הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אופטימיזציה של קצב פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי להערכת רגישות לפרפור פרוזדורים בעכברים

3.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64168

⸱

29 ביוני 2022

 ,  ,  , 
1Departments of Medicine, Pediatrics and Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אופטימיזציה של פרמטרים ניסיוניים בעת שימוש בקצב פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי כדי להעריך רגישות לפרפור פרוזדורים בעכברים.

תקציר

מודלים של עכברים של גורמי סיכון גנטיים ונרכשים לפרפור פרוזדורים (AF) הוכחו כבעלי ערך בחקר הגורמים המולקולריים של AF. ניתן לבצע גירוי חשמלי מתוכנת באמצעות קצב פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי כהליך הישרדותי, ובכך לאפשר ניסויים סדרתיים באותה חיה. עם זאת, קיימים פרוטוקולי קצב רבים, מה שמסבך את יכולת השחזור. הפרוטוקול הנוכחי נועד לספק אסטרטגיה סטנדרטית לפיתוח פרמטרים ניסיוניים ספציפיים למודל כדי לשפר את יכולת השכפול בין מחקרים. מחקרים ראשוניים מבוצעים כדי לייעל את שיטות הניסוי עבור המודל הספציפי הנחקר, כולל גיל בזמן המחקר, מין ופרמטרים של פרוטוקול הקצב (למשל, אופן הקצב והגדרת רגישות למיקוד אוטומטי). חשוב לציין, מקפידים להימנע מאנרגיות גירוי גבוהות, שכן זה יכול לגרום לגירוי של פלקסי גנגליון עם הפעלה פאראסימפתטית בשוגג, המתבטאת בבלוק אטריובנטריקולרי (AV) מוגזם במהלך הקצב ולעתים קרובות קשור להשראת AF מלאכותית. בעלי חיים המדגימים סיבוך זה חייבים להיות מחוץ לניתוח.

מבוא

פרפור פרוזדורים (AF) מייצג מסלול משותף סופי לגורמי סיכון נרכשים וגנטיים מרובים. עבור מחקרים החוקרים את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של מצע ה- AF, מודלים של עכברים הם יתרון בהתחשב בקלות המניפולציה הגנטית ובעובדה שבאופן כללי, הם משחזרים את רגישות ה- AF שנצפתה בבני אדם לפנוטיפים קליניים שונים 1,2,3. עם זאת, עכברים מפתחים לעתים רחוקות AF4 ספונטני, מה שמחייב שימוש במחקרי קצב פרובוקטיביים של פרוזדורים.

ניתן לבצע גירוי חשמלי מתוכנת (PES) כדי להעריך אלקטרופיזיולוגיה של פרוזדורים מורין ורגישות למיקוד אוטומטי באמצעות קצב תוך-לבבי5 או טרנס-ווסגיאלי6. בעוד שגישת הוושט מועילה במיוחד כהליך הישרדותי, השימוש בה מסובך על ידי פרוטוקולי הניסויהרבים שפורסמו 7,8 ומקורות השתנות שיכולים לעכב שכפול9. יתר על כן, השוואות פרוטוקולים מדווחות מוגבלות הופכות את בחירת פרוטוקול הקצב המתאים למאתגרת.

הפרוטוקול הנוכחי נועד להשתמש באסטרטגיה שיטתית לפיתוח שיטות PES טרנס-ווסגיאליות ספציפיות למודל להערכת רגישות של מורין AF על מנת להגביר את יכולת השחזור. חשוב לציין, מחקרי פיילוט ראשוניים מבוצעים כדי לייעל את פרוטוקול הקצב על ידי התחשבות בגיל, מין והשתנות מצב הקצב, כאשר הקצב נועד למזער גירוי פאראסימפתטי לא מכוון שיכול לבלבל תוצאות9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הליך זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ונדרבילט והוא עולה בקנה אחד עם המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפרוטוקול פותח תוך שימוש הןב-9 גנטי והןב-10 מודלים של עכברים (למשל, יתר לחץ דם) של רגישות למיקוד אוטומטי. המפעיל היה עיוור לפנוטיפ של העכבר הנחקר.

1. בחירת בעלי חיים

  1. עבור מודלים גנטיים, הכפיפו עכברים לקצב פרוזדורים דו-שבועי (כלומר, אחת לשבועיים) כמתואר להלן (ראו שלב 6.) כדי לקבוע את התקופה האופטימלית של רגישות למיקוד אוטומטי.
    1. התחל קצב דו-שבועי בגיל 8 שבועות. השתמש בחברי המלטה מסוג בר כבקרות כדי להפחית את ההשתנות. לחקור את שני המינים, כמו אחד לא יכול לפתח פנוטיפ AF9.
  2. עבור מודלים שנרכשו, בצעו קצב אחרי עכברים כדי להגיע לבגרות פיזית (~12 שבועות של גיל)10. כאמור, ללמוד את שני המינים.
  3. במהלך מחקרים ראשוניים אלה, בצע הן קצב פרץ8 (תוך שימוש באורך מחזור קצב קבוע [CL]) והן קצב מופחת7 (עם קצב CL קצר יותר בהדרגה) כדי לקבוע את מצב הקצב האופטימלי. הפרד כל הליך במינימום של 24 שעות.
    הערה: כאשר מספר גדל והולך של עכברים נחקרים, סקור את הנתונים המצטברים כדי לקבוע את הגיל, המין ומצב הקצב האופטימליים המקדמים מיקוד אוטומטי בעכברים רגישים למיקוד אוטומטי, אך לא בקרות.
    1. נתח את הנתונים באמצעות הגדרות מרובות של רגישות למיקוד אוטומטי (לדוגמה, מספר פרקי המיקוד האוטומטי8, משך המיקוד האוטומטיהכולל 9, שכיחות המיקוד האוטומטי4 ושכיחות מתמשכת של מיקוד אוטומטי, המוגדרת בדרך כלל כ- 10 s 11 או 15 s 12, ואפילו עד 5 דקות13,14) מכיוון שדגמים מסוימים עשויים להציג פנוטיפ של מיקוד אוטומטי עבור הגדרה אחת אך לא עבור כל ההגדרות9.
      הערה: ההגדרה של פרק AF ורגישות למיקוד אוטומטי שונה בין מחקרים שפורסמו 4,7. פרקי AF8 מוגדרים בדרך כלל כפעילות פרוזדורים מהירה עם תגובה חדרית לא סדירה המתרחשת במשך 1 שניות לפחות (איור 1). בנוסף למיקוד אוטומטי, קצב פרוזדורים עשוי גם לגרום לרפרודים עם תגובה חדרית קבועה או לא סדירה.
  4. השתמש בפרמטרים הממוטבים הספציפיים לדגם ובהגדרה של רגישות למיקוד אוטומטי למחקרים הבאים על עכברים נוספים.

2. הכנת בעלי חיים

  1. הרדמת העכבר בתא אינדוקציה באמצעות 3% איזופלוראן (ראו טבלת חומרים) ב-1 ליטר/דקה של 100% חמצן.
    הערה: איזופלורן מזיק. הוא עלול לגרות את העור או את העין ולגרום לסחרחורת, עייפות וכאבי ראש, בין שאר הרעילויות של מערכת העצבים המרכזית. יש להשתמש באזור מאוורר היטב עם שיטת טיהור מתאימה (למשל, בלון פחם פעיל).
  2. לאחר אובדן רפלקס הדוושה, הנח את העכבר במצב שכיבה על כרית חימום שנועדה לשמור על טמפרטורת הגוף בכ-37 מעלות צלזיוס כאשר האחוריים מודבקים למשטח הפד.
  3. יש למרוח משחת עיניים משמנת על העיניים כדי למנוע התייבשות.
  4. יש להניח מסכת הרדמה היטב על אפו של העכבר. התחל תחזוקה של הרדמה באמצעות 1% isoflurane ב 1 ליטר / דקה של 100% חמצן. ודא שהנחיריים נקיים מחסימה מכיוון שהעכברים מחייבים את נשימת האף.
  5. השג אלקטרוקרדיוגרמה על פני השטח (אק"ג, עופרת I) על ידי מיקום תת עורי של 27 אלקטרודות מחט א.ק.ג. (ראו טבלת חומרים) המחוברות למגבר ביולוגי וחומרת איסוף נתונים לתוך הפורלימבים. קרקע את האות על ידי הנחת אלקטרודת מחט לתוך הגפה האחורית השמאלית.

3. מיקום קטטר

  1. הסר לזמן קצר את מסכת האיזופלוראן מהעכבר.
  2. הכנס צנתר אלקטרודה מתומן 2-F (רוחב אלקטרודה וריווח = 0.5 מ"מ) המחובר למבודד מגרה וגירוי (ראו טבלת חומרים) לתוך הוושט (איור 2).
    1. הכנס לעומק המתקרב למרחק מהפה (עם צוואר מורחב) עד ממש מעל הסחוס הקסיפואידי.
  3. מקם מחדש את מסיכת האיזופלורן מעל נחירי העכבר.
  4. התחל באיסוף נתונים עם הקלטה רציפה של עופרת א.ק.ג. I באמצעות תוכנת ניתוח (ראה טבלת חומרים).
  5. התאם את מצב מבודד הגירוי לדו קוטבי. השתמש בזוג האלקטרודות הדיסטלי ביותר במהלך הגירוי.
  6. מקמו נכון את הקטטר בתוך הוושט כדי לאפשר לכידה. לשם כך, יש למרוח גירוי של 1.5 mA עם רוחב דופק של 2 מילישניות ב-CL מעט קצר יותר מה-CL של הסינוס (לדוגמה, השתמש ב-CL של 100 מילישניות אם הסינוס CL הוא 120 מילישניות). מקמו בזהירות את הצנתר עד לקבלת לכידה עקבית של פרוזדורים.

4. קביעת סף

  1. כדי לקבוע את סף הלכידה הדיאסטולי של פרוזדורים (TH), התחל קצב של 1.5 mA עם רוחב פולס של 2 אלפיות השנייה ב- CL המשמש ללכידת פרוזדורים. הפחת את משרעת הגירוי במרווחים של 0.05 mA עד לאובדן לכידת פרוזדורים, עם עלייה לאחר מכן עד ללכידה.
    הערה: המשרעת הנמוכה ביותר שבה מתקבלת לכידת פרוזדורים עקבית היא TH פרוזדורים. בשל הדאגה לגירוי פאראסימפתטי באמפליטודות גירוי גבוהות, המשתקף על ידי בלוק AV מוגזם במהלך הקצב עם אינדוקציה של מיקוד אוטומטימלאכותי 9, ה- TH המרבי המקובל הוא 0.75 mA. במידת הצורך, מקם מחדש את הצנתר כדי להשיג TH ≤0.75 mA.
  2. התאם את משרעת הגירוי לפעמיים TH.

5. קביעת תכונות אלקטרופיזיולוגיות

  1. מדוד פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים, כולל זמן ההתאוששות של צומת הסינוסים (SNRT), אורך מחזור Wenckebach (WCL), ותקופת עקשן יעילה של אטריובנטריקולרי (AVERP) לפני קצב פרוזדורים מהיר עבור אינדוקציה של AF15.

6. רגישות להפרעות קצב פרוזדורים

  1. בצע קצב כפול TH עם רוחב פולס של 2 אלפיות השנייה באמצעות קצב פרץ ב- CLs שונים או קצב מופחת כפי שנקבע ממחקרים ראשוניים (שלבים 1.1.-1.4.).
  2. עבור קצב פרץ, קצב ב- CL ראשוני של 50 מילישניות במשך 15 שניות כאשר הרכבות הבאות מתרחשות ב- CLs של 40 אלפיות השנייה, 30 אלפיות השנייה, 25 אלפיות השנייה, 20 אלפיות השנייה ו- 15 אלפיות השנייה 8,10. השהה את הקצב למשך 30 שניות לאחר כל רכבת צעידה כדי לאפשר התאוששות לפני שתמשיך. אם AF מתרחש לאחר רכבת קצב, המתן 30 שניות לאחר הסיום לפני שתמשיך בקצב הבא.
  3. לקצב דקרמנטלי, קצב ב-CL של 40 מילישניות והפחתת ה-CL ב-2 אלפיות השנייה כל 2 שניות עד לסיום ב-20 אלפיות השנייה7. בצעו רכבות קצבבמשולש 16 או בחמישייה17, עם הפסקה של 30 שניות להתאוששות לאחר כל רכבת. כנ"ל, אם AF מתפתח, המתן 30 שניות לאחר הסיום לפני שתמשיך.
    הערה: בעת מיטוב פרמטרים של פרוטוקול במהלך ניסויים ראשוניים (כלומר, שלבים 1.1.-1.5.), בצע קצב מופחת עם חמש רכבות. בצע ניתוח לאחר הוק כדי לקבוע אם שלוש או חמש רכבות מספקות את הרגישות הגדולה ביותר.
  4. סיים את ההליך עם 30 שניות של קצב סינוס לאחר רכבת הקצב האחרונה או לאחר פרק של 10 דקות של AF, המוקדם מביניהם.

7. לאחר ההליך

  1. הפסק את איסוף הנתונים.
  2. יש להסיר בעדינות קטטר ואלקטרודות אק"ג.
  3. להפסיק הרדמה.
  4. הכניסו את העכבר המרדים לכלוב והתבוננו במשך 10 דקות כדי להבטיח התאוששות.
  5. שמור את קובץ הנתונים. במקרה של בדיקה סדרתית, המתן מינימום של 24 שעות לפני שתחזור על הליך הקצב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקרי קצב פרוזדורים טרנס-ווסגיאליים מעריכים את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של צמתי SA ו-AV על-ידי קביעת SNRT ו-AVERP, כמו גם רגישות ל-AF6 (איור 1). הקלטת אק"ג מאפשרת מדידות של משך גל P, מרווח יחסי ציבור, משך QRS ומרווחי QT/QTc. הקלטה רציפה של האק"ג במהלך קצב פרוזדורים מהיר יכולה לספק את המדידות הבאות של פגיעות המיקוד האוטומטי: מספר הפרקים המושרים במהלך המחקר, משך הזמן המצטבר והממוצע של הפרקים ומספר פרקי המיקוד האוטומטי המתמשכים. אפיזודות של חסימת AV מוגזמת במהלך הקצב י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קצב פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי לא רק מאפשר מחקרים סדרתיים באותה חיה, אלא שמשך הזמן שלו בדרך כלל קצר יותר ממחקרים תוך לבביים (~20 דקות), ובכך ממזער את השימוש בהרדמה ואת השפעותיו על פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים.

זה קריטי כדי לייעל את השיטות בתחילה עבור כל מודל עכבר בודד. הזדקנות מגבירה את יכולת ה-AF בעכברים רגיליםב-18,19, ומודלים גנטיים בודדים עשויים להדגים את יכולת ה-AF על פני פרק זמן מוגבל. ביצוע מחקרי פיילוט אחת לשבועיים יכול לקבוע חלון גי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

איור 2 נוצר עם BioRender.com. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם במכונים הלאומיים לבריאות (HL096844 ו- HL133127); איגוד הלב האמריקאי (2160035, 18SFRN34230125 ו- 903918 [MBM]); והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום של המכון הלאומי לבריאות (UL1 TR000445).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
27 G אלקטרודות א.ק.גADIמבניםMLA1204
צנתר אלקטרודות מתומן 2-FNuMEDCIBercath
מיכל פחם פעילVetEquip931401
ADInstrumentsLabChart v8.1.13
מגבר ביולוגיADInstrumentsFE231
נתונים רכישה חומרהADInstrumentsPowerLab 26T
משחת עינייםMWI וטרינריNC1886507
כרית חימוםBraintree ScientificDPIP
IsofluranePiramal66794-017-25
StimulatorBloom AssociatesDTU-210
Stimulus IsolatorWorld Precision Instrumentsדגם A365
תוכנת ניתוח

מקורות

  1. Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
  2. Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
  3. Schutter, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
  5. Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
  6. Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
  7. Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
  8. Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
  9. Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
  10. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
  11. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018(2015).
  12. Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
  13. Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
  14. Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
  15. Li, N., Wehrens, X. H. T. Programmed electrical stimulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730(2010).
  16. Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
  17. Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
  18. Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077(2021).
  19. Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
  20. McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896(2020).
  21. Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
  22. Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402(2021).
  23. Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ECG
אופטימיזציה של קצב פרוזדורים טרנס-ווסגיאלי להערכת רגישות לפרפור פרוזדורים בעכברים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.