הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקה פלואורסצנטית פלואורסצנטית β-גלקטוזידאז הקשורה לזיהוי והעשרה של תאי גידול סנסנטיים על ידי ציטומטריה של זרימה

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64176

⸱

13 בספטמבר 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול לכימות ציטומטרי פלואורסצנטי, זרימה של תאים סרטניים סנסנטיים המושרים על ידי תרופות כימותרפיות בתרבית תאים או במודלים של גידולי מורין. הליכים אופציונליים כוללים co-immunostaining, קיבוע דגימה כדי להקל על אצווה גדולה או ניתוח נקודת זמן, והעשרה של תאים senescent קיימא על ידי מיון ציטומטרי זרימה.

תקציר

סנסנציה תאית היא מצב של מעצר שגשוג הנגרם על ידי נזק ביולוגי שבדרך כלל מצטבר לאורך שנים בתאים מזדקנים, אך עשוי להופיע במהירות גם בתאי הגידול כתגובה לנזק הנגרם על ידי טיפולים שונים בסרטן. סנסנציה של תאי גידול נחשבת בדרך כלל לבלתי רצויה, שכן תאים סנסנטיים הופכים עמידים למוות וחוסמים את הפוגה של הגידול תוך החרפת ממאירות הגידול ועמידות לטיפול. לכן, זיהוי של תאים סרטניים סנסנטיים הוא עניין מתמשך לקהילת חקר הסרטן. קיימים מבחני סנסנציה שונים, רבים מהם מבוססים על פעילותו של סמן הסנסנציה הידוע, בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה (SA-β-Gal).

בדרך כלל, בדיקת SA-β-Gal מבוצעת באמצעות מצע כרומוגני (X-Gal) על תאים קבועים, עם ספירה איטית וסובייקטיבית של תאים סנסנטיים "כחולים" על ידי מיקרוסקופיית אור. בדיקות משופרות המשתמשות במצעי SA-β-Gal פלואורסצנטיים החודשים לתאים, כולל C12-FDG (ירוק) ו-DDAO-Galactoside (DDAOG; אדום-רחוק), אפשרו ניתוח של תאים חיים ואפשרו שימוש בפלטפורמות ניתוח פלואורסצנטיות בתפוקה גבוהה, כולל ציטומטרים של זרימה. C12-FDG היא בדיקה מתועדת היטב עבור SA-β-Gal, אך פליטת הפלואורסצנט הירוקה שלה חופפת לאוטופלואורסצנציה תאית פנימית (AF) המתעוררת במהלך סנסנציה עקב הצטברות של אגרגטים ליפופוסצין. על ידי שימוש בגשושית SA-β-Gal האדומה הרחוקה DDAOG, ניתן להשתמש ב-autofluorescence של תאים ירוקים כפרמטר משני כדי לאשר את הסנסנציה, ולהוסיף אמינות לבדיקה. ניתן להשתמש בתעלות הפלואורסצנטיות הנותרות לצורך צביעת כדאיות התאים או לתיוג חיסוני פלואורסצנטי אופציונלי.

באמצעות ציטומטריה של זרימה, אנו מדגימים את השימוש ב- DDAOG וב- lipofuscin autofluorescence כבדיקה דו-פרמטרית לזיהוי תאי גידול סנסנטיים. כמות של אחוז התאים senescent קיימא מבוצעת. אם תרצה, ניתן לכלול שלב אופציונלי של תיוג חיסוני כדי להעריך אנטיגנים מעניינים על פני התא. תאים סנסנטיים מזוהים יכולים גם להיות ממוינים בצורה ציטומטרית ונאספים לניתוח במורד הזרם. תאים סנסנטיים שנאספו יכולים להיות שוכבים באופן מיידי (למשל, לצורך בדיקות חיסוניות או 'ניתוח אומיקה') או בתרבית נוספת.

מבוא

תאים סנסנטיים בדרך כלל מצטברים באורגניזמים במשך שנים במהלך הזדקנות ביולוגית רגילה, אך עשויים גם להתפתח במהירות בתאי הגידול כתגובה לנזק הנגרם על ידי טיפולים שונים בסרטן, כולל הקרנות וכימותרפיה. למרות שאינם מתרבים עוד, תאי גידול סנסנטיים (TIS) הנגרמים על ידי טיפול עשויים לתרום לעמידות לטיפול ולהניע הישנותשל 1,2,3. גורמים המופרשים על ידי תאי TIS יכולים להחמיר את ממאירות הגידול על ידי קידום התחמקות חיסונית או גרורות 4,5. תאי TIS מפתחים פנוטיפים מורכבים וספציפיים להקשר, פרופילים מטבוליים משתנים ותגובות חיסוניות ייחודיות 6,7,8. לכן, זיהוי ואפיון של תאי גידול מסוג TIS המושרים על ידי גישות שונות לטיפול בסרטן הוא נושא שמעניין באופן שוטף את קהילת חקר הסרטן.

כדי לזהות תאים סרטניים מסוג TIS, נעשה שימוש נרחב במבחני סנסנציה קונבנציונליים, המבוססים בעיקר על גילוי פעילות מוגברת של אנזים סמן הסנסנציה, הבטא-גלקטוזידאז הליזוזומלי GLB19. זיהוי ב-pH ליזוזומלי כמעט נייטרלי (ולא חומצי) מאפשר זיהוי ספציפי של בטא-גלקטוזידאז (SA-β-Gal) הקשור לסנסנציה10. בדיקת SA-β-Gal סטנדרטית שנמצאת בשימוש כבר כמה עשורים משתמשת ב-X-Gal (5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוסייד), מצע בטא-גלקטוזידאז כרומוגני כחול, כדי לזהות SA-β-Gal בתאים קבועים על ידי מיקרוסקופיית אור11. בדיקת X-Gal מאפשרת אישור חזותי איכותי של TIS תוך שימוש בריאגנטים ובציוד מעבדה זמינים בדרך כלל. מיקרוסקופ אור בסיסי המועבר הוא המכשור היחיד הנדרש להערכת נוכחותו של הכרומוגן הכחול. עם זאת, הליך צביעת X-Gal עלול להיות חסר רגישות, ולעתים נדרשות יותר מ-24 שעות להתפתחות צבע. לאחר מכן מכתים ניקוד סובייקטיבי בעל תפוקה נמוכה של תאים סנסנטיים בודדים בהתבסס על ספירת התאים המציגים רמה מסוימת של עוצמה של הכרומוגן הכחול תחת מיקרוסקופ אור. מכיוון ש-X-Gal הוא אטום לתאים, בדיקה זו דורשת תאים קבועים בממס, שלא ניתן לשחזר לצורך ניתוח במורד הזרם. כאשר עובדים עם דגימות מוגבלות מבעלי חיים או מחולים, זה יכול להיות חיסרון גדול.

מבחני SA-β-Gal משופרים המשתמשים בסובסטרטים של אנזימים פלואורסצנטיים חדירים לתאים, כולל C 12-FDG (5-דודקנוילאמינופלואורסצין Di-β-D-גלקטופירנוזיד, ירוק) ו-DDAOG (9H-(1,3-דיכלורו-9,9-דימתיל-אקרידין-2-אחד-7-yl) β-D-גלקטופירנוסייד, אדום רחוק) הופיעו בעבר בספרות12,13,14,15. מבנה הגשושית הכימית והמאפיינים האופטיים של DDAOG מוצגים באיור משלים S1. גשושיות אלה, המיועדות לתאים, מאפשרות ניתוח של תאים חיים (ולא קבועים), וגשושיות פלואורסצנטיות ולא כרומוגניות מאפשרות שימוש בפלטפורמות ניתוח פלואורסצנטיות מהירות בתפוקה גבוהה, כולל מכשירי סינון בעלי תוכן גבוה וציטומטרים של זרימה. מיון ציטומטרים של זרימה מאפשר התאוששות של אוכלוסיות מועשרות של תאים חיים מתרביות תאים או גידולים לניתוח במורד הזרם (למשל, כתם מערבי, ELISA או 'אומיקה'). ניתוח פלואורסצנטי מספק גם אות כמותי, המאפשר קביעה מדויקת יותר של אחוז התאים הסנסנטיים בתוך דגימה נתונה. ניתן להוסיף בקלות בדיקות פלואורסצנטיות נוספות, כולל בדיקות כדאיות ונוגדנים המסומנים בפלואורופור, לניתוח מרובב של מטרות מעבר ל-SA-β-Gal.

בדומה ל-DDAOG, C12-FDG היא בדיקה פלואורסצנטית עבור SA-β-Gal, אך פליטת הפלואורסצנט הירוקה שלה חופפת למיקוד אוטומטי תאי פנימי, המתעורר במהלך סנסנציה עקב הצטברות של אגרגטים ליפופוסצין בתאים16. על ידי שימוש בגשושית DDAOG בצבע אדום רחוק, ניתן להשתמש במיקוד אוטומטי תאי ירוק כפרמטר משני לאישור סנסנציה17. זה משפר את אמינות הבדיקה על ידי שימוש בסמן שני בנוסף ל- SA-β-Gal, שלעתים קרובות יכול להיות לא אמין כסמן יחיד עבור senescence18. מכיוון שזיהוי של AF אנדוגני בתאים סנסנטיים הוא גישה נטולת תוויות, זוהי דרך מהירה ופשוטה להרחיב את הספציפיות של הבדיקה מבוססת ה- DDAOG שלנו.

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש ב-DDAOG וב-AF כבדיקת ציטומטריה מהירה של זרימה דו-פרמטרית לזיהוי תאי גידול TIS בני קיימא מתרביות מבחנה או מבודדים מגידולים שטופלו בתרופות שהוקמו בעכברים (איור 1). הפרוטוקול משתמש בפלואורופורים התואמים למגוון רחב של מנתחי וממיינים סטנדרטיים של ציטומטריה של זרימה מסחרית (טבלה 1). כמות של אחוז התאים הסנסוניים בני קיימא באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה סטנדרטית מופעלת. אם תרצה, ניתן לבצע שלב חיסוני אופציונלי כדי להעריך אנטיגנים בעלי עניין על פני התא במקביל לסנסנציה. ניתן גם להעשיר תאים סנסנטיים מזוהים באמצעות מתודולוגיית מיון תאים פלואורסצנטית סטנדרטית (FACS).

figure-introduction-1
איור 1: זרימת עבודה ניסיונית. סכמטי המסכם נקודות מפתח של מבחן DDAOG. (A) תרופה הגורמת ל-TIS מתווספת לתאים בתרבית של יונקים או ניתנת לעכברים נושאי גידול. לאחר מכן הזמן מותר להופעת TIS: לתאים, 4 ימים לאחר הטיפול; עבור עכברים, 22 ימים בסך הכל, עם שלושה טיפולים כל 5 ימים ועוד 7 ימי התאוששות. תאים נקצרים או גידולים מנותקים לתוך ההשעיה. (B) דגימות מטופלות ב-Baf כדי להתאים את ה-pH הליזוזומלי לזיהוי SA-β-Gal למשך 30 דקות; לאחר מכן, גשושית DDAOG מתווספת למשך 60 דקות כדי לזהות SA-β-Gal. דגימות נשטפות 2x ב- PBS, וכתם כדאיות מתווסף לזמן קצר (15 דקות). לחלופין, ניתן להכתים דגימות בנוגדנים פלואורסצנטיים בתעלות פלואורסצנטיות פתוחות ו/או לתקן אותן לצורך ניתוח מאוחר יותר. (C) דגימות מנותחות באמצעות ציטומטר זרימה סטנדרטי. תאים בני קיימא מוצגים באופן חזותי בחלקות נקודות המציגות DDAOG אדום (המציין SA-β-Gal) לעומת אוטופלואורסצנציה ירוקה (lipofuscin). שער לקביעת אחוז תאי ה- TIS נקבע על סמך דגימות בקרה לא מטופלות (לא מוצגות). אם נעשה שימוש בציטומטר מיון (FACS), ניתן לאסוף תאי TIS ולהחזירם לתרבית לצורך בדיקות נוספות במבחנה או לשכב ולעבד אותם למבחני ביולוגיה מולקולרית. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; TIS = סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול; FL-Ab = נוגדן מצומד פלואורופור; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה; PBS = מלח חצוב פוספט; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

פלואורופורמזההEx/Em (ננומטר)לייזר ציטומטר (ננומטר)גלאי ציטומטר / מסנן פס פס (nm)
DDAOGSA-β-גל645/6601640670 / 30
מיקוד אוטומטיליפופוסקין< 600488525 / 50
CV450כדאיות408/450405450 / 50
PEנוגדן/סמן פני השטח565/578561582 / 15

טבלה 1: מפרטים אופטיים של פלואורופורים וציטומטר. מפרטי ציטומטר המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים עבור מכשיר עם סך של 4 לייזרים ו -15 גלאי פליטה. DDAOG שזוהה ב-645/660 ננומטר הוא הצורה של הגשושית שנבקעה על ידי SA-β-Gal1. DDAOG לא יציב יכול להפגין פלואורסצנטיות ברמה נמוכה ב-460/610 ננומטר, אך הוא מוסר על ידי שלבי שטיפה בפרוטוקול. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; AF = אוטופלואורסצנציה; PE = פיקואריתרין; SA-β-Gal = בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל עבודות בעלי החיים המתוארות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת שיקגו.

1. הכנה ואחסון של פתרונות מלאי

הערה: אם התאים ימוינו בזרימה, יש להכין את כל הפתרונות בטכניקות סטריליות ולסנן אותם דרך התקן מסנן של 0.22 מיקרומטר.

  1. הכינו תמיסת מלאי של DDAO-גלקטוזיד במינון 5 מ"ג/מ"ל ב-DMSO. Aliquot ב 50 μL לכל צינור (או נפח הרצוי). יש לאחסן בטמפרטורה של −20°C בחושך למשך עד שנה.
  2. הכן פתרון מלאי של Bafilomycin A1 ב- 1 mM ב- DMSO. Aliquot ב 50 μL לכל צינור (או נפח הרצוי). יש לאחסן בטמפרטורה של −20°C למשך עד 6 חודשים.
  3. הכן תמיסת מלאי של Calcein Violet 450 AM ב- 1 mM ב- DMSO. Aliquot ב 50 μL לכל צינור (או נפח הרצוי). יש לאחסן בטמפרטורה של −20°C בחושך למשך עד שנה.
  4. לטיפול בתאים בתרבית במבחנה, הכינו 10 mM תמיסות מלאי מרוכזות של חומרים מעוררי סנסנציה בממס המתאים, ועקרו באמצעות מסנני מזרק של 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 20°C- או לפי הוראות היצרן.
    הערה: לצורך אספקת חומרים כימותרפיים מעוררי סנסנציה in vivo (לעכברים עם גידולים מבוססים), הסוכנים צריכים להיות בדרגה USP ומדוללים למלח ממלאי מרוכז ממש לפני ההזרקה.
  5. הכן מדיום תרבית שלם עבור קווי התאים שבהם נעשה שימוש.
    הערה: לדוגמה, הכינו מדיום לתאי B16-F10 או A549 עם DMEM 1x + 10% FBS + תחליף גלוטמין אחד + פניצילין/סטרפטומיצין אחד. המדיה חייבת להישמר סטרילית. ניתן להשתמש בנוסחאות מדיה אחרות הספציפיות לקו התא. רכיבים מסוימים כגון גלוטתיון עשויים, במקרים מסוימים, להפריע להתפרצות של senescence. בדיקה אמפירית של ניסוחים מדיה שונים צריך להתבצע אם הופעת senescence נמוך מהצפוי או לא נצפתה עם סוכני כימותרפיה שליטה.
  6. הכינו מכתימים ומאגרי כביסה.
    1. יש להכין 1% אלבומין מסרום בקר (BSA) ב-PBS אחד לשימוש בהליכי צביעה. יש להמיס 2 גרם BSA ב-200 מ"ל של PBS ולערבב במשך 10 דקות, או עד להמסה מלאה, בטמפרטורת החדר.
    2. הכינו 0.5% BSA ב-PBS אחד כמאגר כביסה. דילל 100 מ"ל של 1% BSA מוכן בשלב 1.6.1 לתוך 100 מ"ל של 1x PBS עבור 0.5% BSA.
    3. אחסנו מאגרים בטמפרטורה של 4 °C למשך עד חודש אחד.
  7. יש להכין 4% פרפורמלדהיד ב-PBS אחד. השתמש באמפולות פרפורמלדהיד אטומות הזמינות מסחרית (לדוגמה, 16% v/v) לנוחות ויציבות: 2.5 מ"ל של 16% PFA + 7.5 מ"ל של PBS אחד (= 10 מ"ל של 4% PFA). התאם את עוצמת הקול המוכנה בהתאם לנפח הכולל הדרוש לכל ניסוי.
    הערה: הכן לפי הצורך לקיבוע תאים בלבד; להכין טרי בכל פעם.
  8. הכן מאגר מיון FACS: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7.2). מסנן סטרילי באמצעות מכשיר סינון של 0.22 מיקרומטר ומאחסן ב- 4 °C למשך עד חודש.
    הערה: הכן לפי הצורך למיון FACS בלבד. נוסחאות מאגר מיון זרימה עשויות להשתנות בין מכשירי FACS. הניסוח הנ"ל תואם את המכשיר ששימש במחקר זה (ראו טבלת חומרים). עיין בהנחיות היצרן.
  9. הכן פתרון דיסוציאציה של הגידול: 20 מיקרוגרם / מ"ל ליבראז TL + 100 מיקרוגרם / מ"ל DNAse I במדיה RPMI-1640 (ללא FBS או תוספי מזון אחרים). פתרונות מלאי שימושיים לשמירה על היד של Liberase TL (מוכן ומאוחסן לפי הוראות היצרן) ו- DNAse I (100 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים כפולים [ddH2O], המאוחסנים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס).
    הערה: יש להכין לפי הצורך אם משתמשים בגידולים בלבד; להכין טרי בכל פעם.

2. אינדוקציה של senescence על ידי תרופות כימותרפיות בתאים סרטניים בתרבית

הערה: כל שלבי המניפולציה של התאים בסעיף זה צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית תוך שימוש בשיטות סטריליות. סעיף זה נכתב עבור סוגי תאים דבקים. ניתן להשתמש בתאי תרחיף עם שינויים מתאימים כאמור.

  1. לגדל קווי תאים סרטניים על פי הפרוטוקול הסטנדרטי של הספק או המעבדה שסיפקה את קווי התאים הספציפיים שבהם נעשה שימוש.
    הערה: תאי מעבר נמוך (p < 10) מועדפים בדרך כלל מכיוון שיהיו רמות נמוכות יותר של סנסנציה משוכפלת, כלומר רקע נמוך יותר, בדגימות תאים שלא טופלו.
  2. יום אחד לפני השראת סנסנציה על ידי תרופות, קציר תאים עם טריפסין-EDTA 0.25% (או לפי המומלץ). נטרול טריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית שלם, והעברת השעיית התא לצינור חרוטי סטרילי.
    הערה: שלב זה אינו נחוץ עבור תאי תרחיף.
  3. לספור את התאים בשיטת ההאציטומטר הסטנדרטית ולרשום תאים/מ"ל. תאי צלחת ב 1 × 10 3-10 × 103 תאים / ס"מ2 בכלי תרבית פלסטיק סטנדרטיים 6 בארות.
    הערה: צפיפות הציפוי האופטימלית תלויה בקצב ההתרבות של התאים ויש לקבוע אותה על-ידי המשתמש. התאים צריכים להיות בשלבי גדילה בטמפרטורה של כ-10%-20% בזמן הטיפול (כלומר, לאחר דגירה של 18-24 שעות לאחר הציפוי). הצפיפות ההתחלתית (תאים/מ"ל) של תאי ההשעיה צריכה להיקבע על-ידי המשתמש. לוחות של שש בארות מניבים בדרך כלל מספיק תאים סנסנטיים לכל באר עבור דגימת ניתוח ציטומטריה סטנדרטית אחת. אם ממיינים זרימה, יש להשתמש בשטח פנים גדול בהרבה (למשל, לוחות P150 מרובים) כדי לאפשר התאוששות של מספר מספיק של תאים סנסנטיים עבור בדיקות במורד הזרם (≥1 × 106).
  4. תאי דגירה מצופים למשך הלילה (18-24 שעות) באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ותבנית לחות.
  5. טפלו בתאים המצופים באמצעות תרופות כימותרפיות מעוררות סנסנציה. כלול לפחות בקרה חיובית אחת, למשל, אטופוסיד (ETO) או בלומיצין (BLM). הכן בארות כפולות לכל תרופה. כלול ערכה אחת המטופלת ברכב בלבד כבקרה.
    הערה: עקומת מינון עבור כל חומר ניסיוני צריכה להיבדק על ידי המשתמש כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור אינדוקציה של סנסנציה בקווי התאים שבהם נעשה שימוש.
  6. לדגור תאים במשך 4 ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ומחבת לחות כדי לאפשר את הופעת senescence. יש לבחון מדי יום את השינויים הצפויים במורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אור.
    הערה: זמני הדגירה בין 3-5 ימים עשויים להתקבל בהתאם לקצב הופעת הסנסנציה. ניתן לשנות את המדיה ולהחיל מחדש את הסוכן (או לא), לפי הצורך, כדי לקדם תנאי גדילה בריאים תוך השגת אחוז מקובל של תאים סנסנטיים.
  7. לאחר הופעת senescence, לקצור את התאים על ידי הוספת טריפסין-EDTA 0.25% במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר תאים מנותקים לתוך ההשעיה, לנטרל טריפסין עם נפח שווה של מדיום שלם.
    הערה: שלב זה אינו נחוץ עבור תאים הגדלים בתרחיף. אם תבוצע צביעת סמן פני השטח, הימנעו משימוש בטריפסין-EDTA מכיוון שהוא יכול להרוס באופן זמני אנטיגנים על פני השטח על התאים. במקום זאת, נתקו בעדינות את המונו-שכבה באמצעות מגרד תאי פלסטיק סטרילי (או מגיב דיסוציאציה חלופי שנועד לשמר אנטיגנים על פני השטח).
  8. ספור את התאים בכל דגימה באמצעות המציטומטר. חשב את התאים/מ"ל עבור כל דגימה.
    הערה: ניתן להוסיף טריפאן כחול כדי להעריך את אחוז התאים המתים בשלב זה (כלומר, עקב טיפול תרופתי), אך מוות תאי ייקבע גם באמצעות צבע כדאיות פלואורסצנטי במהלך תהליך העבודה של צביעת DDAOG.
  9. Aliquot ≥0.5 × 106 תאים לכל דגימה לתוך צינורות microcentrifuge 1.7 מ"ל.
    הערה: יש לתקנן את מספר התאים לכל דגימה בכל הדגימות.
  10. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט.
    הערה: אם מיקרוצנטריפוגה בקירור אינה זמינה, ייתכן שיהיה מקובל לבצע צנטריפוגות בטמפרטורת הסביבה עבור סוגי תאים גמישים מסוימים.
  11. המשך לצביעת DDAOG בסעיף 4.

3. אינדוקציה של senescence על ידי תרופות כימותרפיות בגידולים שנקבעו בעכברים

הערה: אם תאי הגידול ימוינו באמצעות FACS, ודא סטריליות בכל שלב על-ידי עבודה בארון בטיחות ביולוגית ועבודה עם מכשירים, נהלים וריאגנטים סטריליים.

  1. צור מודלים של גידולי עכברים על ידי הזרקת תאים סרטניים באופן תת עורי, על פי שיטות סטנדרטיות (למשל, Appelbe et al.19).
    הערה: יש להתאים את מספר התאים הסרטניים שיש להזריק, את מקום ההזרקה ואת זן העכבר המתאים לכל פרוטוקול. כאן, תאי B16-F10 הוזרקו תת עורית ב 1 × 106 תאים ב 0.1 מ"ל של מלוחים (1 × 107 תאים / מ"ל).
    1. ודא כי הכדאיות של תאים באמצעות כחול טריפאן הוא >90% לפני ביצוע זריקות. הרדימו את העכברים עם איזופלורן.
    2. מרדימים נקבות C57/BL6 בנות 6-7 שבועות בתערובת של 3% איזופלורן ואוויר ומתחזקות בתנאים אלה בתא אינדוקציה הממוקם בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי. אשר הרדמה על ידי צביטה עדינה של כף הרגל של העכבר. יש למרוח משחה וטרינרית סטרילית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית במהלך ההליך. במהלך ההליך, לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר באמצעות מנורת חימום.
    3. בעבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, הסר את העכבר מתא האינדוקציה והנח אותו במגע עם חרוט אף המספק אספקת איזופלורן של 3%. יש לגלח את אזור האגף במקום ההזרקה באמצעות סכין גילוח חשמלי נקי. ערבבו את מתלי התאים המוכנים לזמן קצר על ידי היפוך ידני של הצינור ממש לפני ההזרקה, והזריקו את מתלה התא באופן תת-עורי לתוך האגף המגולח באמצעות מזרק סטרילי של 0.5 מ"ל המצויד במחט סטרילית של 27 גרם. הסר את העכבר ממכסה המנוע והעבר אותו לכלוב ההתאוששות.
    4. בכלוב ההתאוששות, עקוב אחר הסימנים החיוניים של העכברים ברציפות עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על יציבות עצם החזה, להדגים את רפלקס הימין, והם מסוגלים לנוע בבטחה בכלוב. אין להשאיר עכברים ללא השגחה או להחזיר בעלי חיים שעברו חיסון תאי גידול לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמתם המלאה. עקוב אחר כל העכברים המחוסנים מדי יום לירידה במשקל, פעילות מופחתת / ניידות ותסמינים נוירולוגיים; להרדים עכברים המציגים תסמינים חמורים בכל קטגוריה. לעכברים המציגים תסמיני כאב לאחר החיסון, יש לתת בופרנורפין (0.1-0.2 מ"ג/ק"ג) פעם אחת באופן תת-עורי.
      הערה: יש להרדים עכברים המפגינים כאב מתמשך לאחר בופרנורפין.
  2. החל 5-7 ימים לאחר חיסון תאים סרטניים, למדוד את צמיחת הגידול עם קליפרים כל 2-3 ימים. ליזום טיפול פרוזנסנטי כאשר הגידול הגיע 50 מ"מ 3 ± 10 מ"מ 3 נפח.
    הערה: בעבודה זו, מינונים של דוקסורוביצין הידרוכלוריד (DOX) או דוקסורוביצין ליפוזומלי (PLD) בדרגה של 10 מ"ג/ק"ג ניתנו בהזרקת נתרן כלורי (USP) ב-0.9%. תרופות הוזרקו תוך צפק 3x, אחת ל 5 ימים, החל כאשר הגידולים הגיעו 50 מ"מ 3 ± 10 מ"מ3. עכברים התאוששו במשך 7 ימים לאחר הטיפול הסופי כדי לאפשר את הופעת TIS בגידולים. יש לייעל את מינוני האינדוקציה של Senescence ואת התנאים לטיפולים אחרים ו/או למודלים של גידולים.
  3. לאחר 7 ימים לאחר הטיפול התרופתי הסופי, להקריב את העכברים על ידי מנת יתר של CO2 ונקע צוואר הרחם או שיטות מאושרות אחרות בהתאם להנחיות העבודה של חיות מעבדה. הבלו את הגידולים ואסוף אותם בצינורות סטריליים או צלחות 6 בארות מלאות במדיום גידול RPMI סטרילי (כדי לשמר את הכדאיות במהלך העיבוד).
    הערה: אם מבצעים בדיקה היסטולוגית (למשל, X-Gal או אימונוהיסטוכימיה), ניתן לחתוך גידולים כאן, כאשר חצי הקפאה ב-O.C.T. מטמיעה בינוני וקריוקציה באמצעות הליכים סטנדרטיים להיסטולוגיה של רקמות קפואות. מחצית הגידול הנותרת צריכה להניב חומר רב לדיסוציאציה וכתמת DDAOG.
  4. מעבירים גידול אחד לצלחת פלסטיק P100 המכילה 5 מ"ל של מדיום RPMI. טחנו את הגידול לחתיכות באמצעות אזמל.
  5. העבר 5 מ"ל של ההשעיה של חתיכות הגידול המכילות תאים מרחפים ופסולת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש בקצה הרחב יותר של פיפט סרולוגי של 25 מ"ל להעברת מתלה זה אם קיימת פסולת גדולה. שטפו את התבנית בנפח נוסף של RPMI סטרילי לאיסוף חומרים. מכסים ומניחים את הצינור החרוטי על הקרח.
  6. חזור על שלבים 3.45-3.5 עבור הגידולים הנותרים. יש להשתמש בצלחת ואיזמל נפרדים לכל גידול כדי למנוע זיהום צולב, או לשטוף היטב עם PBS בין הגידולים. יש להשתמש ב-5 מ"ל של מדיום טרי לטחינת כל גידול.
  7. הכן את פתרון הדיסוציאציה של הגידול: 20 מיקרוגרם / מ"ל ליבראז TL + 100 מיקרוגרם / מ"ל DNAse I במדיה RPMI-1640 (ללא FBS).
    הערה: קיימות פורמולציות יעילות רבות עבור פתרונות דיסוציאציה של גידולים ויכולות לכלול מגוון אנזימים ורכיבים אחרים מיצרנים שונים. ריכוזים אופטימליים של רכיבים יכולים להשתנות מאוד בין סוגי גידולים. אם תאי דם אדומים נמצאים מאוד בגידול, תזה של תאי דם אדומים עשויה להתבצע בנוסף; אם תאים מתים הם בעיה, ניתן להשתמש בערכת הסרת תאים מתים. מומלץ מאוד למשתמש לקבוע באופן עצמאי תנאי דיסוציאציה אופטימליים של הגידול המספקים כדאיות גבוהה ונוכחות נמוכה של תאים מזהמים, חומר חיבור ופסולת.
  8. צנטריפוגה כל דגימות הגידול בצינורות חרוטיים במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם (4 מעלות צלזיוס). הסר את הסופרנטנט.
  9. הוסף 1-5 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה של הגידול לכל דגימת גידול, בהתאם לנפח חומר הגידול. ודא שיש 1-2 מ"ל עודף של כדור חומר הגידול בצינור. מערבולת במהירות מתונה לערבוב.
  10. מניחים את הדגימות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מהיר למשך 45 דקות. מערבולת לזמן קצר כל 15 דקות.
  11. סנן כל דגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. אם הדגימות צמיגות מכדי לעבור דרך המסנן, הוסף 10 מ"ל של RPMI-1640 בינוני כדי לדלל. שטפו את המסננים במדיום RPMI כדי לאסוף את שאריות התאים.
  12. השתמש בהמציטומטר כדי לספור את התאים/מ"ל עבור כל דגימה.
  13. Aliquot שני או יותר שכפולים של 5 × 106 תאים לכל דגימת גידול.
  14. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם (4 מעלות צלזיוס). הסר את הסופרנטנט.
  15. (אופציונלי) הקפיא את דגימות הגידול להכתמת DDAOG מאוחרת יותר אם תרצה בכך.
    1. יש לתלות מחדש את גלולת תאי הגידול המנותקת במדיום שימור בהקפאה: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, מוכן בתנאים סטריליים ב 5 × 106 תאים / מ"ל.
    2. Aliquot 1 מ"ל של השעיית התא לתוך כל cryovial.
    3. מקפיאים את הקריוביאלים למשך 24 שעות במיכל הקפאת תאי איזופרופנול בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס; לאחר מכן, העבר ל- cryostorage חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך יותר (>1 שבוע).
    4. כאשר רוצים להכתים, הפשירו את הקריביאלים על הקרח והמשיכו לצביעת DDAOG בסעיף 4.
      הערה: גידולים מסוימים עשויים שלא להישאר בני קיימא באמצעות שימור בהקפאה, ועמידות לתהליך זה צריכה להיות מוערכת על ידי המשתמש עבור מודל הגידול של עניין.
  16. המשך לסעיף 4 לצביעת DDAOG.

4. צביעת DDAOG של SA-β-Gal בדגימות תאים או גידולים

  1. יש לדלל מלאי של 1 mM Bafilomycin A1 ב-1:1,000x למדיום DMEM (ללא FBS) לקבלת ריכוז סופי של 1 μM.
  2. הוסף תמיסת Baf-DMEM מוכנה לדגימות כדורי התא (משלב 2.11 או שלב 3.16) לקבלת ריכוז של 1 × 106 תאים למ"ל.
    הערה: לדוגמה, אם אתה משתמש ב- 0.5 × 106 תאים לדגימה, הוסף 0.5 מ"ל של Baf-DMEM. עבור גידולים, 5 × 106 תאים יכולים להיות מוכתמים ב 5 מ"ל של Baf-DMEM.
  3. דגירה במשך 30 דקות ב-37°C (ללא CO2) על סיבוב / שייקר שנקבע במהירות איטית.
    הערה: הימנעו מאינקובטורים של CO2 לתהליך הצביעה, מה שעלול להחמצה של תמיסות ובכך להפריע לצביעת Baf ו-DDAOG.
  4. ללא שטיפה, הוסיפו את תמיסת המלאי DDAOG (5 מ"ג/מ"ל) בטמפרטורה של 1:500x (10 מיקרוגרם/מ"ל סופית) לכל דגימה. פיפטה לערבוב. יש להחליף על רוטטור/שייקר בטמפרטורה של 37°C (ללא CO2) למשך 60 דקות. יש להגן מפני אור ישיר.
  5. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט.
  6. יש לשטוף עם 1 מ"ל של 0.5% BSA קר כקרח לכל צינור ופיפטה כדי לערבב. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. חזור על שלב זה 2x כדי לשטוף היטב את התאים. הסר את הסופר-נטנט והמשך.
    הערה: חשוב לבצע את שלבי השטיפה בשלב 4.6 כדי להסיר DDAOG, אשר יכול להפגין פליטה פלואורסצנטית לא רצויה (460/610 ננומטר).
    הערה: אם יש צורך במערכת החיסון עבור סמני פני התא, המשך לסעיף 5 להלן.
  7. (אופציונלי) קיבוע ואחסון של תאים מוכתמים DDAOG לניתוח מאוחר יותר
    1. הוסיפו 0.5 מ"ל של פרפורמלדהיד קר כקרח 4% פרפורמלדהיד לכל דגימה שטופה. פיפטה לערבוב.
    2. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף את התאים 2x עם 1 מ"ל של PBS.
    4. אחסן את הדגימות למשך עד שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני ניתוח ציטומטריה של זרימה.
      הערה: עבור דוגמאות קבועות, דלג על שלב 4.8.
  8. יש לדלל את מלאי Calcein Violet 450 AM (1 mM) ב-1:1,000x ל-1% BSA-PBS (1 μM סופי). הוסף 300 μL (עבור דגימות תאים בתרבית) או 1,000 μL (עבור דגימות גידול) לכדורי התאים השטופים משלב 4.6. דגירה במשך 15 דקות על קרח בחושך.
  9. המשך להגדרת ציטומטריה של זרימה (סעיף 6).

5. (אופציונלי) חיזוק חיסוני לסמני פני התא בשילוב עם DDAOG

הערה: כמו בכל ניסוי ציטומטריה של זרימה, יש להכין דגימות בקרה מוכתמות בודדות עם DDAOG בלבד ונוגדן פלואורסצנטי בלבד כדי לקבוע crosstalk (אם בכלל) על פני תעלות פלואורסצנטיות. אם crosstalk הוא ציין, פיצוי ציטומטריה זרימה סטנדרטית צריך להתבצע20.

  1. השהה את כדורי התא שהתקבלו בשלב 4.6 ב- 100 μL של חיץ מכתים (1% BSA ב- 1x PBS).
  2. הוסף את מגיב חסימת קולטן Fc המתאים למין התא (עכבר או אדם) בטיטרציה המומלצת על ידי היצרן. דגירה במשך 10 דקות ב 24 מעלות צלזיוס.
  3. יש להוסיף נוגדנים מצומדים לפלואורופור בטיטרציה המומלצת על ידי היצרן (או נקבעת על ידי המשתמש). דגירה במשך 20 דקות על קרח, מוגן מפני אור.
  4. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט.
  5. יש לשטוף עם 1 מ"ל של מאגר כביסה קר כקרח (0.5% BSA-PBS) לכל צינור ופיפטה כדי לערבב. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. חזור על שלב זה 2x כדי לשטוף היטב את התאים.
  6. יש לדלל 1 mM Calcein Violet 450 AM בשעה 1:1,000x ל-1% BSA-PBS. יש להוסיף 300 μL לכדורי התא השטופים משלב 5.5. דגירה במשך 15 דקות על קרח בחושך.
  7. המשך לניתוח ציטומטריה של זרימה (סעיפים 6-7).

6. הגדרת ציטומטר זרימה ואיסוף נתונים

  1. העבר את דגימות התאים לצינורות התואמים למכשיר הציטומטריה של הזרימה. מניחים את הצינורות על קרח ושומרים עליהם מוגנים מפני אור.
    הערה: אם נצפים אגרגטים במתלי התאים, מעבירים את המתלה דרך מסננות תאים של 70-100 מיקרומטר לפני הניתוח. אין להשתמש במסננים של 40 מיקרומטר מכיוון שהם יכולים להוציא חלק מהתאים הסנסנטיים הגדולים יותר.
  2. בתוכנה המוזכרת (ראה טבלת החומרים), פתח את העלילות הבאות: 1) FSC-A לעומת תרשים נקודה SSC-A, 2) היסטוגרמה של ערוץ סגול, 3) ערוץ אדום רחוק (למשל, APC-A) לעומת ערוץ ירוק (למשל, FITC-A) מתווה נקודה.
    הערה: ניתן להשתמש גם בעלילות אי-הכללה כפולות ובהיסטוגרמות חד-ערוציות, אך הן אינן נדרשות בהחלט.
  3. ייזום רכישת נתוני ציטומטר.
    1. הנח את דגימת הבקרה לרכב בלבד מוכתמת ב- DDAOG על פתח הכניסה. במהירות צריכה נמוכה, להתחיל לרכוש נתונים לדוגמה.
    2. התאם את מתחי FSC ו- SSC כך ש- >90% מהאירועים ייכללו בעלילה. אם התאים אינם מתאימים היטב לחלקה, הנמיכו את הגדרת קנה המידה של השטח ל-0.33-0.5 יחידות.
    3. הסר את דוגמת הרכב בלבד מבלי להקליט נתונים.
    4. (אופציונלי) הוסף טיפה אחת של מיקרוספרות כיול קשת לצינור ציטומטר עם 1 מ"ל של PBS. הנח את הצינור על יציאת הכניסה של הציטומטר. התחל לרכוש נתונים לדוגמה.
    5. התאם את מתחי התעלה הסגולה, הירוקה והאדומה הרחוקה כך שהשיא העליון של מיקרוספרה קשת בענן יהיה בטווח של 104-10 5 יחידות של פלואורסצנציה יחסית בכל ערוץ וכל הפסגות מופרדות היטב בכל ערוץ. שיא של 10,000 אירועים. הסר את הצינור.
  4. הנח את דגימת הבקרה החיובית (לדוגמה, BLM, ETO) מוכתמת ב- DDAOG על יציאת הכניסה. במהירות נמוכה, לרכוש נתונים לדוגמה. התבונן באירועים בערוצים FSC, SSC, סגול, ירוק ואדום רחוק כדי להבטיח שלמעלה מ-90% מהאירועים כלולים בכל המגרשים. חפש עלייה באות המיקוד האוטומטי וה-DDAOG לעומת שליטה ברכב בלבד.
  5. אם אתה משתמש בציטומטר מיון, התחל מיון בשלב זה.
    1. למטרות שמירת רשומות, רשום 10,000 תאים עבור דגימת הבקרה וכל דגימה ממוינת.
    2. מיין את כמות התאים הרצויה (≥1 × 106 מתאים בדרך כלל) לצינור איסוף המתאים למכשיר עם מדיום תרבית של 3-5 מ"ל.
    3. לאחר המיון, המשך לתרבות או ניתוח במורד הזרם.
    4. דלג לסעיף 7 לניתוח שגרתי של דגימות ממוינות.
  6. אם משתמשים בנוגדנים פלואורסצנטיים, מטב את מתחי התעלה כאן באמצעות הדגימות הלא מוכתמות, המוכתמות הבודדות והמוכתמות הכפולות שהוכנו בסעיף 5.
    הערה: עבור ציטומטר הזרימה המכויל המשמש כאן, מתחי התעלה האופטימליים ירדו בדרך כלל בין 250 ל- 600 (טווח ביניים), אך המתחים האופטימליים וטווחי מתחי התעלה ישתנו בין מכשירים. הימנע משימוש במתחים בטווחים נמוכים או גבוהים מאוד, שעלולים לדכא אות או להגביר רעש.
  7. לאחר השלמת שלבים 6.1-6.5 וביצוע התאמות להגדרות הציטומטר לפי הצורך, רשום נתונים עבור כל הדגימות. ודא שההגדרות נשארות אחידות עבור כל ההקלטות לדוגמה. תעד ≥10,000 אירועים לכל דגימת תא בתרבית או ≥100,000 אירועים לכל דגימת תא גידול.
    הערה: למרות שניתן לבצע gating וניתוח באמצעות תוכנה לרכישת נתונים (לדוגמה, FACSDiva), זרימת עבודה מלאה של gating וניתוח שתתבצע לאחר הרכישה באמצעות תוכנת ניתוח נפרדת (FlowJo) מתוארת בסעיף 7 להלן. ניתוח לאחר הרכישה עדיף לקצר את הזמן בתחנת העבודה ציטומטר ולנצל כלים נוספים הכלולים בתוכנת הניתוח הייעודית.
  8. שמור נתונים לדוגמה בתבנית קובץ .fcs. ייצא את הקבצים למחשב תחנת עבודה המצויד בתוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה (לדוגמה, FlowJo). המשך לסעיף 7.

7. ניתוח נתוני ציטומטריה של זרימה

הערה: זרימת העבודה המוצגת משתמשת בתוכנת FlowJo. ניתן להשתמש בתוכנה חלופית לניתוח נתוני ציטומטריה של זרימה אם השלבים העיקריים המתוארים בסעיף זה מתבצעים באופן דומה.

  1. באמצעות תוכנת FlowJo, פתח קבצי נתונים .fcs משלב 6.7.
  2. פתח את חלון הפריסה.
  3. גרור ושחרר את כל הדוגמאות לחלון הפריסה.
  4. שער תאים קיימא.
    1. תחילה לחץ פעמיים על הנתונים לדוגמה עבור פקד הרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלו.
    2. הצג את הנתונים באופן חזותי כהיסטוגרמה של ערוץ סגול. זהה את התאים בני הקיימא המוכתמים על-ידי CV450 בהתבסס על הפלואורסצנטיות הבהירה יותר שלהם מאשר התאים המתים.
    3. צייר שער באמצעות כלי ההיסטוגרמה בעלת השער הבודד כדי לכלול תאים בני קיימא בלבד. תן שם לשער קיימא.
    4. לאחר מכן, מחלון פריסת הדגימה, גרור את השער בר-הקיימא אל דגימות התאים האחרות כדי להחיל את השער באופן אחיד.
    5. בחלון הפריסה, הצג באופן חזותי את כל הדוגמאות כהיסטוגרמות של ערוץ סגול (כדאיות). ודא כי גידור תאים בר קיימא מתאים על פני דגימות לפני שתמשיך; אם לא, בצע התאמות לפי הצורך.
      הערה: צביעת כדאיות יכולה להציג שינויים בין טיפולים או גידולים.
  5. שער תאים סנסנטיים.
    1. לחץ פעמיים על נתוני התא המגודרים עבור בקרת הרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלה.
    2. הצג את הנתונים באופן חזותי כמתווה נקודה עבור ערוץ אדום רחוק (DDAOG) לעומת ערוץ ירוק (AF).
    3. צייר שער באמצעות כלי חיתוך המלבן כדי לכלול <5% מהתאים DDAOG+ ו- AF+ (הרביע הימני העליון). תן שם לשער.
    4. לאחר מכן, מחלון פריסת הדגימה, גרור את השער הסנסנטי אל תת-הקבוצות הקיימות של דגימות התאים האחרות כדי להחיל את השער באופן אחיד.
    5. לתוך חלון הפריסה, גרור ושחרר את כל קבוצות המשנה של התאים הקיימות המגודרות בסעיף 7.4. הצג באופן חזותי את כל הדוגמאות הקיימות כעלילות נקודה אדומות רחוקות (לדוגמה, APC-A) לעומת עלילות נקודה של ערוץ ירוק (לדוגמה, FITC-A).
    6. ודא שהשער הסנסנטי המשורטט בשלב 7.5.3 גלוי בכל המגרשים ושהשער לבקרת הרכב בלבד מציג ≤5%-10% תאים סנסנטיים.
  6. לאחר שאחוז התאים הסנסנטיים נקבע באמצעות השלבים לעיל, הצג את הנתונים שהתקבלו באמצעות חלקות FlowJo, שסוכמו בטבלת נתונים ו/או נותחו סטטיסטית באמצעות תוכנה סטנדרטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מספר ניסויים בוצעו כדי להדגים את יכולת ההשוואה של DDAOG ל-X-Gal ו-C12-FDG לזיהוי סנסנציה על ידי SA-β-Gal. ראשית, X-Gal שימש להכתמת תאי מלנומה מסוג B16-F10 המושרים על-ידי ETO (איור 2A). צבע כחול עז התפתח בתת-קבוצה של תאים שטופלו ב-ETO, בעוד שתאים אחרים הפגינו פחות כתמים כחולים עזים. המורפולוגיה הוגדלה ברוב התאים שטופלו ב-ETO. צביעת תאים שטופלו ב-ETO במצע פלואורסצנטי SA-β-Gal C12-FDG (ירוק) או DDAOG (אדום רחוק) הדגימה דפוסי צביעה ושינויי עוצמה דומים לאלה של X-Gal (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במהלך העשור האחרון לערך, ציטומטריה של זרימה הפכה לפלטפורמת בדיקה נפוצה יותר בחקר הסרטן בשל הפופולריות המתפתחת של אימונולוגיה של גידולים, פיתוח ציטומטרים של זרימה בעלות נמוכה יותר ושיפור מתקני מכשור משותפים במוסדות אקדמיים. בדיקות צבעוניות הן כעת סטנדרטיות, מכיוון שרוב המכשירים החדשים מצוידים במערכים אופטיים סגולים, כחולים-ירוקים ואדומים עד אדומים רחוקים. לפיכך, פרוטוקול DDAOG זה עשוי להיות תואם למגוון רחב של ציטומטרים של זרימה. כמובן, כל ציטומטר זרימה צריך להיות מוערך על ידי המשתמש. יש לנקוט משנה זהירות בעת הוספת פלואורו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר על מחקר זה.

תודות

אנו מודים למתקן ליבת הציטומטריה והנוגדנים באוניברסיטת שיקגו על התמיכה במכשור ציטומטריה של זרימה. המרכז לחקר בעלי חיים באוניברסיטת שיקגו סיפק דיור לבעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בפילומיצין A1מוצרי מחקר בינלאומייםB40500
בלאומיצין סולפט קיימן13877
אלבומין סרום בקר (BSA)US ביולוגיA1380
Calcein Violet 450 AM כדאיות צבעThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
DPP4 נוגדן, PE מצומדBiolegend137803Clone H194-112
קו תאים: A549 אדנוקרצינומה של ריאות אנושיותאוסף תרבות מסוג אמריקאיCCL-185
קו תאים: מלנומה של עכבר B16-F10תרבות מסוג אמריקאיCRL-6475
מגרד תאיםקורנינג3008
מסנני תאים, 100 ומיקרו; m Falcon352360
DDAO-GalactosideLife TechnologiesD6488
DMEM בינוני 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAse ISigmaDN25
Doxorubicin, הזרקת הידרוכלוריד (USP)פייזרNDC 0069-3032-20
דוקסורוביצין, PEGylated ליפוזומלי (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0.5 MLife Technologies15575-038
אטופוסיד קיימן12092
FBSאומגה FB-11
Fc קולטן חוסם מגיבBiolegend101320אנטי עכבר CD16/32
ציטומטר זרימה (מנתח תאים)Becton Dickinson (BD)שוניםLSR
ציטומטר זרימה (סדרן תאים)Becton Dickinson (BD)שוניםFACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001Roche
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Sciences15710
פניצילין/סטרפטומיצין 100xLife Technologies15140122
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 1xCorningMT21031CVPBS של Dulbecco (ללא סידן ומגנזיום)
חלקיקי כיול קשת בענן, ערכת אולטרהSpheroTechUCRP-38-2K3.5-3.9 ומיקרו; m, 2E6/mL
RPMI-1640 בינוני 1xLife Technologies11875-119
נתרן כלורי 0.9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
תוכנה לרכישת נתוני ציטומטר, "FACSDiva"Becton Dickinson (BD)n/aצור קשר עם BD לקבלת רישיון
תוכנה לניתוח נתוני ציטומטר, "FlowJo"TreeStarn/aצור קשר עם TreeStar לקבלת רישיון
Trypsin-EDTA 0.25%Life Technologies25200-114
אוסף

מקורות

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501(2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630(2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366(2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441(2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677(2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DDAOG
בדיקה פלואורסצנטית פלואורסצנטית β-גלקטוזידאז הקשורה לזיהוי והעשרה של תאי גידול סנסנטיים על ידי ציטומטריה של זרימה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.