מאמר שיטה

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

5.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64161

⸱

24 ביוני 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Animal Resource Center and Trans-Border Medical Research Center, University of Tsukuba, 2Ph.D. Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ"א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.

תקציר

טכנולוגיית CRISPR-Cas אפשרה ייצור מהיר וללא מאמץ של עכברים מהונדסים גנטית. באופן ספציפי, עכברים ועכברים מוטנטיים נקודתיים מיוצרים בקלות על ידי אלקטרופורציה של גורמי קריספר (ותורמי דנ"א אוליגו חד-גדילי) לתוך הזיגוטה . לעומת זאת, קלטות גנים (>1 קילובייט) ועכברים פלוקסים נוצרים בעיקר על ידי מיקרו-הזרקה של פקטורי קריספר ותורמי דנ"א דו-גדילי לתוך זיגוטים. טכנולוגיות עריכת גנום גם הגדילו את הגמישות של ייצור עכברים מהונדסים גנטית. כעת ניתן להציג את המוטציות המיועדות באזורים הגנומיים של היעד במספר זני עכברים מולדים מועילים. הצוות שלנו ייצר יותר מ-200 קווי עכברים של קלטות גנטיות, ויותר מ-110 קווי עכברים מפוצצים על ידי מיקרו-הזרקה של CRISPR-Cas9 באמצעות זיגוטה בעקבות בקשות ממספר מדינות, כולל יפן. חלק מעריכת הגנום הזו השתמשה בזנים BALB/c, C3H/HeJ ו-C57BL/6N, אולם רובם השתמשו בזנים C57BL/6J. בניגוד לשיטת האלקטרופורציה, עריכת גנום על ידי מיקרו-הזרקה של זיגוטה בזנים שונים של עכברים אינה קלה כל כך. עם זאת, קלטות גנטיות ועכברים פלוקסים על רקע גנטי יחיד הם קריטיים כמו מודלים של האנשה גנטית, כתב פלואורסצנטי ועכבר נוקאאוט מותנה. לכן, מאמר זה מציג את הפרוטוקול למיקרו-הזרקה של זיגוטה של פקטורי CRISPR ותורמי DNA דו-גדילי בעכברי C57BL/6J ליצירת קלטות גנים ועכברים פלוקסד. מאמר זה מתמקד אך ורק בהזרקה גרעינית ולא בהזרקה ציטופלזמית. בנוסף למיקרו-הזרקה של זיגוטה, אנו מתווים את ציר הזמן לתהליך הייצור וטכניקות היקפיות כגון השראת ביוץ והחזרת עוברים.

מבוא

עכברי נוק-אין, שבהם הגנים האקסוגניים המיועדים מוצגים במוקד המטרה, נמצאים בשימוש נרחב במחקרי in vivo רבים כמו עכברים אנושיים גנטיים, עכברי כתב פלואורסצנטי ועכברי נהג Cre 1,2. כאשר מוטציות נוק-אין נגרמות על ידי עריכת גנום בזיגוטה של עכברים, דנ"א חד-גדילי (תורמי דנ"א אוליגו חד-גדילי, ssODN) או דנ"א דו-גדילי (dsDNA) משמש כדנ"א תורם 2,3. ssODN משמש בעיקר כדי לדפוק מקטעי גנים קצרים יחסית של פחות מ 200 bp4. ניתן לדפוק מקטעים ארוכים יותר מ 1 kb DNA באמצעות ssODN ארוך (lsODN)5,6, אולם הכנתם גוזלת זמן. כאשר משתמשים בתורמי dsDNA, ניתן ליצור קלטות גנטיות (>1 קילובייט) עכברים ללא הכנת DNA מייגעת של התורם7.

היתרון העיקרי של שימוש ב- ssODN הוא שאלקטרופורציה8 יכולה ליצור עכברי דפיקה. עם זאת, תורמי dsDNA חייבים להיות מוכנסים ישירות לתוך הגרעין על ידי מיקרו-הזרקה של זיגוטה. נדרשת נוק-אין סימולטני בשני אתרים כדי ליצור עכברים פלוקסים, שבהם כל רצף loxP נדפק במעלה ובמורד הזרם של גן המטרה. ישנן שתי דרכים ליצור עכברים floxed על ידי עריכת גנום בזיגוטה של עכבר - באמצעות שני ssODN עצמאיים, שכל אחד מהם נושא אתר loxP יחיד, או באמצעות dsDNA יחיד (או lsDNA) עם רצף floxed; הראשון מאוד לא יעיל 9,10,11. עריכת גנום באמצעות תורמי dsDNA היא הגישה הפשוטה ביותר לייצר קלטות גנים ועכברים פלוקסים אם הסביבה תורמת למיקרו-הזרקה של זיגוטה.

בתחילה, תערובות של Cas9 mRNA ו-sgRNA או וקטורים של DNA המקודדים sgRNA ו-Cas9 משמשות לעריכת גנום בזיגוטה של עכברים12,13. מכיוון שחלבוני Cas9 איכותיים ויציבים זמינים כעת בעלות נמוכה, הכנסת crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) לזיגוטה14 של עכבר הפכה פופולרית. לאחרונה, עכברי נוק-אין נוצרו ביעילות גבוהה על ידי החדרת crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP ודנ"א תורם לשני גרעיני הזיגוטה של עכברים בשלב מחזור התא שבו סביר להניח שתתרחשדפיקה 15. לכן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקות לייצור סוגים שונים של עכברי דפיקה בשיטה זו.

ישנם זנים רבים ושימושיים של עכברי מעבדה16. שינוי גנטי בתוך הרקע המולד, יכול להתעלם מהשפעת הרקע הגנטי על הפנוטיפ. מאמר זה מתאר שיטה לגרימת קלטות גנטיות ומוטציות floxed בזיגוטה של קו העכבר הנפוץ ביותר, C57BL/6J17. יתר על כן, ציר הזמן ליצירת עכברים מהונדסים גנטית והטכניקות ההיקפיות המשמשות נדונים גם, כולל השראת ביוץ והחזרת עוברים.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו באופן הומני באישור הוועדה המוסדית לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת צוקובה, בהתאם לתקנות לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת צוקובה ולהנחיות היסוד להתנהלות נאותה של ניסויים בבעלי חיים ופעילויות נלוות במוסדות מחקר אקדמיים שבסמכות משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע וטכנולוגיה של יפן. עכברי C57BL/6J משני המינים, בני 10-25 שבועות, שימשו כתורם הזיגוטה . עכברי ICR (מעל 10 שבועות) שימשו כעכברים המקבלים. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. אישור פעילות מחשוף crRNA במערכת נטולת תאים

  1. יש להמיס 2 nmol של crRNA (יבש) ו-20 nmol של tracrRNA (יבש) ב-25 μL ו-250 μL של מים נטולי RNase, בהתאמה (ראו טבלת חומרים).
    הערה: רצפי מטרות CRISPR שהיו צפויים להיות בעלי פעילות מחשוף גבוהה וכמה שפחות מחוץ למטרות נבחרים באמצעות CRISPOR (ראה טבלת חומרים). במקרה של קלטת גנטית, מקד את הרצף על פני אתר ההחדרה. האקזונים שיופלו נבחרו באמצעות KOnezumi (ראה טבלת חומרים).
  2. להגביר את מקטע ה- DNA (כ- 0.5-1 kb) המכיל את אתר היעד על ידי PCRגנומי 9. טהרו אמפליקון PCR זה באמצעות ערכת מיצוי מוצרי PCR הנפוצה (ראו טבלת חומרים).
  3. הכינו 10 μL של תערובת CRISPR (100 ng/μL של crRNA, 150 ng/μL של tracrRNA, ו-1 ng/μL של Cas9 במאגר התגובה של Cas9 Nuclase, ראו טבלת חומרים). לבניית קומפלקס CRISPR-Cas9, הניחו את תערובת הקריספר בבלוק חום בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
  4. הוסף את הנפח הכולל (10 μL) של תערובת CRISPR למוצר ה-PCR (10 μL, 20 ng/μL) המתואר בשלב 1.2 ודגור ב-37°C למשך שעה אחת. הוסף 1 μL של RNase (500 ng / μL) כדי לפרק את crRNA ו tracrRNA ב 37 ° C במשך 30 דקות, כמו RNA חייב להיות נעדר במהלך אלקטרופורזה. בצע אלקטרופורזה של הדגימות הנ"ל באמצעות צבע העמסה המכיל סודיום דודציל סולפט (2% w/v).
    הערה: במקרים נדירים, crRNA ללא פעילות מחשוף נצפים. במקרים כאלה, מומלץ לעצב מחדש את עיצוב עריכת הגנום.

2. הכנת תערובת של crRNA, tracrRNA, חלבון Cas9 ו- DNA תורם למיקרו-הזרקה של זיגוטה

  1. הכינו תמיסת CRISPR (50 ng/μL של crRNA, 200 ng/μL של tracrRNA ו-200 ng/μL של Cas9 במים נטולי RNase). הכינו תמיסת DNA של תורם (20 ng/μL של וקטור DNA פלסמיד שנבנה בעצמו).
    1. סנן את תמיסת ה- DNA של התורם דרך מסנן מזרק סטרילי בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר. ערבבו נפחים שווים של תמיסת CRISPR ותמיסת DNA מסוננת של תורם. ודא שהריכוז הסופי של כל אחד מהם הוא 25 ng/μL של crRNA, 100 ng/μL של tracrRNA, 100 ng/μL של Cas9 ו-10 ng/μL של DNA תורם. תערובת זו תיקרא מעתה RNPD.
      הערה: בעת חיתוך שני אתרים, כגון במהלך ייצור עכברים floxed, הריכוז של כל crRNA חייב להיות 25 ng/μL. הדנ"א של התורם הוא דנ"א פלסמיד מעגלי וניתן לטהר אותו באמצעות ערכת עמוד ספין מיני הכנה נפוצה (ראו טבלת חומרים). הפתרון מוכן חייב להיות ממוקם על קרח ומשמש מיקרו הזרקה בהקדם האפשרי.

3. השגת זיגוטות עכברים על ידי הזדווגות טבעית

  1. יש להזריק 5 IU של גונדוטרופין בסרום של סוסה בהריון (PMSG, ראה טבלת חומרים) תת עורית לעכברות C57BL/6J (בנות 10-25 שבועות) 3 ימים לפני מיקרו-הזרקה. בערך 46-48 שעות מאוחר יותר, לתת 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG, ראה טבלה של חומרים) intraperitonely. אכלסו את נקבות העכברים שטופלו ב-PMSG וב-hCG עם עכברי C57BL/6J זכרים ובדקו את תקעי הנרתיק למחרת בבוקר.
    הערה: ניתן להשיג כ-15-25 זיגוטים מנקבה אחת של עכבר C57BL/6J. ציר הזמן מוצג באיור 1.
  2. הכינו שתי צלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ לתרבית זיגוטה, כפי שמוצג באיור 2. מניחים אותם באינקובטור (37°C, 5% CO2) עד לשימוש. ניתן לאחסן אותם למשך הלילה.
  3. הרדימו את נקבות העכברים עם פקקי נרתיק מאושרים על ידי פריקת צוואר הרחם, ובעזרת מספריים קטנים, חתכו דרך עור הבטן ושכבת השרירים מקו האמצע של הבטן התחתונה אל מתחת לצלעות.
    הערה: פעל בהתאם להמלצות הוועדה המקומית לאתיקה של בעלי חיים בנוגע להמתת חסד.
  4. אספו את האובידוקט והניחו אותו בטיפה של 20 מיקרוליטר של מדיום M2 המכיל 0.75 מ"ג/מ"ל של היאלורונידאז (ראו טבלת חומרים) על מכסה צלחת הפטרי. הרימו אובידוקט אחד עם מלקחיים עדינים וחדרו כ-50 מיקרוליטר של M2 בינוני עם היאלורונידאז דרך הפימבריה.
    הערה: בשלב זה, הזיגוטה מוקפת באופן רופף בתאי קומולוס רבים.
  5. לאחר 30 שניות, הרימו זיגוטות תקינות מורפולוגית עם כמות קטנה של מדיום באמצעות נימי זכוכית ושטפו אותן על ידי העברתן לטיפות בינוניות M16 טריות. העבירו את הזיגוטה השטופה לצלחת פטרי (איור 2) לצורך איגום.
    הערה: ציר הזמן מוצג באיור 1. לזיגוטה נורמלית מורפולוגית יש גרעין זכר ונקבה ושני גופים קוטביים שלא פגעו קשות בצורה הכדורית15. המורפולוגיה של הזיגוטה משתנה במידה ניכרת בין זנים ומינים.
  6. חזור על שלבים 3.3 ו- 3.4 עד לאחזור כל הזיגוטים. ניתן לאגד כ-100 זיגוטים בטיפת M16 אחת בצלחת התרבית. אחסנו את המנה באינקובטור (37°C, 5% CO2) עד למיקרו-הזרקה.

4. הכנת מחט המיקרו-הזרקה

  1. משוך כמה פיפטות זכוכית באמצעות מושך פיפטה הניתן לתכנות (ראה טבלת חומרים).
    הערה: מחטי מיקרו-הזרקה חייבות להיות בעלות קצה דק ומתחדד ארוך. אם למושך יש תוכנית להכנת מחטים להזרקת זרע תוך ציטופלזמית, ניתן להשתמש באותה תוכנית להכנת מחטים למיקרו-הזרקה.
  2. שברו את קצה מחט המיקרו-הזרקה על ידי פגיעה בכדור הזכוכית המחובר לקצה המיקרופורג'. ודא שגודל הקצה של מחט המיקרו-הזרקה הוא בקוטר של כ-1 מיקרומטר. בדוק את גודל הקצה תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 1000x.
  3. כופפו את מחט המיקרו-הזרקה במרחק של כ-2-3 מ"מ מהקצה באמצעות מיקרופורג'.
    הערה: זווית העיקול תלויה בהגדרת המיקרומניפולטור. כיפוף רב מדי יפחית את האפקטיביות של דופק הפיזו.

5. מיקרו-הזרקת זיגוטה

  1. יש להזריק 1-1.5 ס"מ מנוזל הפעולה (גוף אינרציה הדרוש לאפקט פייזו ליצירת חורים כחלופה לכספית, ראו טבלת חומרים) למרכז מחט המיקרו-הזרקה ולהצמיד אותו למחזיק המיקרו-מזרק הידני עם מפעיל הפייזו.
    1. יתר על כן, חבר את מחט האחיזה למחזיק המיקרו-מזרק הידני הנגדי. העבר את נוזל הפעולה לקצה מחט המיקרו-הזרקה בלחץ הדרגתי. תקן את שני מחזיקי המזרק הידניים על המיקרומניפולטור.
      הערה: נוזל הפעולה היוצא מקצה מחט המיקרו-הזרקה ניתן לצפות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 50. לאחר התאמת כמות הנוזל הנפלט, ניתן לראות את התזה של נוזל כאשר פולסים piezo מוחלים, המאשר כי פולסים piezo יעילים. אם לא ניתן לאשר זאת, הכינו מחדש את מחט המיקרו-הזרקה.
  2. הכן תא הזרקה עם שלוש טיפות: (1) 10 μL של M2 בינוני; (2) 5 מיקרוליטר של 12% פוליוויניל פירולידון (PVP) בתווך M2; ו-(3) תערובת של 5 μL של crRNA, tracrRNA, חלבון Cas9 ותמיסת DNA תורם (RNPD). כסו את הטיפות בשמן מינרלי באותו אופן כמו שלב 3.2 והניחו את תא ההזרקה על שלב המיקרוסקופ ההפוך.
    1. תחת המיקרוסקופ ההפוך בהגדלה של פי 50, הורידו את פיפטת המיקרו-הזרקה לנפילת PVP של 12%. יש לשאוף ולהוציא 12% PVP כדי לנקות את החלק הפנימי של קצה מחט המיקרו-הזרקה ולהעביר אותו לטיפת ה-RNPD.
  3. שים את המיקרו-מזרק הידני תחת לחץ שלילי ושאב את תמיסת ה- RNPD למחט המיקרו-הזרקה. המתן מספר דקות עד לשאיפה של נפח מספיק; תחת מיקרוסקופ מוגדל פי 50, ממלאים את כל החלק הפנימי של מחט המיקרו-הזרקה בנוזל.
    1. עצור את צריכת ולאפשר פתרון RNPD להיות מגורש בהדרגה על ידי הגדרת microinjector ידני ללחץ חיובי. העבירו את קצה מחט המיקרו-הזרקה לתוך השמן.
      הערה: סובב את הידית של המיקרו-מזרק הידני נגד כיוון השעון לצורך שאיפה. כדי לעצור את השאיפה, סובב את הידית בכיוון השעון והגבר בהדרגה את הלחץ תוך התבוננות תחת מיקרוסקופ. פתרון RNPD ינוקז בהדרגה. תנועת רמת הנוזל במחט המיקרו-הזרקה מאפשרת אישור של היציאה.
  4. הכניסו 50 זיגוטים לטיפת M2 והורידו בעדינות את פיפטת האחיזה לאותה טיפה. מעבירים את מחט המיקרו-הזרקה לטיפת M2 המכילה זיגוטים. עברו למטרה של פי 20 והתמקדו בקצה פיפטת המיקרו-הזרקה.
    הערה: שים כמה שיותר זיגוטים שניתן להזריק תוך 10 דקות.
  5. החזיקו זיגוטה והתמקדו בגרעין על ידי הזזת המיקרומניפולטור. הכנס את מחט המיקרו-הזרקה לזיגוטה וקרב את הקצה לגרעין. ברגע שהקצה מגיע לקרום הגרעין, יש להפעיל את פולס הפיזו (עוצמה: 6-10, מהירות: 1) כדי לחדור.
    1. כאשר מחט מיקרו-הזרקה מנקבת את הגרעין, הזריקו את תמיסת ה-RNPD והתבוננו בנפיחות הגרעין. ברגע שהגרעין מנופח במלואו, משוך במהירות את המחט. בצע את אותו הליך הן על גרעיני הנקבה והן על הגרעינים הגבריים.
      הערה: ניתן לראות בבירור את ניפוח הגרעין בזריקה תחת המיקרוסקופ. מידת האינפלציה הזו קשה לביטוי, אך ניתן לאשר אותה על ידי התייחסות לדוחות קודמים15.
  6. העבר את הזיגוטה המוזרק למקום אחר בטיפת M2 כדי לזהות את הזיגוטה לפני ואחרי ההזרקה.
  7. חזור על שלבים 5.5-5.6 עד להזרקת כל הזיגוטה בטיפת M2. לאחר ההזרקה, מעבירים את הזיגוטה לצלחת M16 טרייה.
  8. בחר את הזיגוטה ששרדה 10 דקות לאחר ההזרקה. מוציאים את הזיגוטה הליזית שניזוקה מההזרקה ומפיצים זיגוטות ששרדו לכל טיפה בצלחת M16. כל טיפה חייבת להכיל 20-24 זיגוטים עבור נקבה פסאודו-הרה אחת. זה מקטין את הזמן שבו צלחת M16 נחשפת לסביבה מחוץ לאינקובטור במהלך החזרת העוברים.
    הערה: בתנאי הזרקה אופטימליים, שיעור ההישרדות הוא 90%-95%. זה תלוי בגודל של קצה המחט, את הכוח של דופק piezo, ואת לחץ היציאה של פתרון RNPD.

6. החזרת עוברים לתוך האובידוקט

  1. לקבלת עכברים פסאודו-הרה, הזדווגו כל נקבת עכבר ICR בשלב הפרואסטרוס עם עכבר ICR זכר מבודד. בדוק את התקעים למחרת.
    הערה: כ-15 עכברות פסאודו-הרות מתקבלות מ-20 זוגות הזדווגות.
  2. יש לתת שלושה סוגים של חומרי הרדמה מעורבים (0.2 מ"ג/ק"ג מדטומידין, 4.0 מ"ג/ק"ג מידזולאם ו-2.5 מ"ג/ק"ג בוטורפנול, ראו טבלת חומרים) באופן תת-עורי לנקבות עכברות פסאודו-הרות. יש לאשר הרדמה מתאימה על ידי ירידה בקצב הנשימה והיעלמות רפלקסי הנסיגה של דוושת הזנב והגפיים האחוריות. יש למרוח משחת עיניים לשימון העיניים בהתאם להמלצות ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים.
  3. לאחר גילוח תער של האזור הגבי של העכבר במצב נוטה וחיטוי אזור הניתוח שלוש פעמים, לסירוגין בין פילינג על בסיס יוד או כלורהקסידין ואלכוהול, חותכים את העור הגבי כ -1 ס"מ לאורך עמוד השדרה עם מספריים חותכים קטנים.
  4. העבירו את פצע החתך הגבי לצד אחד בגחון, חתכו את שכבת השריר שדרכה ניתן לראות את השחלה, תפסו את השומן שמעל השחלה בפינצטה ומשכו את השחלה, האובידוקט והרחם.
    1. הדקו את השומן בעזרת מהדק עדין (ראו טבלת חומרים). הניחו את רקמות הרבייה על גזה סטרילית כדי למנוע מגע ישיר עם הפרווה.
  5. בסדר הבא, מניחים כמות קטנה של מדיום תרבית (M2 או M16), כמה בועות אוויר כסמן, ואת הזיגוטה בפיפטה להעברה.
    הערה: מעבירים כ-10-12 זיגוטים לכל אובידוקט.
  6. בצעו חתך באמצעות מיקרו גזירה (ראו טבלת חומרים) בין האמפולה לפימבריה של האובידוקט (מספיק זמן כדי לאפשר לפיפטת הזכוכית להיכנס), הכניסו את הזיגוטה לחתך, ובמקביל אשרו כי בועת האוויר הוכנסה.
  7. בצע את ההשתלה לתוך האובידוקט השני באופן דומה (שלב 6.6).
  8. תפרו את העור החיצוני בעזרת קליפסים אוטומטיים (ראו טבלת חומרים).
    הערה: אין לתפור את שכבת השריר החתוכה אלא אם פצע החתך גדול באופן בלתי נמנע. הגודל האידיאלי של שכבת השריר החתוכה צריך להיות פחות מ 2-3 מ"מ. אם החתך גדול מ-5 מ"מ, יש לתפור את שכבת השריר באמצעות מחט וחוט תפר מעוקר (ראה טבלת חומרים).

7. התאוששות בעלי חיים

  1. מתן atipamezole hydrochloride (0.3 מ"ג / ק"ג) תת עורית לעכברים.
    הערה: עקוב אחר המלצות ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים לשיכוך כאבים לאחר ניתוח.
  2. לאחר מכן, הניחו את העכברים בכלובים ושמרו אותם חמים על צלחת חמה ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר שהעכברים מתעוררים, שמרו אותם חמים במשך כשעתיים. לאחר שאישרתם שאין התנהגות חריגה של העכברים, החזירו את הכלובים למתלה הרבייה.

תוצאות

תוצאות הייצור של קלטות גנים ועכברים שעברו פלוקסה באמצעות פרוטוקול זה מוצגות בטבלה 1 ובטבלה 2. גני המטרה לא צוינו מכיוון שכל קו עכבר ערוך גנום נמצא כעת בשימוש בפרויקט עצמאי שלא פורסם. במקום זאת, תוארו אזורי כרומוזומלי המטרה.

ניתוחי הגנוטיפ בוצעו בשיטה18 שדווחה בעבר. בשיטת גנוטיפ זו, עכברים שבהם הדנ"א של התורם מוחדר לאתרים כרומוזומליים לא מכוונים אינם נספרים כפרטים חיוביים, גם אם עריכת הגנום הרצויה מושרה. לפיכך, הוצגה יעילות הייצור של העכברים המייסדים שהם באמת שימושיים למטרות ממשיות, ולא יעילות עריכת הגנום עצמו.

יעילות הייצור החציונית של 13 עכברים עצמאיים מקלטות גנים הייתה 20.8%, עם מקסימום של 39.5% ומינימום של 7.9% (טבלה 1). יעילות זו נחשבה מעשית מספיק. כל הגנים העובריים הקטלניים לא היו ממוקדים במהלך הדפיקה בקלטת הגנים. שיעור הילודה החציוני במצב זה של מיקוד גנים לא קטלניים היה 34.0% (מקסימום 43.3% ומינימום 15.9%). מכיוון שניתן להשוות זאת לשיעור הילודה בהחזרת עוברים ללא מניפולציה גנטית, חשבנו כי הרעילות של רכיבי עריכת הגנום שהוכנסו והנזק הפיזי של מיקרו-הזרקת זיגוטה לא צפויים להשפיע על התפתחות העובר.

יעילות הייצור החציונית של 10 העכברים העצמאיים הייתה 7.7%, עם מקסימום של 20.7% ומינימום של 2.1% (טבלה 2). למרות שהתפקודים של מספר גני מטרה לא היו ידועים, שיעור הילודה החציוני היה 30.2%, עם מקסימום של 43.8% ומינימום של 17.3%. שיעור זה היה דומה לזה של עכברי קסטה גנטית, מה שמרמז על כך שלפעולת המיקרו-הזרקה יש השפעה זניחה על ההתפתחות העוברית של עכברים פלוקסים.

figure-results-1
איור 1: ציר הזמן של מיקרו-הזרקת זיגוטה. צבע לבן וצבע כהה מציג את מחזור האור והחושך, בהתאמה. העכברים הוחזקו תחת מחזור אור של 14 שעות / 10 שעות חושך. PMSG: גונדוטרופין בסרום של סוסה בהריון; hCG: גונדוטרופין כוריוני אנושי אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הכנת מנות תרבית. (A) צלחת תרבית לזיגוטה לפני ההזרקה. יש לטפטף שתי טיפות של M16 בינוני (20-25 μL לכל אחת) בצלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 35 מ"מ. (B) צלחת תרבית לזיגוטה לאחר ההזרקה. יש לטפטף 10 טיפות (10-20 מיקרוליטר לכל טיפה) של M16 בצלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 35 מ"מ. טיפות מכוסות שמן מינרלי (3 מ"ל). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אזור כרומוזומלי ממוקדמספראורך הכנסת נוק-אין (kb)אורך זרוע הומולוגיה (kb)
עובריםתינוקותנבדק (גמילה)דפיקה עם rTGrTGc
מוזרקהועברזרוע 5'זרוע 3'
2qE2349331114 (34.4%)א1149 (7.9%)b5 (4.4%)d1.01.01.0
2qE223121578 (36.3%)א7415 (20.3%)b23 (31.1%)d2.21.01.1
5qG228826290 (34.4%)א8119 (23.5%)ב18 (22.2%)d1.62.02.0
6qB127825958 (22.4%)א4611 (23.9%)ב11 (23.9%)d4.21.21.0
6qE3 [ROSA26]29527797 (35.0%)א232 (8.7%)b4 (17.4%)d6.51.13.0
6qE3 [ROSA26]24621987 (39.7%)א8322 (26.5%)ב18 (21.7%)d5.81.13.0
7qF5279268116 (43.3%)א11445 (39.5%)b44 (38.6%)d1.43.11.0
11qB440535356 (15.9%)א478 (17.0%)b12 (25.5%)d1.71.00.8
11qD310294100 (34.4%)א9815 (15.3%)ב76 (77.6%)d1.01.82.4
12qE36832086 (26.9%)א8412 (14.3%)ב19 (22.6%)d3.41.11.3
12qF131526576 (28.7%)א7217 (23.6%)b28 (38.9%)d1.01.11.1
14qE525621548 (22.3%)א4811 (22.9%)ב21 (43.8%)d3.11.00.9
14qE528728585 (29.8%)א7215 (20.8%)b19 (26.4%)d2.61.00.9

טבלה 1: ייצור עכברים באמצעות מיקרו-הזרקה. הטבלה מציגה את קצב הילודה ואת היעילות של ייצור עכברים הנושאים את האלל המיועד ללא אינטגרציה אקראית (rTG) (W/O) של הדנ"א התורם. ניתן היה להשיג עכברים עם האלל המיועד בכל הפרויקטים. א: מספר היילודים/מספר העוברים שהוחזרו; ב: מספר האללים שנשאו עכברים/מספר עכברים שנבדקו; ג: לא בטוח אם יש אלל מיועד; ד: מספר אלל rTG שנשאו עכברים/מספר עכברים שנבדקו; rTG: אינטגרציה אקראית של וקטור תורם. W/O: בלי.

אזור כרומוזומלי ממוקדמספראורך floxed (kb)אורך זרוע הומולוגיה (kb)
עובריםתינוקותנבדק (גמילה)floxed עם rTG
מוזרקהועברזרוע 5'זרוע 3'
3qC32531393 (29.7%)א879 (10.3%)b1.31.21.1
4qB121020036 (18.0%)א296 (20.7%)b1.61.20.9
4qC4272256112 (43.8%)א1005 (5.0%)b2.41.01.4
5qF14313740 (29.2%)א406 (15.0%)b1.81.01.1
5qF25522780 (35.2%)א762 (2.6%)b1.31.10.9
9qE3.128926180 (30.7%)א779 (11.7%)b1.21.21.2
10qB328426988 (32.7%)א783 (3.8%)b1.31.10.9
10qC124323140 (17.3%)א384 (10.5%)b2.11.01.3
14qE5390372139 (37.4%)א1355 (3.7%)b1.10.80.9
17qA3.338337499 (26.5%)א952 (2.1%)b2.10.60.8

טבלה 2: ייצור עכברים Floxed באמצעות מיקרו-הזרקה. הטבלה מציגה את קצב הילודה ואת היעילות של יצירת עכברים הנושאים את אלל הפלוקס המיועד ללא אינטגרציה אקראית (rTG) (W/O) של הדנ"א התורם. ניתן היה להשיג עכברים עם אלל flox המיועד בכל הפרויקטים. א: מספר היילודים/מספר העוברים שהוחזרו; B: מספר אלל FLOX שנשאו עכברים/מספר עכברים שנבדקו. rTG: אינטגרציה אקראית של או וקטור תורם; W/O: בלי.

דיון

במחקר הנוכחי, זיגוטות עכבר C57BL/6J טריות (לא קפואות-מופשרות), שהתקבלו מהזדווגות טבעית, שימשו לייצור עכברים לעריכת גנום. על ידי הזרקת crRNA-tracrRNA-Cas9 ודנ"א תורם (RNPD) לשני הגרעינים של זיגוטים אלה בשלב מחזור התא שבו סביר ביותר שתתרחש, נוצרו קלטות גנים ועכברים עם שיעור ילודה גבוה ויעילות מספקת בעריכת גנום. המחקר הנוכחי מחזק את יכולת ההרחבה של שיטת SPRINT-CRISPR15, שם היא מבטיחה יעילות מספקת אפילו ברקע הגנטי C57BL/6J, וניתן ליישם אותה בייצור עכברים פלוקסיים.

אלקטרופורציה היא שיטה כללית ביותר לייצור עכברים ערוכים בגנום בגלל העלות הנמוכה של מכשירי הניסוי והקלות של לימוד הטכניקה8. יתר על כן, שיטת i-GONAD19, שבה עריכת גנום נעשית עם עוברים טרום השרשה הקיימים באובידוקט, אינה דורשת עכבר מושתל. בהשוואה לשיטות אלה, השיטה הנוכחית המוצגת כאן היא יקרה וגוזלת זמן בעת הכנה ותחזוקה של סביבת ניסוי הן מבחינת חומרה והן מבחינת תוכנה. עם זאת, לאחר הקמת מתקני הניסוי, ניתן לייצר קלטות גנים מורכבות ועכברים פלוקסים עם רכיבי CRISPR הזמינים מסחרית בלבד (crRNA, tracrRNA וחלבון Cas9) וכמות פשוטה וקטנה של וקטור פלסמיד מעגלי שישמש כדנ"א תורם. משמעות הדבר היא שניתן לייצר קווי עכברים מורכבים רבים הערוכים בגנום ללא צורך בהכנה של lsODN 5,6 או וקטורי וירוס הקשורים לאדנו20 כדי להכין.

בניגוד לשיטת SPRINT-CRISPR15 המקורית, נעשה שימוש בזיגוטה טרייה (קפואה-מופשרת). כאשר משיגים זיגוטים טריים על ידי הזדווגות טבעית, ניתן להתעלם מהטעויות הטכניות שעלולות להתרחש במהלך הפריה חוץ גופית או הקפאה והפשרה. כמו כן, תהליך המניפולציה של העובר יכול להסתיים תוך כחצי יום (איור 1) בעקבות הגישה הנוכחית. מצד שני, כמה מגבלות של השיטה הנוכחית כוללות את הדרישה של עכברים זכרים רבים, שליטה רופפת על תזמון ההפריה, ואת היכולת המוגבלת לחזות לחלוטין את מספר הזיגוטה עבור מיקרו-הזרקה. בהשוואה לשיטת SPRINT-CRISPR המקורית, ייתכן שלשיטה זו יש שיעור ילודה גבוה יותר (טבלה 1). למרות זאת, לא ניתן להסיק כי השיטה הנוכחית טובה יותר מבחינת שיעור הילודה בגלל ההבדלים במוליכי הניסוי, גני המטרה, הרקע הגנטי ועיתוי אישור העוברים.

כפי שניתן לראות בטבלה 1, למספר גדול של עכברים ברוב פרויקטי ההקלטות של הגנים היו אללי אינטגרציה אקראיים. אינטגרציה אקראית חייבת להימחק מכיוון שהיא עלולה להוביל לשיבוש לא מכוון של גנים אנדוגניים ולביטוי חוץ רחמי של טרנסגנים. האתגר לעתיד הוא למצוא תנאי ניסוי שיפחיתו את מספר אירועי האינטגרציה האקראיים תוך שמירה על יעילות מספקת של התקיפה.

כמעט כל עריכה גנומית של זיגוטה בעכבר באמצעות אפקטים של עריכת גנום הגורמים לשברים דו-גדיליים של DNA עשויה לגרום למוטציות לא מכוונות באתרי היעד 9,21. התוצאות של מוטציות מטרה לא מכוונות אלה אינן מתוארות כאן, משום שאיננו נמצאים במצב שבו ניתן לנהל את הדור הבא של עכברים כדי להציג ראיות ברורות לקיומן. הדרך הטובה ביותר לשלול את החשש מבלבול הנגרם על ידי מוטגנזה לא מכוונת על המטרה היא להשיג את הדור הבא של עכברים על ידי הזדווגות מייסדים עם עכברי בר במקום להצליב מייסדים. באופן עקרוני, עכברי N1 הנובעים מצלב זה הם מסוג פרא (WT) בצד אחד של האלל, כך שאם מתגלה אלל הנוק-אין המיועד (KI), הם הטרוזיגוטים מסוג WT/KI. לכן, מוטגנזה על המטרה אינה בעיה קריטית בעכבר המעבדה, שיש לו מחזור חיים מהיר יחסית והוא חיה פורייה. עם זאת, שיפור נוסף יהיה צורך כאשר טכנולוגיה זו מיושמת על יונקים גדולים יחסית.

אושר כי טכנולוגיה זו יכולה לייצר קלטות גנטיות בעכברים בזנים מולדים שאינם C57BL/6J, אך מספר מספיק של פרויקטים אינם מאובטחים, והנתונים משתנים מאוד. מסיבה זו, מידע זה אינו נכלל במחקר הנוכחי. ההערכה היא כי יהיה צורך במחקרים נוספים בנושא זה כדי לקדם את הגנטיקה של העכבר ואת מחקר מודל המחלה.

גילויים

המחברים לא הצהירו על אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מחקר מדעי (B) (19H03142: ל- SM), מחקר מדעי (A) (20H00444: ל- FS), מחקר מדעי (A) (21H04838: ל- SM), ומחקר מדעי בתחומים חדשניים "פלטפורמה לתמיכה מתקדמת במודלים של בעלי חיים" (16H06276: ל- ST) ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתבי היד. אנו אסירי תודה לריואיצ'י מורי על הדיון המועיל שלו על עיצוב עריכת גנום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Atipamezole HydrochlorideZENOAQ-Autoclip
קליפ פצעBD427631
קליפ פצע אוטומטי BD427630
ButorphanolMeiji SeikaPharma-C57BL
/6J עכברימעבדת ג'קסון יפן- מבוגר מ -10 שבועות
פיפט מכויל, 100ulDrummond Scientific Company2-000-100לאיסוף זיגוטה והעברת עוברים
Cas9Thermo Fisher ScientificA36499
Cas9 Nuclease Reaction BufferNEBB7203
CellTram 4r  שמןEppendorf5196000030
CRISPORhttp://crispor.tefor.net/web כלי לעריכת גנום עם מערכת CRISPR-Cas9
crRNAIDT-Gel
/PCR ערכת מיצויFastGeneFG-91302
hCGASKA בריאות בעלי
Merck Sigma-AldrichH3884
עכברי ICRמעבדת ג'קסון יפן-מעל גיל 10 שבועות, משקל 28 גרם או
יותר מיקרוסקופ הפוךLeica
KOnezumihttps://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.htmlיישום אינטרנט לאוטומציה של אסטרטגיות שיבוש גנים ליצירת עכברי נוקאאוט
M16 בינוניMerck Sigma-AldrichM7292
M2 בינוניMerck Sigma-AldrichM7167
MedetomidineZENOAQ-
מזמרה מיקרוNatsume SeisakushoMB-54-1
MicroforgeNarishigeMF-900לליטוש אש של החזקת פיפטה וכיפוף יחידות מחט הזרקת
מיקרו מניפולטורNarishige
חולץ מיקרופיפטהSutter InstrumentP-1000חולץ פיפטה לתכנות
MidazolamMaruishi Pharmaceutical-
MILLEX-GV 0.22 ומיקרו; m filterMerck MilliporeSLGV033R
שמן מינרליNacalai26114-75לתרבית זיגוטה ותא הזרקה
צלחת פטרי (35 מ"מ, לא מטופל)Iwaki1000-035לתרבית זיגוטה
PIEZO מיקרומניפולטורPRIME TECHPMM-150
פלסמיד מיני ערכתFastGeneFG-90502מיני הכנה ספין טור
PMM פעולה נוזלPRIME TECHKIT-Aנוזל פעולה למיקרו-הזרקה
PMSGASKA בריאות בעליחיים-פוליוויניל
פירולידוןMerck Sigma-AldrichP5288
RNaseQIAGEN19101
RNase Free Waterאביזר ריאגנטים
Serrefine clampNatsume SeisakushoC-18
נתרן דודציל סולפטSIGMA151-21-3
מחט תפר עם חוטNatsume SeisakushoC11-60B2
זכוכית בורוסיליקט דופן דקה
ללא נימה		מכשיר סאטרB100-75-10למחט מיקרו-הזרקה והחזקת פיפטה
tracrRNAIDT-
חיים-Hyaluronidase IDT-tracrRNA

מקורות

  1. Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
  2. Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367(2020).
  3. Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759(2021).
  4. Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
  5. Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431(2016).
  6. Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799(2015).
  7. Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).
  9. Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507(2022).
  10. Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318(2018).
  11. Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171(2019).
  12. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  13. Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
  14. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87(2015).
  15. Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653(2020).
  16. Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
  17. Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
  18. Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
  19. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25(2018).
  20. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  21. Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עריכה באמצעות CRISPR-Cas9עכברים מהונדסים גנטיתהזרקה לפרו-גרעיןתורם DNA דו-גדיליהשראת ביוץ יתרהעברת עובריםזני עכברים בעייפון גנטי (Inbred)
מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.