA58 מהונדסים עם עכברי PhAM, המבטאים מיטוכונדריה ספציפית (תת-יחידה VIII של ציטוכרום c אוקסידאז) דנדרה2-ירוקה, מאפשרת זיהוי חי של מיטוכונדריה פלואורסצנטית¹⁶. פלואורסצנציה ירוקה של Dendra2 עוברת לפלואורסצנציה אדומה לאחר חשיפה ללייזר 405 ננומטר¹⁶. כאשר המיטוכונדריה מתמזגים לאחר החלפת תמונות, הם יוצרים צורות מוארכות שנראות צהובות מחילופי חומרים ירוקים וצהובים או נראות אדומות כאשר הן עוברות ביקוע ^7,17. MitoDendra2-GECs הם כלי נהדר לחקר התגובות התאיות של מיטוכונדריה של GEC לגירויים שונים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני. השתמשנו בשלושה עכברים זכרים (H-2Kb-tsA58 עכברים מהונדסים עם מיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית [PhAM]) שנרכשו ממעבדת ג'קסון ושמרנו על דיאטת צ'או רגילה.

1. תנאי עבודה והכנות

1. נקו את חלל העבודה בתוך מכסה המנוע עם זרימה למינרית באמצעות 70% אתנול ואור UV-C.
2. מכינים את מאגרי הכביסה של החרוז. הכינו את בופר-1 באמצעות 0.1 M נתרן פוספט ב-pH 7.4-8.0, בופר-2 באמצעות 1x תמיסת מלח עם חיץ פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיום בתוספת 0.1% אנטיגן בסרום בקר (BSA), 3 mM EDTA, pH 7.4 ו-buffer-3 באמצעות 0.2 M Tris עם 0.1% BSA, pH 8.5.

2. רכז חלקיקים מגנטיים

1. הכנת חרוזים מגנטיים
   1. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ערבבו בעדינות 200 μL של חרוזים מגנטיים (4 x 10⁸ חרוזים) עם 200 μL של buffer-1.
      הערה: יש להכין 200 מיקרו-ליטר של חרוזים מגנטיים לכל עכבר יום אחד לפני קצירת הרקמות. החרוזים ישמשו לקצירת הגלומרולי.
   2. מניחים את הצינור ברכז חלקיקים מגנטיים למשך דקה אחת, ולאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנטנט. הסר את הצינור מהמגנט ושלח מחדש את החרוזים השטופים ב 200 μL של buffer-1.
   3. מניחים את הצינור המכיל את החרוזים המגנטיים ברכז החלקיקים המגנטיים למשך דקה אחת ושאפו בעדינות את הסופרנטנט.
   4. השבת את קבוצות הטוסיל החופשיות על ידי שטיפת החרוזים המגנטיים 2x, 5 דקות כל אחת, באמצעות 200 μL של buffer-2 על ידי הצבת הצינור ברכז החלקיקים המגנטיים והשלכת המאגר.
   5. דגירה של החרוזים המגנטיים ב-200 μL של buffer-3 במשך 24 שעות ב-4 °C, או במשך 4 שעות ב-37 °C, כדי להשבית את קבוצות הטוסיל החופשיות הנותרות. מניחים את הצינור ברכז המגנטי למשך דקה אחת, שאפו בעדינות את הסופרנטנט והשליכו אותו.
   6. לשטוף את החרוזים המגנטיים 1x עם 200 μL של buffer-2 במשך 5 דקות ב 4 °C. החזירו את הצינור לרכז המגנטי למשך דקה אחת ושאפו בעדינות את הסופר-נט. הסר את הצינור מהרכז המגנטי והשהה את החרוזים המגנטיים ב-200 μL של buffer-2 כדי לקבל 4 x 10⁸ חרוזים / מ"ל.
      הערה: בשלב זה, ניתן להשאיר את החרוזים ב 4 מעלות צלזיוס עד 15 ימים.

3. בידוד של תאים גלומרולריים בכליות עכבר

1. הכן את חומר הזילוף: מזרק 30 מ"ל, מחט פרפר 25 גרם. הכינו את חומר הבידוד: צלחת סטרילית בקוטר 10 ס"מ, אזמל, רכז חלקיקים מגנטיים, מסננת תאים 40 מיקרומטר, מסננת תאים 100 מיקרומטר.
2. הכינו 100 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של האנק בתוספת 1% אנטיביוטיקה והתאימו את ה-pH ל-7.35. סנן את התמיסה עם מסנן 0.2 מיקרומטר ושמור אותה מתחת למכסה המנוע כדי למנוע זיהום.
3. ערבבו 200 μL של חרוזים מגנטיים משלב 2.1.6 עם 20 מ"ל של HBSS אחד.
   הערה: עבור כל עכבר, יהיה צורך ב-200 μL של חרוזים מדוללים ב-20 מ"ל של HBSS 1x.
4. הכינו אליקוט של 1 מ"ל של קולגן מסוג II (125 CDU/מ"ג) ב-1 מ"ג/מ"ל בתמיסת HBSS אחת, pH 7.35. חממו מראש את RPMI עם 10% FCS בינוני באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את תרבית תאי האנדותל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים לפרטים).
   הערה: ה-RPMI ישמש לנטרול הקולגן.
5. מצפים מראש שתי בארות של צלחת 6 בארות עם 2 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל קולגן IV (1 מ"ל / טוב) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הצלחת 3x עם 1x PBS כדי להסיר את החומצה האצטית המשמשת לדילול הקולגן. השתמש בצלחות המצופות מיד או אחסן אותן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
   הערה: עדיף לאטום את הצלחות עם סרט שקוף כדי למנוע התייבשות. ציפוי הקולגן מקל על חיבור התאים לצלחת.
6. נקו ועקרו את כל כלי הניתוח באיור 2 על-ידי שימוש ב-70% אתנול ולאחר מכן שימוש אוטומטי בהם למשך 30 דקות. נקו את סביבת העבודה הכירורגית עם 70% אתנול.
7. הרדימו את העכברים בהזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילזין (10 מ"ג/מ"ל קטמין ו-1 מ"ג/מ"ל קסילזין). כדי לוודא שהחיה מורדמת במלואה, בדוק את רפלקס צביטה בבוהן.
8. תקן את כפות העכבר עם 19 מחטי G כדי להחזיק אותו במקומו על פלטפורמת דיסקציה. נקו את החזה ואת הבטן עם 70% אתנול, ופתחו את הבטן לאורך החזה עם מספריים a (איור 2).
9. החדירו מחט פרפר לחדר השמאלי (איור 3A) והזריקו כ-100 μL מתמיסת החרוזים (משלב 1.2) כדי להרחיב את זרימת הדם.
10. שברו בזהירות את הווריד הנבוב התחתון מתחת לכליות בעזרת מחט של 19 גרם (איור 3A). המשך את הזלוף שהחל בשלב 3.9.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במשאבה קטנה במהירות: 18.0+, זמן: 5 דקות. זלוף טוב חשוב לקצור מספר רב של גלומרולי הנושא חרוזים מגנטיים. זהו הליך שאינו הישרדותי/ סופי.
11. הסירו בעדינות את רקמת השומן עם פינצטה וכלו את שתי הכליות עם מספריים כירורגיים דקים c (איור 2) והכניסו אותן לצלחת עם 1 מ"ל של HBSS 1x על קרח. טחנו את הכליה עם מספריים b (איור 2) ואז עם אזמל סטרילי לחתיכות קטנות של 1 מ"מ כפי שמוצג באיור 3B.
12. לאחר מכן, לדגור את הכליה הטחונה עם 1 מ"ל של collagenase סוג II משלב 3.4 במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם הטיה עדינה באמצעות שייקר אופקי. יש לעכל את הרקמה לחלוטין לאחר שלב זה, כפי שמוצג באיור 3C.
13. הוסיפו 4 מ"ל של RPMI עם 10% FBS (משלב 3.4) כדי לנטרל את הקולגן. סננו את הרקמה המעוכלת דרך מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל. השתמש בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל כדי לערבב את הרקמה המעוכלת כנגד המסננת כדי לאפשר לגלומרולי לעבור.
14. יש לשטוף את מסננת התאים ב-15 מ"ל של HBSS 1x ולאחר מכן לבצע צנטריפוגה של הזרימה ב-200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, הכדור מכיל שלוש שכבות; החרוזים עם הגלומרולי נראים בשכבה האמצעית של הצינור, השכבה העליונה מורכבת ממבנים קטנים יותר כמו צינוריות, והשכבה התחתונה היא פסולת (איור 3D).
15. שאפו בזהירות את הסופרנטנט ואת השכבה הלבנה העליונה. הכדור הנותר מכיל את החרוזים הנושאים את הגלומרולי והפסולת (איור 3D). השהה את הכדור עם 1.5 מ"ל של HBSS 1x והעבר לצינור 2 מ"ל.
16. הניחו את הצינור ברכז המגנטי (איור 3E), שאפו את הסופר-נטנט, ואז שטפו את החרוזים פי 2 עם 1 מ"ל של HBSS אחד; בשלב זה, הניחו 20 μL מתרחיף התאים על שקופית כדי לאמת את נוכחותם של גלומרולי מתחת למיקרוסקופ (איור 3F; גלומרולוס [חץ שחור], וכמה חרוזים [חיצים צהובים] בתרחיף).
17. שאפו בזהירות את הסופרנטנט, החזירו את הכדור למדיום צמיחת תאי האנדותל (Table of Materials), והעבירו אותו לצינור נקי של 2 מ"ל. מוסיפים 2 μL של IFNγ (100 U/mL) לצינור ומצפים את התאים לבאר אחת של צלחת 6 בארות. לדגור על התאים ב 33 מעלות צלזיוס.
18. לאחר 3 ימים של תרבית, בזהירות לשנות את המדיום על ידי pipetting החוצה 1 מ"ל של המדיום והחלפתו עם 1 מ"ל של מדיה טרייה. בשלב זה, התאים הטרוגניים עם תערובת של תאים גלומרולריים (איור 4G).
    הערה: בתרבית הצומחת, תהיה תערובת של תאים גלומרולריים וכמה חרוזים מגנטיים (איור 4G). שימו לב שכל התאים צריכים להראות מיטוכונדריה ירוקה ופלואורסצנטית.
19. לאחר 7 ימים של תרבית, לחלוטין לשאוף את המדיום ולהחליף אותו עם 2 מ"ל טרי של מזון צמיחת תאי אנדותל בתוספת IFNγ (100 U / mL). בשלב זה התאים מתחילים להתרבות אך הם עדיין הטרוגניים (איור 4A).
20. לאחר 10 ימים של תרבית כאשר התאים מגיעים למפגש של ~80%, מעבירים את התאים באמצעות טריפסין כמתואר בשלב 5.1 ואז מעבירים אותם לתוך בקבוק T25 המצופה בקולגן IV.
21. לאחר שבוע אחד (סה"כ ~ 21 ימים של תרבית), להעביר את התאים בקבוק T75 מצופה קולגן IV.

4. הכנת חרוזים לבידוד תאי אנדותל

1. התחילו בציפוי חרוזי הכבשים נגד חולדות בנוגדן CD31 נגד עכברים 3,18,19. השתמש 10 μL של חרוזים עבור כל בקבוק T75.
2. יש לשטוף 10 μL של חרוזים 3x עם 200 μL של 1x PBS בתוספת 0.1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. הניחו את הצינור במגנט הרכז כדי לקטר את חיץ הכביסה בכל פעם.
3. יש להשהות את החרוזים ב-200 μL של PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. הוסיפו 4.8 μL של נוגדן CD31 נגד עכברים 7,18,19, הניחו את השפופרת על שייקר אופקי וערבבו בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר^, ולאחר מכן השאירו את הצינור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

5. בידוד תאי האנדותל הגלומרולרי עם חרוזים מצופים CD31

1. יש להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין לבקבוק T75 ולדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את הטריפסין עם 3 מ"ל של מדיום צמיחת אנדותל, להעביר את התאים לצינור 15 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
2. שאפו את הסופר-נטנט ושטפו את התאים ב-1 מ"ל של PBS המכיל 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
3. יש להשעות את הכדור ב-200 μL של חרוזים מצופים שהוכנו בשלב 4, ולהוסיף 800 μL של PBS המכיל 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה על התאים במשך 45 דקות עם רעידות מתמשכות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
4. מניחים את הצינור ברכז המגנטי ושוטפים את התאים 4x עם PBS אחד המכיל 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. החזירו את התאים ל-3 מ"ל של מדיום גדילת אנדותל בתוספת 100 U/mL IFNγ.
5. צלחת 1.5 מ"ל של תאים/באר בארות מצופות קולגן IV על צלחת 6 בארות. תרבית את התאים בתנאים מתירניים ב 33 מעלות צלזיוס.
   הערה: התאים המבודדים מבטאים אנטיגן T גדול מסוג T tsA58 של נגיף סימיאן 40 (SV40), מה שמאפשר הפעלה של התפשטות רציפה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס (מצב מתירני).
6. לאחר 4 ימים בתרבית, הסר 750 μL של המדיום והחלף אותו עם אותו נפח של מדיום טרי בתוספת 100 U / mL IFNγ.
7. לאחר 10 ימים עד 14 ימים של תרבית, בדקו אם יש מושבות GECs חיוביות ל-CD31 (איור 4C) שמבטאות מיטוכונדריה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מסנן של 488 ננומטר.
8. לאחר 21 ימים של תרבית, התאים עשויים להגיע למפגש של 80%-90%; להעביר אותם לתוך בקבוקון T25. לאחר הגעה למפגש, תאים יכולים להישמר עם בינוני גידול RPMI ו 10% FCS.
   הערה: לפני שהם מגיעים למפגש, התאים עשויים להיראות הטרוגניים (איור 4B). עם זאת, ברגע שהם נפגשים, הם רוכשים מורפולוגיה של אבן מרוצפת.
9. בשלב זה, התאים יכולים להיות בהקפאה. עם ההגעה למפגש של 80%, יש להוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.25% לתאים ולדגור אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את הטריפסין עם נפח שווה של מדיום צמיחה בתוספת 10% FBS.
10. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופר-נאטנט והחזירו את התאים ל-3 מ"ל של מדיום מקפיא (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquot את התאים בצינורות קריו ולאחסן אותם בטמפרטורת אדי חנקן נוזלי.

6. טיפוח המיטודנדרה2-GECs

1. הפשירו את התאים מהקריואליקוט, משלב 5.10, באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והעבירו אותם לצינור של 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום צמיחת אנדותל מחומם מראש.
2. צנטריפוגה המתלה ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את המדיום, והעבר את הכדור לבקבוק תרבית התאים^T25 ס"מ 2 ס"מ מצופה קולגן IV עם מדיום צמיחת תאי אנדותל מחומם מראש בתוספת 100 U/mL IFNγ ודגירה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס.
3. שנה את המדיום למחרת. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%-80%, בדרך כלל לאחר 5 ימים, מעבירים אותם לבקבוק תרבית תאים בגודל T75 ס"מ² .
4. כדי להתמיין בין התאים לפנוטיפ אנדותל, העבירו את התאים לתנאים לא מתירניים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במדיית גדילה ללא IFNγ.

7. העברת מיטודנדרה2-GECs

1. הסר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS, ולהוסיף 3 מ"ל של חם 0.25% טריפסין-EDTA פתרון (T75 ס"מ² בקבוקון), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
2. כאשר התאים מנותקים, מוסיפים 5 מ"ל של מדיום גדילה ופיפטה למעלה ולמטה. צנטריפוגה של המתלים ב 200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר את התאים בקבוק חדש מצופה קולגן IV או צלחת.
   הערה: יש לבצע את המעבר פעם בשבוע ביחס של 1:4.

8. אפיון מיטודנדרה2-GECs

1. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית עבור CD31 על תאים ממוינים 7,18,19,20 (איור 4D). השתמש בסמנים אחרים כגון vWF ואיזולקטין-B4 וכן²⁰.
2. כדי לאשר את הספציפיות המיטוכונדריאלית של Dendra2, תייג תאים עם סמנים ספציפיים למיטוכונדריה על ידי דגירה של התאים במדיום גדילה המכיל 100 ננומטר של גשש מיטוכונדריאלי למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
3. הסר את המדיום ושטוף את התאים בעדינות עם מדיום מחומם מראש ללא אדום פנול לביצוע הדמיה חיה.
   הערה: לחלופין, ניתן לתקן תאים באמצעות קיבוע פורמלדהיד (4%) למשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים ב- PBS. ניתן לאחסן תאים קבועים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-PBS אחד עד לשימוש. אישור עם ציטומטריה זרימה אפשרי גם: תאי תווית עם אנטי CD31, אנטי PECAM, אנטי CD45. GECs צריכים להכתים שלילי עבור סמני פודוציטים (סינפטופודין, Nphs1, Podxl), סמני תאים מזנגיאליים (PDGFRβ, אנגיוטנסינוגן), וסמני תאים צינוריים (Aquaporin, Aminopeptidase-N). סמנים אלה משמשים כבקרות שליליות. בשל ביטוי Dendra2 ספציפי למיטוכונדריה של תאים אלה, הימנע משימוש בערוץ FITC.

9. הדמיית תאים חיים של שינויים מבניים במיטוכונדריה בתגובה לעקה חמצונית או גלוקוז גבוה

1. צלחת 1 x 10⁵ GECs על צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ מצופה קולגן IV באמצעות מדיום צמיחת תאי אנדותל (טבלת חומרים). לאחר 24 שעות, שנה למדיום ללא פנול אדום. לתאים יש מיטוכונדריה ירוקה ופלואורסצנטית.
2. הגדר את התא הסביבתי ל-37 מעלות צלזיוס, 5% לחות ו-5% CO₂ שעה אחת לפני תחילת הניסוי.
3. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, השתמש במטרה של 40x/1.2 W כדי להתאים את המיקוד ולבחור את אזור העניין. לדגור על התאים עם 2mL של 5 mM או 25 mM גלוקוז במשך 60 דקות.
4. חשוף את התאים ללייזר של 405 ננומטר (4% עוצמת לייזר) כדי להמיר תת-אוכלוסייה של מיטוכונדריה מירוק לאדום (איור 5A-B, D-E).
5. השתמש בלייזר של 561 ננומטר כדי לעורר את Dendra2 במצב לא הפוך כדי לדמיין את הפלואורסצנציה האדומה. ראה את פרוטוקול החלפת התמונות המפורט כפי שתואר קודם^{לכן 16}. אירועי ההיתוך מופיעים כפלואורסצנציה צהובה לאחר מספר דקות בגלל היתוך מטריצה ירוקה ומטריצה אדומה (איור 4C, F).

Results

במאמר זה מתואר פרוטוקול מפורט לבידוד של תאי אנדותל גלומרולריים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית יציבה (mitoDendra2-GECs) (איור 1). השימוש בעכברים צעירים בני 6-10 שבועות חיוני להשגת מספר משמעותי של תאים בריאים. לאחר 3 ימים של תרבית, תאים מתחילים לגדול לאט מהגלומרולי המבודד, כפי שמוצג באיור 3G. לאחר 7 ימים, התאים הם הטרוגניים, ומראים סוגי תאים גלומרולריים אחרים, כגון פודוציטים, תאי אפיתל קודקודיים ותאים מסנגיאליים (איור 4A). לאחר שה...

Discussion

מיטוכונדריה חיונית לחילוף החומרים בתאים, להומאוסטזיס ולתגובות סטרס, ותפקוד לקוי שלהם קשור למחלות רבות, כולל מחלות כליות. למיטוכונדריה יש תפקיד ביצירה הפתולוגית של מיני חמצן תגובתי יתר (ROS), בוויסות רמות הסידן התוך-תאי, במסלולי המוות של התאים ובדינמיקה הציטוסקטלית 21,22,23.

הבידוד של GECs מורין הוא מאתגר בגלל מספרם הקטן, גודלם, גורמי המטריצה ואופיים התלויים זה בזה עם תאים גלומרולריים אחרים החיוניים לה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 ומיקרו; m מסננת תאים	פישר	22-363-549
1 מ"ל מזרקי אינסולין	BD	329424
25 גרם פרפר	BD	367298
3 מ"מ מספריים חיתוך	FS	T 15000-00
30 מ"ל מזרק	BD Biooscience	309650
40 ומיקרו; מסננת תאים m	פישר	22-363-547
40 ומיקרו; m רשת
מספריים	בון FST	14184-09
אלבומין סרום בקר	פישר	BP1600-100
CD31	abcam	ab7388
קולגנאז סוג I	קורנינג	354236
קולגנאז סוג II	SIGMA	C6885	125CDU/mg
קולגן מסוג IV	SIGMA	C5533-5M
Dnase-I	Qiagen	79254
Dynabeads 450	Thermofisher Scientific	14013
מדיום גידול תאי אנדותל	Lonza	cc-3156
מלקחיים עדינים במיוחד	F.S.T	11150-10
FBS	Gemini	100-106
פיברונקטין	Thermofisher	33016015
מלקחיים עדינים	F.S.T Dumont	E6511
HBSS	GIBCO	14065-056
IFNg	מדעי התא	CRI001B
מעבדת אימורטומאוס	ג'קסון	32619	Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-גלוטמין 100x	Thermofisher Scientific	25030081
רכז חלקיקים מגנטי	Thermofisher Scientific	12320D
mitotracker	Thermofisher Scientific	M7512
PBS 1X	Corning	46-013-CM
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
עכברי PhaM	מעבדת ג'קסון	18397	B6; 129S-GT (ROSA) 26Sortm1.1 (CAG-COX8A / Dendra2) Dcc / J
פרוטאז (10 מ"ג / מ"ל)	SIGMA	P6911
RPMI	GIBCO	3945
נתרן פירובט 100 מ"מ	Thermofisher Scientific	11360070
מלקחיים דפוס סטנדרטי	FST	11000-12
מספריים כירורגיים - חד-קהה	FST	14008-14
סינפטופודין	סנטה קרוז	SC-515842
טריפסין 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054