הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ותכנות מחדש ישיר של נוירונים של אסטרוציטים של עכברים

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64175

⸱

7 ביולי 2022

 ,  , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת תרביות מועשרות מאוד של אסטרוציטים שמקורם באזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של עכברים לאחר הלידה ואת המרתם הישירה לנוירונים פונקציונליים על ידי ביטוי כפוי של גורמי שעתוק.

תקציר

תכנות מחדש ישיר של תאי העצב הוא גישה רבת עוצמה ליצירת נוירונים פונקציונליים מאוכלוסיות שונות של תאי מתחילים מבלי לעבור דרך מתווכים רב-תכליתיים. טכניקה זו לא רק טומנת בחובה הבטחות גדולות בתחום מודל המחלות, שכן היא מאפשרת להמיר, למשל, פיברובלסטים לחולים הסובלים ממחלות נוירודגנרטיביות לנוירונים, אלא גם מייצגת אלטרנטיבה מבטיחה לטיפולים חלופיים מבוססי תאים. בהקשר זה, פריצת דרך מדעית משמעותית הייתה ההדגמה כי תאים לא עצביים מובחנות בתוך מערכת העצבים המרכזית, כגון אסטרוציטים, יכולים להיות מומרים לנוירונים פונקציונליים במבחנה. מאז, תכנות מחדש ישיר במבחנה של אסטרוציטים לנוירונים סיפק תובנות משמעותיות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המרת זהות כפויה והמכשולים המונעים תכנות מחדש יעיל. עם זאת, קשה להשוות בין תוצאות מניסויים במבחנה שבוצעו במעבדות שונות בשל הבדלים בשיטות המשמשות לבידוד, תרבית ותכנות מחדש של אסטרוציטים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד אמין ולתרבית של אסטרוציטים עם טוהר גבוה מאזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של עכברים בגילאים שלאחר הלידה באמצעות מיון תאים מגנטיים. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים לתכנות מחדש של אסטרוציטים בתרבית לתאי עצב באמצעות התמרה נגיפית או טרנספקציה של דנ"א. פרוטוקול יעיל וסטנדרטי זה יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תחזוקת זהות התא, את קביעת הזהות העצבית החדשה, כמו גם את יצירתם של תת-סוגים עצביים ספציפיים ואת תכונותיהם התפקודיות.

מבוא

מערכת העצבים המרכזית של היונקים (CNS) מורכבת מאוד, המורכבת ממאות סוגי תאים שונים, כולל מספר עצום של תת-סוגים עצביים שונים 1,2,3,4,5,6. שלא כמו איברים או רקמות אחרים 7,8,9, ליונק CNS יש יכולת התחדשות מוגבלת מאוד; אובדן עצבי בעקבות פגיעה מוחית טראומטית או ניוון עצבי הוא בלתי הפיך ולעתים קרובות גורם לליקויים מוטוריים וקוגניטיביים10. במטרה להציל את תפקודי המוח, אסטרטגיות שונות להחלפת תאי עצב אבודים נמצאות תחת חקירה אינטנסיבית11. ביניהם, תכנות מחדש ישיר של תאים סומטיים לנוירונים פונקציונליים מתגלה כגישה טיפולית מבטיחה12. תכנות מחדש ישיר, או טרנסדיפרנציה, הוא תהליך של המרת סוג תא מובחן אחד לזהות חדשה מבלי לעבור דרך מצב התפשטות ביניים או פלוריפוטנטי 13,14,15,16. שיטה זו, שהומצאה על ידי זיהוי של MyoD1 כגורם מספיק כדי להמיר פיברובלסטים לתאי שריר17,18, יושמה בהצלחה כדי לתכנת מחדש מספר סוגי תאים לנוירונים פונקציונליים 19,20,21.

אסטרוציטים, המקרוגליה הנפוצה ביותר במערכת העצבים המרכזית 22,23, הם סוג תא מבטיח במיוחד לתכנות מחדש ישיר של העצבים מכמה סיבות. ראשית, הם מופצים באופן נרחב ושווה על פני מערכת העצבים המרכזית, ומספקים מקור לוקו בשפע לנוירונים חדשים. שנית, אסטרוציטים ותאי עצב קשורים זה לזה מבחינה התפתחותית, שכן הם חולקים אב קדמון משותף במהלך ההתפתחות העוברית, תאי הגלייה הרדיאליים24. נראה כי המקור העוברי הנפוץ של שני סוגי התאים מקל על המרה עצבית בהשוואה לתכנות מחדש של תאים משכבות נבט שונות19,21. יתר על כן, דפוס מידע שעובר בירושה על ידי אסטרוציטים באמצעות מקור הגליה הרדיאלי שלהם נשמר גם אצל אסטרוציטים בוגרים 25,26,27, ונראה שהוא תורם ליצירת תת-סוגים עצביים מתאימים אזורית 28,29,30. לפיכך, חקר והבנת ההמרה של אסטרוציטים לנוירונים היא חלק חשוב בהשגת מלוא הפוטנציאל של טכניקה זו לאסטרטגיות החלפה מבוססות תאים.

ההמרה של אסטרוציטים בתרבית חוץ גופית לנוירונים הובילה למספר פריצות דרך בתחום התכנות מחדש של נוירונים ישירים, כולל: 1) זיהוי גורמי שעתוק מספיקים כדי ליצור נוירונים מאסטרוציטים 15,19,31, ii) חשיפת מנגנונים מולקולריים המופעלים על ידי גורמי תכנות מחדש שונים באותו הקשר תאי 32 ו-3) הדגשת ההשפעה של המקור ההתפתחותי של האסטרוציטים על גרימת תת-סוגים עצביים שונים 28,29,33., יתר על כן, המרה ישירה במבחנה של אסטרוציטים פענחה מספר מכשולים עיקריים המגבילים תכנות מחדש של נוירונים ישירים34,35, כגון ייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתי (ROS)34 והבדלים בין הפרוטאום המיטוכונדריאלי של אסטרוציטים ותאי עצב35. לפיכך, תצפיות אלה תומכות מאוד בשימוש בתרביות ראשוניות של אסטרוציטים כמודל לתכנות מחדש של נוירונים ישירים כדי לחקור מספר שאלות יסוד בביולוגיה12, הקשורות לתחזוקת זהות התא, מחסומים המונעים שינויים בגורל התא, כמו גם תפקידו של חילוף החומרים בתכנות מחדש.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד אסטרוציטים מעכברים בגיל שלאחר הלידה (P) עם טוהר גבוה מאוד, כפי שהודגם על ידי בידוד אסטרוציטים מחוט השדרה של מורין29. אנו גם מספקים פרוטוקולים לתכנות מחדש של אסטרוציטים לנוירונים באמצעות התמרה נגיפית או טרנספקציה של פלסמיד דנ"א. ניתן לנתח תאים מתוכנתים מחדש לאחר 7 ימים לאחר ההעתקה (7 DPT) כדי להעריך היבטים שונים, כגון יעילות תכנות מחדש ומורפולוגיה עצבית, או שניתן לשמור עליהם בתרבית במשך מספר שבועות, כדי להעריך את ההתבגרות שלהם לאורך זמן. חשוב לציין שפרוטוקול זה אינו ספציפי לאסטרוציטים של חוט השדרה וניתן ליישם אותו בקלות כדי לבודד אסטרוציטים מאזורים שונים אחרים במוח, כולל החומר האפור בקליפת המוח, המוח האמצעי והמוח הקטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליך הבא תואם את הנחיות הטיפול בבעלי חיים של הלמהולץ צנטרום מינכן בהתאם להנחיה 2010/63/EU בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. אנא הקפידו לציית להנחיות הטיפול בבעלי חיים של המוסד שבו מתבצעת הנתיחה.

1. הכנת דיסקציה, דיסוציאציה וחומרי תרבות

הערה: הכינו את כל ריאגנטי התרבית בתוך ארון בטיחות ביולוגי ועבדו באמצעות ציוד אוטוקלאב או סטרילי בלבד. ניתן להכין ריאגנטים של דיסקציה ודיסוציאציה מחוץ לארון בטיחות ביולוגי.

  1. הכינו צלוחיות תרבית על ידי ציפוי בקבוקון תרבית T25 בפולי-D-ליזין (מלאי 1 מ"ג/מ"ל; תמיסת עבודה 20 מיקרוגרם/מ"ל) ב-H2O למשך 2 שעות לפחות. לאחר מכן, יש לשטוף 3x עם H2O ולייבש את האוויר.
  2. הכינו מאגר דיסקציה על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת חיץ HEPES של 1 M ל-500 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS).
  3. הכינו צינור C אחד (ראו טבלת חומרים) לכל שישה חוטי שדרה על ידי הוספת 1950 μL של מאגר X מהערכה לדיסוציאציה של רקמות עצביות (ראו טבלת חומרים). יש לאחסן על קרח במהלך הנתיחה. הכן תערובת מאסטר לעיכול אנזימטי על ידי הוספת 20 μL של מאגר Y ו- 10 μL של מאגר A לכל צינור C (חלק מהערכה לדיסוציאציה של רקמות עצביות; ראה טבלת חומרים). מערבבים היטב ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
  4. מכינים 1x תמיסת מלח מואצת פוספט (1x PBS) עם סידן ומגנזיום ומניחים על קרח. הכינו מדיום תרבית בסיסי על ידי הוספת 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי, 100 U/mL), 5 מ"ל של 45% D-גלוקוז, ו-5 מ"ל של תוסף גלוטמין (ריכוז סופי של 2 mM; ראו טבלת חומרים) ל-485 מ"ל של DMEM/F12. המדיום הבסיסי יציב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך 4 שבועות.
  5. הכינו מדיום תרבית אסטרוציטים על ידי הוספת 1 מ"ל של תוסף B27 ו-5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ל-44 מ"ל של מדיום תרבית בסיסי. תוסף בינוני עם גורם גדילה אפידרמלי (EGF) וגורם גדילה בסיסי-פיברובלסט (bFGF) (10 ננוגרם/מ"ל כל אחד). הוסף EGF ו- bFGF רגע לפני השימוש לכמות המתאימה של מדיום.
  6. עבור כריתה של רקמת חוט השדרה, להשתמש זוג מלקחיים גדולים עם קצה כפוף, זוג מלקחיים קטנים עם קצה כפוף, זוג אחד של מלקחיים קטנים, זוג מספריים קטנים, ומרית קטנה.

2. בידוד אסטרוציטים

  1. בודדו אסטרוציטים מחוט השדרה של עכברים לאחר לידה כדי לבצע את התכנות הישיר שלהם לנוירונים פונקציונליים (איור 1A). עבור פרוטוקול זה, לאסוף רקמת חוט השדרה מעכברים ביום 2-3 לאחר הלידה. אספו שישה עד שמונה חוטי שדרה לבידוד אסטרוציטים. השתמש באותו פרוטוקול כדי לבודד אסטרוציטים מאזורים אחרים במערכת העצבים, כגון קליפת המוח, המוח האמצעי והמוח הקטן. עבור אזורים אלה, להשיג תאים בחמישה עד שבעה ימים לאחר הלידה.
    הערה: כאשר שואפים לבודד אסטרוציטים מאזורים שאינם מוזכרים בפרוטוקול זה, יש לקבוע בניסוי את הגיל ואת חומר הקלט.

3. כריתת רקמת חוט השדרה

הערה: ניתן לבצע כריתה של רקמה מחוץ לארון בטיחות ביולוגי.

  1. הקרבת עכברים ב-P2-P3 על ידי עריפת ראשים מבלי להרדים את החיה. מניחים את פלג הגוף העליון בצלחת פטרי 35 מ"מ ושומרים על קרח.
  2. פותחים את העור עם מספריים, מסירים חוליות עם מספריים קטנים, מוציאים את חוט השדרה ומניחים אותו במאגר דיסקציה על קרח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאוטקטית עם הגדלה של פי 2, הסירו את קרום המוח מחוט השדרה המבודד באמצעות מלקחיים והעבירו רקמת חוט שדרה מנותחת ומנוקה לצינור C.

4. מיון תאים מופעל מגנטי (MACS)

  1. הוסף 50 μL של אנזים P מהערכה לדיסוציאציה של רקמות עצביות (ראה טבלת חומרים) ו-30 μL של תערובת אנזימים שהוכנה בעבר לכל צינור C. הפכו את צינורות ה-C והניחו אותם על דיסוציאטור מחומם (ראו טבלת חומרים), וודאו שכל הרקמה נאספת במכסה הצינור.
  2. הפעל את תוכנית הדיסוציאציה 37_NTDK_1 עם זמן ריצה של כ-22 דקות. זמן קצר לפני סיום התוכנית, הניחו מסננת של 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) על מספר צינורות של 15 מ"ל השווה למספר צינורות ה-C שבהם נעשה שימוש והרטיבו מראש את המסננת עם 2 מ"ל של PBS קר כקרח. אחסן 1x PBS על קרח במהלך כל הליך MACS.
  3. לאחר השלמת התוכנית, להסיר צינורות C ולזמן קצר צנטריפוגה אותם כדי לאסוף את הרקמה בתחתית הצינורות. מעבירים את הרקמה המנותקת מצינורות ה-C לצינורות ה-15 מ"ל שהוכנו על ידי העברתה דרך המסננת. השאירו את המסננת על צינורות 15 מ"ל.
  4. יש לשטוף את צינור C עם 10 מ"ל של 1x PBS כדי לאסוף שאריות רקמה ולאסוף אותו באותו צינור 15 מ"ל על ידי מעבר דרך המסננת פעם נוספת. צנטריפוגה צינורות 15 מ"ל המכילים רקמה מנותקת ב 300 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: קררו את הצנטריפוגה עד ל-4 מעלות צלזיוס לאחר שלב זה.
  5. הסר את חומר העל מבלי להפריע לכדור התא לפני החיסול התאים ב-80 μL של 1x PBS; הוסף 10 μL של ריאגנט חוסם מתוך ערכת MicroBead נגד ACSA-2 של העכבר (ראה טבלת חומרים). מערבבים בעדינות על ידי צנרת.
  6. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך (מקרר). הוסיפו 10 μL של מיקרובים מצומדים נגד תאי אסטרוציטים (ראו טבלת חומרים) וערבבו בעדינות על ידי צנרת. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  7. לשטוף תאים על ידי הוספת 3 מ"ל של 1x PBS וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C. בעת צנטריפוגה, הרכיבו מפריד מגנטי (ראו טבלת חומרים) על ידי הצבת המספר המתאים של עמודי מיון מגנטיים (ראו טבלת חומרים) על המפריד עם צינור איסוף של 15 מ"ל מתחת. שטפו את העמודים ב-500 μL של 1x PBS.
  8. הסר את ה-supernatant ובצע החייאה של התאים ב-500 μL של 1x PBS לפני העברת תרחיפי התא לעמודים המגנטיים. תנו לניקוז על ידי כוח הכבידה. שטפו את צינורות 15 מ"ל עם 500 μL של 1x PBS והחלו על עמודה. יש לשטוף עמודים עם 500 μL של 1x PBS לשתי שטיפות נוספות.
  9. אלוט תאים על ידי הסרת העמודה מהמפריד, הוספת 800 μL של מדיום תרבית אסטרוציטים ודחיפת תאים אל מחוץ לעמודה עם הבוכנה הכלולה.
  10. תאי צלחת בצלוחיות התרבית שהוכנו בעבר על ידי הוספת 4.2 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים בתוספת EGF ו- bFGF ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    הערה: ציפוי צלוחיות תרבית אינו הכרחי עבור אסטרוציטים המבודדים מאזורים אחרים במוח, אך מספק מצע טוב יותר עבור אסטרוציטים המבודדים מחוט השדרה.
  11. תאי תרבית במשך כ-7 ימים עד למפגש (80%-90%). אם התאים אינם נפגשים לאחר 7 ימים, יש להמתין עד 10 ימים לפני ציפוים. לאחר 10 ימים, התאים אינם מתרבים יותר, ויעילות התכנות מחדש יורדת.

5. זריעת אסטרוציטים לתכנות מחדש

הערה: הצעדים הבאים צריכים להתבצע תחת ארון בטיחות ביולוגי עם רמת בטיחות 1 (SL1).

  1. הכינו לוחות של 24 בארות עם כיסויי זכוכית מצופים פולי-D-ליזין באותו אופן שבו הוכנו בעבר צלוחיות תרבית. כדי לקבוע את מספר הלוחות הדרושים, קחו בחשבון שאסטרוציטים מצופים בצפיפות של 5-5.5 x 104 תאים לכל באר בלוח של 24 בארות. בדרך כלל, בידוד שישה חוטי שדרה מעכברי P2 מניב סביב 1 x 106 תאים.
  2. לשאוף מדיה מתרבות T25 צלוחיות המכילות את האסטרוציטים המתורבתים ולשטוף פעם אחת עם 1x PBS. נתקו את האסטרוציטים מבקבוקון התרבית על ידי הוספת 0.5 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הקש בעדינות על צד הבקבוקון כדי לשחרר תאים ממשטח בקבוקון התרבית ובדוק את הניתוק תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות הגדלה של פי 10.
  3. יש להפסיק את הטריפסיניזציה עם 2.5 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים ולאסוף את תרחיף התא בצינורות של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות, לשאוף supernatant, ותאי resuspend ב 1 מ"ל של מדיום תרבית אסטרוציטים. חישוב ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר או מערכת אוטומטית לספירת תאים.
  4. בהתבסס על מספר התאים, לדלל את תרחיף התא עם מדיום אסטרוציטים טרי כדי לקבל פתרון של 1-1.1 x 105 תאים לכל מ"ל. השלימו את המדיום עם EGF ו-bFGF ב-10 ננוגרם/מ"ל לכל גורם. הוסף 500 μL של תרחיף התא, שווה ערך לתאים 5-5.5 x 104 , לכל באר של לוחות 24 הבאר שהוכנו בעבר ותאי תרבית ב-37 °C ו-5% CO2.

6. ביטוי כפוי של גורמי שעתוק

הערה: לפני שתמשיכו עם הפרוטוקול, חיוני לתכנן כראוי את הניסוי. בפרט, חשוב תמיד לכלול שליטה שלילית עבור תכנות מחדש, כלומר מצב שבו לא בא לידי ביטוי גורם תכנות מחדש. לדוגמה, כאשר משתמשים בווקטורים הנושאים את ה-cDNA עבור גורם התכנות מחדש ובכתב (לדוגמה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), DsRed), הבקרה השלילית מיוצגת על-ידי אותו וקטור הנושא רק את המדווח. כאשר מבטאים גורמים מרובים הנושאים כתבים שונים, יש להתאים את השליטה השלילית בהתאם.

  1. יום לאחר הציפוי, בדקו את לוחות 24 הבאר כדי לוודא שהתאים נדבקו לכיסויים.
  2. בהתבסס על מטרת הניסוי והמשאבים הזמינים, הביטוי הכפוי של גורמי תכנות מחדש יכול להיות מושג על ידי התמרה נגיפית (ראה שלב 6.3) או טרנספקציה של DNA (ראה שלב 6.4).
    הערה: השימוש ב- retrovirus או lentivirus דורש אישור של רשויות ממשלתיות ויש לבצע אותו תחת ארון בטיחות ביולוגי בתוך מעבדה עם רמת בטיחות 2 (SL2).
  3. לתכנת מחדש את האסטרוציטים על ידי התמרת התאים עם הרטרו-וירוס או נגיף הלנטי הנושא את המידע הגנטי כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש המעניינים כמתואר להלן.
    1. התאמר תאים עם טיטר וירוס גבוה של 1 x 1010 10-1 x 1012 חלקיקים /מ"ל על ידי הוספת 1 μL של תרחיף התא ישירות לתווך האסטרוציטים. זה מבטיח שיעור הדבקה גבוה. תרבית את התאים עם מדיום האסטרוציטים המכיל חלקיקים נגיפיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24-36 שעות לפני שתמשיך עם סעיף 7 או סעיף 8, בהתאם למטרת הניסוי.
      הערה: ניתן להשתמש במקדמים שונים כדי להניע את הביטוי של הטרנסג'נדרים (ראה גם תוצאות מייצגות). מקדמים מכוננים (למשל, CMV, CAG) משרים את הביטוי של הטרנסג'ין מוקדם יותר מאשר מקדמים בלתי ניתנים להשראה; עם זאת, שני הסוגים של סוגי המקדמים שימשו בהצלחה לתכנות מחדש של תאים לתאי עצב.
  4. ניתן גם להכניס פלסמידי דנ"א לאסטרוציטים באמצעות טרנספקציה של דנ"א כמתואר להלן.
    הערה: ניתן לעשות זאת תחת ארון בטיחות ביולוגי שאושר עבור SL1.
    1. לפני הטרנספקציה, קבל את ריאגנט הטרנספקציה, דנ"א פלסמידי של המבנים הרצויים, מדיום אסטרוציטים טרי ומדיום מופחת בסרום (ראה טבלת חומרים). חשב את הכמות הנדרשת של מדיום מופחת בסרום (ראה טבלת חומרים) על ידי התחשבות בכך שכל באר של צלחת של 24 בארות דורשת 300 μL של מדיום מופחת בסרום. הוסיפו את הכמות המתאימה של צינור בינוני מופחת בסרום ל-50 מ"ל וחממו אותה ל-37 מעלות צלזיוס.
    2. כאשר המדיום המופחת בסרום חם, שאפו למדיום אסטרוציטים מכל הבארות ואספו אותו בצינור של 50 מ"ל. סנן את מדיום האסטרוציטים שנאסף באמצעות מסנן מזרק 0.45 μM כדי להסיר תאים מנותקים.
    3. הוסף נפח שווה של מדיום אסטרוציטים טרי למדיום המסונן כדי לקבל פתרון מספיק כדי להוסיף 1 מ"ל של מדיום אסטרוציטים לכל באר. יש לשמור על המדיום המותנה באסטרוציטים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש (שלב 6.4.9).
      הערה: מדיום התרבות נמצא בשימוש חוזר מכיוון שהוא מכיל מספר גורמים מופרשים התומכים בכדאיות התרבות.
    4. הוסיפו 300 μL של מדיום מופחת בסרום שחומם מראש לכל באר והחזירו את צלחת ה-24 באר לאינקובטור.
    5. הכן פתרון A, המורכב מדנ"א וממדיום מופחת בסרום. עבור כל באר, השתמשו בסך הכל ב-0.6 מיקרוגרם דנ"א והוסיפו אותו ל-50 מיקרול' של מדיום מופחת בסרום. יש לאחסן פתרון A בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
      הערה: בדרך כלל, יש לשקול שילוש טכני לכל תנאי. לכן, מכינים תערובת המספיקה לתגובה של 3.5 (לדוגמה, 2.1 מיקרוגרם של דנ"א כולל מדולל ב-175 מיקרול' של מדיום מופחת בסרום) כדי להבטיח מספיק חומר כדי להעביר שלוש בארות של צלחת של 24 בארות.
    6. הכינו תמיסה B, המורכבת מריאגנט טרנספקציה וממדיום מופחת בסרום. עבור כל באר, יש להוסיף 0.75 μL של מגיב טרנספקציה ל-50 μL של מדיום מופחת בסרום. מכיוון שפתרון זה משותף לכל תנאי הטרנספקציה, הכינו אותו בכמויות גדולות כדי להפחית את השונות בין הטרנספקציות.
    7. תמיסת דגירה B בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסף פתרון B לפתרון A טיפה אחר טיפה ביחס של 1:1 וערבב בעדינות. אל תעשו מערבולת. תמיסת אינקובציה A+B למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע.
    8. חזור על שלב 6.4.5-6.4.7 עבור כל תנאי הטרנספקציה. לאחר 20-30 דקות, הוסיפו תמיסה A+B לכל טיפת באר טיפה אחר טיפה לנפח סופי של 100 μL. יש לנער בעדינות את הצלחת ולהחזיר את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
    9. לאחר 4 שעות, הסר את מדיום הטרנספקציה והוסף 1 מ"ל של המדיום המותנה באסטרוציטים שחומם מראש והוכן בשלב 6.4.3. שמור על תאים במשך 36-48 שעות לפני שתמשיך עם סעיף 7 או סעיף 8, בהתאם למטרת הניסוי.

7. תכנות מחדש של אסטרוציטים (ניתוח של 7 ימים)

  1. הכן את מדיום ההתמיינות העצבית על-ידי הוספת 1 מ"ל של תוסף B27 ל-49 מ"ל של מדיום תרבית בסיסי (ראה שלב 1.4). לאחר 24-48 שעות, תלוי אם התאים הומרו או עברו טרנספקציה (ראו שלבים 6.3 ו-6.4, בהתאמה), החליפו את מדיום האסטרוציטים ב-1 מ"ל של מדיום התמיינות עצבית לכל באר ותאי תרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-9% CO2.
    הערה: ניתן גם לשמור על תאים ב-5% CO2 אם אין חממת CO2 של 9% זמינה. עם זאת, תכנות מחדש של נוירונים יעיל יותר בתנאים אלה.
  2. אופציונלי: כדי להגביר את יעילות התכנות מחדש, יש להשלים את מדיום ההתמיינות העצבית עם פורסקולין (ריכוז סופי של 30 μM) ודורסומורפין (ריכוז סופי של 1 μM) בעת החלפת מדיום האסטרוציטים למדיום התמיינות. כאשר בוחרים לטפל בתאים עם פורסקולין ודורסומורפין, ספקו מנה שנייה של דורסומורפין יומיים לאחר הטיפול הראשוני. הוסיפו את הטיפול השני ישירות למדיום התרבות.
  3. תכנות מחדש ישיר של אסטרוציטים מורין לתאי עצב מתרחש בדרך כלל תוך 7 ימים לאחר שינוי המדיום. לפיכך, 7 ימים לאחר תחילת התכנות מחדש של נוירונים, לתקן או לאסוף תאים לניתוח במורד הזרם.

8. תכנות מחדש של אסטרוציטים לנוירונים בוגרים (תרביות ארוכות טווח)

  1. הכן את מדיום ההתמיינות העצבית על-ידי הוספת 1 מ"ל של תוסף B27 ל-49 מ"ל של מדיום תרבית בסיסי (ראה שלב 1.4). לאחר 24-48 שעות, בהתאם לשאלה אם התאים הומרו או עברו טרנספקציה (ראו שלבים 6.3 ו-6.4, בהתאמה), החליפו את מדיום האסטרוציטים ב-1 מ"ל של מדיום התמיינות עצבית בתוספת פורסקולין (ריכוז סופי של 30 μM) ודורסומורפין (ריכוז סופי של 1 מיקרומטר) לכל באר ותאי תרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-9% CO2.
    הערה: ניתן גם לשמור על תאים ב-5% CO2 אם אין חממת CO2 של 9% זמינה. עם זאת, תכנות מחדש של נוירונים יעיל יותר בתנאים אלה.
  2. חזור על טיפול דורסומורפין יומיים לאחר הטיפול הראשוני על ידי הוספתו ישירות למדיום ההתמיינות העצבית.
  3. לאחר 7 ימים מתחילת התכנות מחדש של העצבים, הכינו את מדיום ההבשלה על ידי הוספת 6 μL של N2, 1.2 μL של NT3 (מלאי 20 מיקרוגרם/מ"ל), 1.2 μL של BDNF (מלאי 20 מיקרוגרם/מ"ל), 1.2 μL של GDNF (מלאי 20 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1.2 μL של cAMP (מלאי 100 mM) עד 189.2 μL של מדיום התמיינות עצבית. משלים מדיום התמיינות עצבית הנמצא בכל באר עם 200 μL של מדיום הבשלה.
    הערה: מדיום התבגרות הוא תוספת רק עבור הטיפול הראשון. כל הטיפולים הבאים נעשים על ידי החלפה חלקית של מדיום ההתמיינות העצבית כמתואר להלן.
  4. חזור על הטיפול עם מולקולות קטנות על ידי הסרת 200 μL של מדיום התמיינות עצבית והוספת 200 μL של מדיום הבשלה טרי פעמיים בשבוע למשך עד 6 שבועות. במהלך ההבשלה, השתמשו בתאים לניסויים אלקטרופיזיולוגיים (בדרך כלל, ביום ה-21 ואילך) או תקבעו לצורך אנליזה במורד הזרם (למשל, אימונופלואורסצנציה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרבויות ראשוניות של אסטרוציטים מגיעות בדרך כלל למפגש של 80%-90% בין 7 ל-10 ימים לאחר מיון וציפוי MAC (איור 1B). באופן כללי, בקבוקון תרבית T25 יחיד מניב סביב 1-1.5 x 106 תאים, מה שמספיק ל-20-30 כיסויים בעת זריעת תאים בצפיפות של 5-5.5 x 104 תאים לכל באר. יום לאחר הציפוי, התאים מכסים בדרך כלל 50%-60% ממשטח הכיסוי (איור 1C). בשלב זה, תרביות מורכבות כמעט אך ורק מאסטרוציטים, בעוד שסוגי תאים אחרים, כגון נוירובלסטים, נעדרים כמעט לחלוטין (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תרביות ראשוניות של אסטרוציטים של מורין הן מערכת מודלים יוצאת דופן במבחנה לחקר תכנות מחדש של נוירונים ישירים. למעשה, למרות היותם מבודדים בשלב שלאחר הלידה, תאים מבטאים סמני אסטרוציטים טיפוסיים29, שומרים על הביטוי של גנים דפוס28,29, ושומרים על היכולת להתרבות, בדומה לאסטרוציטים in vivo בגיל38 דומה. לאחר בידוד בתיווך MACS, התאים נצמדים תחילה לבקבוקון ואז מתחילים להתרבות, מה שיוצר תרביות אסטרוציטים מועשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

תודות

ברצוננו להודות לאינס מולהאן על שיבוט המבנים לתכנות מחדש, לפאולינה צ'לביק על ההפקה הוויראלית, ולמגדלנה גץ וג'ודית פישר-שטרניאק על הערות על כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% Trypsin/EDTALife Technologies25300054
4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI)Sigma-AldrichD9564
אנטי-עכבר IgG1 Alexa 647Thermo FisherA21240
אנטי-עכבר IgG1 ביוטיןSouthernbiotechCat# 1070-08; RRID: AB_2794413
נגד עכבר IgG2b Alexa 488Thermo FisherA21121
אנטי ארנב Alexa 546Thermo FisherA11010
Aqua Poly/MountPolysciencesCat# 18606-20
B27 SupplementLife Technologies17504044
BDNFPeprotech450-02
bFGFLife Technologies13256029
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-AldrichCat# A9418
cAMPSigma AldrichD0260
C-TubesMiltenyi Biotec130-093-237
DMEM/F12Life Technologies21331020
DorsomorphinSigma AldrichP5499
EGFLife TechnologiesPHG0311
סרום בקר עובריPAN BiotechP30-3302
ForskolinSigma AldrichF6886
GDNFPeprotech450-10
gentleMACS Octo DissociatorMiltenyi Biotec130-096-427
GFAPDakoCat# Z0334; RRID: AB_100013482
גלוקוזסיגמא אולדריץ'G8769
GlutaMaxLife Technologies35050038
HBSSLife Technologies14025050
HepesLife Technologies15630056
ליפופקטמין 2000 (מגיב טרנספקציה)Thermo FisherCat# 11668019
MACS SmartStrainer 70µ mMiltenyi Biotec130-098-462
מפריד MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
ערכת MicroBeat עכבר נגד ACSA-2 Miltenyi Biotec130-097-678
עכבר IgG1 אנטי-סינפטופיזין 1מערכות סינפטיותCat# 101 011 RRID:AB_887824)
עכבר IgG2b אנטי-Tuj-1 (&בטא; III-tub)Sigma AldrichT8660
MS עמודותMiltenyi Biotec130-042-201
N2 SupplementLife Technologies17502048
ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות Miltenyi Biotec130-092-628
NT3Peprotech450-03
מפריד octoMACSMiltenyi Biotec130-042-109
OptiMEM – GlutaMAX (מדיום מופחת סרום)Thermo FisherCat# 51985-026
פניצילין/סטרפטומיציןLife Technologies15140122
פולי-D-ליזיןסיגמא אולדריץ'P1149
ארנב נגד RFPRocklandCat# 600-401-379; RRID:AB_2209751
ארנב אנטי-Sox9סיגמא-אולדריץ'חתול # AB5535; RRID:AB_2239761
Streptavidin Alexa 405Thermo FisherCat# S32351
Triton X-100Sigma-AldrichCat# T9284

מקורות

  1. Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).
  2. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  3. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
  4. Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
  5. Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
  6. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  7. Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6(2018).
  8. Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
  9. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
  10. Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29(2017).
  11. Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
  12. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  13. Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
  14. Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
  15. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373(2010).
  16. Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
  17. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
  18. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  19. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  20. Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  21. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  22. Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
  23. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697(2017).
  24. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  25. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220(2020).
  26. Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
  27. Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532(2021).
  28. Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
  29. Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409(2021).
  30. Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
  31. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
  32. Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
  33. Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
  34. Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
  35. Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
  36. Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
  37. Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
  38. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  39. Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
  40. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
  41. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNA
בידוד ותכנות מחדש ישיר של נוירונים של אסטרוציטים של עכברים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.