מאמר שיטה

חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי

DOI:

10.3791/64179

⸱

9 בדצמבר 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש את היישום של טכניקת כתם מערבית כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2. הפרוטוקול מתאר את חקירת הזרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז Thr906/1007 באמצעות כתם מערבי. כמו כן, שיטות נוספות לאישור פעילות KCC2 מודגשות בקצרה בטקסט זה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אשלגן כלורי cotransporters 2 (KCC2) הוא חבר במשפחת נשאים מומסים 12 (SLC12) של קטיון-כלוריד-cotransporters (CCCs), הנמצא באופן בלעדי בנוירון והוא חיוני לתפקוד תקין של Cl- הומאוסטזיס וכתוצאה מכך עיכוב GABAergic פונקציונלי. כישלון בוויסות תקין של KCC2 הוא מזיק ונקשר לשכיחות של מספר מחלות נוירולוגיות, כולל אפילפסיה. חלה התקדמות ניכרת בכל הנוגע להבנת המנגנונים המעורבים ברגולציה של KCC2, המוסמכים לפיתוח טכניקות המאפשרות לחוקרים לחקור את תפקידיו ופעילויותיו; או באמצעות חקירות ישירות (הערכת פוספורילציה באתרים רגולטוריים של קינאז) או בעקיפין (תצפית וניטור פעילות GABA). כאן, הפרוטוקול מדגיש כיצד לחקור זרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז - Thr906 ו- Thr1007 - באמצעות טכניקת כתם מערבית. ישנן שיטות קלאסיות אחרות המשמשות למדידה ישירה של פעילות KCC2, כגון יון רובידיום ובדיקת ספיגת יוני תליום. טכניקות נוספות כגון טלאי-מהדק-אלקטרופיזיולוגיה משמשות למדידת פעילות GABA; לפיכך, משקף בעקיפין KCC2 מופעל ו / או מומת כפי שנודע על ידי הערכה של הומאוסטזיס יון כלוריד תוך תאי. כמה מהטכניקות הנוספות הללו יידונו בקצרה בכתב יד זה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אשלגן כלורי cotransporters 2 (KCC2) הוא חבר במשפחת נשאים מומסים 12 (SLC12) של קטיון-כלוריד-cotransporters (CCCs), הנמצא באופן בלעדי בנוירון והוא חיוני לתפקוד תקין של Cl- הומאוסטזיס וכתוצאה מכך עיכוב GABAergicתפקודי 1,2,3,4. שמירה על ריכוז Cl תוך-עצבי נמוך ([Cl-]i) ב-4-6 mM על-ידי KCC2 מקלה על γ-חומצה אמינו-בוטירית (GABA)/גליצין היפרפולריזציה ועיכוב סינפטי במוח ובחוט השדרה5. כישלון בוויסות תקין של KCC2 נקשר לשכיחות של מספר מחלות נוירולוגיות, כולל אפילפסיה4. יתר על כן, ירידה בשחול Cl− בתיווך KCC2 ופגיעה בהיפר-פולריזציה של GABAA ו/או זרמים בתיווך קולטן גליצין היו מעורבים באפילפסיה, כאב נוירופתי וספסטיות 6,7. KCC2 עצבי מווסת באופן שלילי באמצעות זרחון של שאריות רגולטוריות מרכזיות בתחום התוך-תאי של מסוף C שלו על-ידי פרולין/אלנין (SPAK)/קומפלקס קינאז חמצוני מגיב לעקה חמצונית (OSR), המאפשר שמירה על פעילות GABA דה-פולריזציה בתאי עצב לא בשלים 2,8,9 . הזרחון WNK-SPAK/OSR1 משמיט שאריות תראונין 906 ו-1007 (Thr906/Thr1007) ולאחר מכן מפחית את ביטוי הגן mRNA של KCC2, מה שמוביל להידרדרות בתפקוד הפיזיולוגי שלו 8,10. חשוב מכך, עם זאת, זו כבר עובדה שקומפלקס הקינאז WNK-SPAK/OSR1 ידוע כזרחן ומעכב ביטוי KCC2 1,2,4,11,12, וכי העיכוב של מסלולי האיתות המורכבים של קינאז לזרחן Thr906/Thr1007 נקשר לביטוי מוגבר של הגן KCC2 mRNA13,14,15 . חשוב לציין כי ויסות הביטוי העצבי KCC2 ו-Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) באמצעות זרחון חלבונים פועל במקביל ובתבניות מנוגדות 1,4,16.

חלה התקדמות עקבית וניכרת בכל הנוגע להבנת המנגנונים המעורבים ברגולציה של KCC2, המוסמכים לפיתוח טכניקות המאפשרות לחוקרים לחקור את תפקידיו ופעילויותיו; או באמצעות חקירות ישירות (הערכת פוספורילציה באתרים רגולטוריים של קינאז) או בעקיפין (תצפית וניטור פעילות GABA). הפרוטוקול המוצג כאן מדגיש את היישום של טכניקות הכתמה המערביות כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של K+-Cl- טרנספורטר משותף עצבי KCC2 על ידי חקירת הזרחון של הקוטרנספורטר באתרי הרגולציה של קינאז Thr906/1007.

כתם מערבי הוא שיטה המשמשת לזיהוי חלבונים ספציפיים בעלי עניין מדגימה של רקמה או תא. שיטה זו מפרידה תחילה את החלבונים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה. לאחר מכן החלבונים מועברים אלקטרופורטית לתמיכה מוצקה (בדרך כלל קרום) לפני שחלבון המטרה מסומן באמצעות נוגדן ספציפי. הנוגדנים מצומדים לתגים שונים או לנוגדנים מצומדים לפלואורופור המזוהים באמצעות שיטות colorimetric, chemiluminescence או פלואורסצנטיות. זה מאפשר לזהות חלבון מטרה ספציפי מתערובת של חלבונים. טכניקה זו שימשה לאפיון אתרים זרחניים של KCCs1 ושימשה לזיהוי מעכבי קינאז המעכבים זרחון KCC3 Thr991/Thr104817. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לזהות באופן ספציפי KCC2 כולל וזרחני מליסאטות תאים/רקמות. באופן עקרוני, זיהוי נוגדנים מצומדים לחלבון בטכניקה זו הוא בעל חשיבות רבה מכיוון שהוא מסייע לשפר את ההבנה של פעילויות שיתופיות באתרי הפוספו של KCC2, אשר שופך אור על המנגנונים המולקולריים המעורבים בתקנות הפיזיולוגיות שלהם. הניתוח הכמותי של ביטוי החלבון הכולל מייצג את הפונקציה והפעילות של KCC2. ישנן שיטות קלאסיות אחרות המשמשות למדידה ישירה של פעילות KCC2, כגון יון רובידיום ובדיקת ספיגת יוני תליום. טכניקות נוספות כגון טלאי-מהדק-אלקטרופיזיולוגיה משמשות למדידת פעילות GABA; לפיכך, משקף בעקיפין KCC2 מופעל ו / או מומת כפי שנודע על ידי הערכה של הומאוסטזיס יון כלוריד תוך תאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקול מתאר את שיטת הכתם המערבית לאיתור חלבונים ספציפיים בעלי עניין.

1. תרבית תאים וטרנספקציה

  1. חממו את כל הריאגנטים באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס) לפני הליך תרבית התאים. הכינו מדיום תרבית, מדיום נשר מעובד (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 1% כל אחד של 2mM L-גלוטמין, 100x חומצת אמינו לא חיונית, 100 mM נתרן פירובט ו-100 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. להפשיר ביציבות חולדה KCC2b כליה עוברית אנושית 293 תאים (HEK293rnKCC2b)18 לחלוטין באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס). העבירו את התאים מהצינור הקריוביאלי לצינור צנטריפוגה המכיל 5 מ"ל של חומר טרי. סובבו את התא ב-1200 × גרם למשך 3-5 דקות.
  3. השתמשו בפיפטת אספירטור (מקובעת למשאבת ואקום) כדי לשאוף את הסופר-נטנט והוסיפו 10 מ"ל של מדיה טרייה כדי להשעות מחדש את התאים. מעבירים את מתלה התא לצלחת בגודל 10 ס"מ.
  4. מכניסים את המנה לחממה ומאפשרים לה לגדול במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO2 . עקוב אחר תקופת הדגירה כדי להבטיח צמיחת תאים בריאה. פיצול נוסף של התאים כאשר הם הגיעו למפגש של מעל 90% לאחר תקופת הדגירה.
  5. שאפו את המדיה הישנה מתוך צלחת התאים ושטפו בעדינות את התאים עם 2 מ"ל של מלח חיץ פוספט (PBS). מוסיפים 2 מ"ל של טריפסין ודוגרים במשך כ 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. השתמש 2 מ"ל של מדיה מלאה כדי לשטוף בעדינות את התאים טריפסינים בצלחת. הוסיפו 9 מ"ל של מדיה טרייה למנות חדשות והוסיפו תמיסה של 1 מ"ל מהמנה הישנה לכל אחת מהמנות החדשות. העבירו את הכלים המפוצלים בחזרה לחממה למשך 48 שעות כדי להגיע למפגש של 90% ≥.
  7. התייחסו לתאים עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כבקרה, 8 μM staurosporine, או 0.5 mM N-ethylmaleimide (NEM) במשך 15 דקות לפני קצירת התאים בחיץ ליזה.

2. הכנת ליזטים של תאים וטעינת דגימות

  1. לשאוף את התקשורת על צלחת התרבות (מתוך נהלי transfection). מניחים את תרבית התאים על קרח ושוטפים את התאים עם PBS קר כקרח.
  2. שאפו את ה-PBS, ולאחר מכן הוסיפו 1.0 מ"ל של חיץ ליזיס קר כקרח המכיל 50 mM tris-HCl (pH 7.5), 1 mM אתילן גליקול-ביס(β-אמינואתיל אתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראאצטית (EGTA), 1 mM חומצה אתילנדיאמינטטראאצטית (EDTA), 50 mM נתרן פלואוריד, 5 mM נתרן פירופוספט, 10 mM נתרן-β-גליצרופוספט, 1 mM נתרן אורתובנאדט, 1% (w/v) טריטון X-100, 0.27 M סוכרוז, 1 mM בנזאמין, 0.1% (v/v) 2-mercaptoethanol, ו 2 mM פנילמתיל-סולפונילפלואוריד (PMSF) לתבשיל.
    הערה: נפח מאגר התזה במהלך קציר התאים משתנה בהתאם לגודל הכלים, לדוגמה, 1 מ"ל של חיץ תזה מתאים לכל 1 x 107 תאים / 100 מ"מ צלחת / 150 ס"מ 2 בקבוקון, בעוד 0.5 מ"ל מתאים לכל 5 x 106 תאים / 60 מ"מ צלחת / 75ס"מ2 בקבוקון.
  3. השתמש במגרד תאים מפלסטיק קר כדי לגרד את התאים מתחתית המנה, ולאחר מכן השתמש בעדינות בפיפטה כדי להעביר את מתלה התא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה שכבר נמצא על קרח. כל הזמן להתסיס את הצינור במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. סובבו את התא בצנטריפוגה קרה (4 מעלות צלזיוס) בטמפרטורה של 16,000 x גרם למשך 20 דקות, הסירו את הצינור בעדינות מהצנטריפוגה והניחו אותו על קרח. אסוף את הסופרנטנט לתוך צינור טרי מקורר מראש והשלך את הכדור.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את כוח הצנטריפוגה ואת הזמן בהתאם לסוג התא. עם זאת, הנחיות כלליות מעודדות צנטריפוגה בגודל 16,000 x גרם למשך 20 דקות. עם זאת, זה חייב להיקבע עבור כל ניסוי. לדוגמה, תאים עדינים כמו לויקוציטים זקוקים למהירות צנטריפוגה קלה מאוד.

3. הכנת חומרים חיסוניים מליזאטים תאיים

  1. פיפטה 300 μL של חלבון-G-sepharose לתוך צינור microcentrifuge. סובבו את התמיסה בגודל 500 x g למשך 2 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
  2. הוסף 500 μL של PBS ומערבל את הפתרון היטב. סובבו את התמיסה בגודל 500 x g למשך 2 דקות והשליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה.
  3. יש לערבב 1 מ"ג של נוגדנים נגד KCC2 Thr906 ואנטי-KCC2 Thr1007 עם 200 μL של חרוזי חלבון G-sepharose ולהשלים את הנפח ל-500 μL עם PBS. יש לנער על פלטפורמה רוטטת או גלגל מסתובב למשך שעתיים ב-4°C. יש לשטוף 2x עם PBS.
  4. בצע כימות חלבון על כל התא lysates ולהוסיף 1 מ"ג של התא lysate חרוזים שטף. דגירה עדינה בסיבוב מקצה לקצה במשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס. סובבו את החרוזים ושטפו אותם 3x עם PBS המכיל 150 mM נתרן כלורי (NaCl).
  5. יש לשטוף חומרים חיסוניים (חרוזים) פי 3 עם 200 μL של PBS. יש להשעות את הכדור הסופי ב-100 μL של חיץ דגימת ליתיום דודציל סולפט (LDS) אחד.
  6. נערו את הצינורות בשייקר רוטור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ודגרו אותם בבלוק חימום בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה של דגימת ההעמסה ב 11,000 x גרם במשך 2 דקות ולהשתמש supernatant לטעינת ג'ל.

4. ביצוע הכתם המערבי

  1. מרכיבים את מנגנון היציקה ויוצקים ג'ל מפרידים טרי 8% (ראו טבלה 1 למתכון/הכנה) כדי ליצוק את הג'ל המאפשר רווח של כ-2 ס"מ מראש הזכוכית היציקה. הוסף 200 μL של איזופרופנול מוחלט להתקנה ואפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות.
    הערה: המתכון לג'ל פוליאקרילאמיד לאלקטרופורזה של נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) תלוי בגודל החלבון המעניין (טבלה 2). לפיכך, רשום את גודל החלבון לפני קביעת אחוז הג'ל הרצוי.
  2. השתמש פיפטה כדי להסיר את isopropanol בזהירות לשטוף את הג'ל עם כ 200 μL של מים מזוקקים. הוסיפו ג'ל ערימה טרי של 6% (ראו טבלה 1 למתכון/הכנה) כדי למלא את החלל שגודלו כ-2 ס"מ במערך היציקה. מכניסים בעדינות למסרק הבאר ומניחים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. תקן את הג'ל יצוק לתוך מיכל האלקטרופורזה.
  4. יש להמיס 30.3 גרם של בסיס Tris, 144.1 גרם של גליצין ו-10 גרם של SDS ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין חיץ העברה של פי 10. הכן מאגר פועל אחד על-ידי הוספת 10 מ"ל של 10% SDS ו-100 מ"ל של מאגר העברה של פי 10 ל-890 מ"ל של מים מזוקקים.
  5. יוצקים 1x חיץ פועל לתוך המיכל. טען 5 μL של סמן משקל מולקולרי לתוך הבאר הראשונה כמות שווה של חלבון לתוך כל באר של ג'ל SDS-PAGE (בין 18-30 μL, בהתאם לגודל המסרק בשימוש). מלאו בארות ריקות ב-LDS 1x והפעילו את הג'ל במשך כ-90-120 דקות ב-120 וולט.
  6. יש להמיס 58.2 גרם של בסיס Tris ו-29.3 גרם של גליצין ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין חיץ העברה של פי 10. הפעל קרום ניטרוצלולוז עם חיץ העברה 1x המכיל 20% מתנול. שטפו את הג'ל והממברנה עם חיץ ההעברה ופזרו אותם בעדינות על ערימת ההכנה.
    הערה: אין צורך להתאים את ה- pH של מאגרי הריצה וההעברה מכיוון שהם צריכים להיות ב- pH האופטימלי הנדרש. כמו כן, מומלץ להכין את המאגרים הללו ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר לפני הניסוי כדי לחסוך זמן.
  7. סדרו את הכריך להעברה בסדר זה: אלקטרודה שלילית (מסגרת שחורה/קצה) - קצף סנדוויץ' - נייר סינון - ג'ל SDS-PAGE שטוף - קרום ניטרוצלולוז שטוף - נייר סינון - קצף סנדוויץ' - אלקטרודה חיובית (מסגרת אדומה). ערמו את הכריך המורכב במיכל ההעברה והפעילו 90 וולט למשך 90 דקות או 30 וולט למשך 360 דקות.

5. צביעת נוגדנים ופיתוח תמונה

  1. הסר את הממברנה ותן לה להתייבש. יש לחסום את הממברנה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות חיץ חוסם העשוי מחלב דל שומן 5% בתמיסת מלח המכילה 0.1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. לדגום את הממברנות עם דילולים מתאימים של נוגדן ראשוני 8,15,19 ובטא-אקטין (בקרת העמסה) בחסימת חיץ למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטפו את הממברנה בשלוש שטיפות של 1x TBS-T למשך 5 דקות כל אחת.
    הערה: הדגירה של הממברנה הנפרדת עם בקרות העמסה כגון בטא-אקטין, אלפא-טובולין או גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז נוגדנים היא לנרמל את תוצאות הכתם המערבי האחרות במהלך הכימות הבא. הדילול המומלץ לכל נוגדן ראשוני זמין במדריך היצרן.
  3. לדגום את הקרום השטוף עם נוגדן משני מדולל פי 5000 בחיץ חוסם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, לשטוף את הממברנה 3x ב 1x TBS-T במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: מומלץ מאוד להעלות את הנוגדן המשני כנגד המין שבו גדל הנוגדן הראשוני. לדוגמה, אם הנוגדן העיקרי של סך KCC2 הוא עכבר אנטי-KCC2, יש להשתמש בנוגדן המשני לאנטי-עכבר.
  4. מניחים את הממברנה השטופה על לוח ההדמיה. ערבבו נפחים שווים של כל מגיב כימילומינסנציה משופר (ECL) ופזרו בעדינות את התמיסה המעורבת על הממברנה כדי לפתח אותות.

6. רכישת תמונות באמצעות מערכת הדמיה וכימות נתונים

  1. העבר את לוח ההדמיה לתא המתאים במערכת ההדמיה להדמיה. פתח את תוכנת ההדמיה במחשב לעיבוד תמונה.
  2. בסרגל הכלים, לחץ על פרוטוקול חדש ובחר ערוץ יחיד. לחץ על בחר תחת תיבת הדו-שיח הדמיית ג'ל/יישום, גלול אל כתם ובחר כימי היי רגישות או Chemi Hi רזולוציה. לאחר מכן לחץ על הגדרת הצטברות אותות כדי להגדיר את משך הזמן ומספר התמונות לרכישה.
  3. לחץ על מקם ג'ל תחת הגדרת פרוטוקול והתאם את הג'ל במערכת ההדמיה במידת הצורך. לחץ על הפעל פרוטוקול כדי להשיג את התמונות.
  4. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אחת התמונות שנרכשו מתחת לתיבת קטלוג ההדמיה כדי לשמור את התמונות במחשב. נווט אל התמונה הרצויה ולחץ על בחר תמונה והמשך בתיבת הדו-שיח הפעלה.
  5. לחץ על סמל שינוי צורה של תמונה כדי להתאים את הניגודיות ואת רוויית הפיקסלים של התמונה. לחץ על צילום מסך סמל בסרגל הכלים הכללי כדי לשמור את התמונה במחשב בהתאם לפורמט התמונה הרצוי.
  6. מדוד את צפיפות הפסים באמצעות תוכנת ImageJ ונתח באמצעות כלים סטטיסטיים מתאימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, התוצאה המייצגת המוצגת באיור 1 חקרה את ההשפעה של סטאורוספורין ו-NEM על זרחון מתווך WNK-SPAK/OSR1 של KCC2 ו-NKCC1 בקווי תאים HEK293 המבטאים ביציבות את KCC2b (HEKrnKCC2b)18 באמצעות טכניקת הכתם המערבי. פרטים מקיפים על התוצאות המייצגות נדונים ב- Zhang et al.15. בדומה ל-NEM, סטאורוספורין הוא מעכב קינאז רחב שיכול לשפר את פעילות ההובלה של KCC2 ולעכב את פעילות NKCC1ב-15,20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות רבות שימשו למדידת הפעילות של SLC12 של CCCs המתבטאים בתאי העצב, כולל KCC2. רבות מהטכניקות הללו הוכיחו את עצמן כמשפרות את הידע המדעי על ניתוח הרלוונטיות התפקודית של מובילים אלה ודפוסי המבנה-תפקוד שלהם במוטציות שונות הקשורות למחלות. באופן קריטי, ישנם יתרונות ואזהרות לשיטות השונות21. עם זאת, הפרוטוקול שהוסבר לעיל, תיאר כיצד להעריך זרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז, Thr906 ו- Thr1007, באמצעות כתם מערבי, אשר יכול להיות מועיל בחקר הפונקציות והפעילויות של KCC2.

הוויסו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי החברה המלכותית בבריטניה (מענק מס' IEC\NSFC\201094), ומלגת דוקטורט של חבר העמים הבריטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
40% אקרילאמידSigma-AldrichA2917משמש לייצור ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE 
אמוניום לכל סולפטסיגמא-אולדריץ248614 משמש להכנת ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE 
anti pSPAKאוניברסיטת דנדיS670Bמשמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
נגד KCC2אוניברסיטת דנדיS700Cמשמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
נגד KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
נגד KCC2 pThr1007אוניברסיטת דנדיS961Cמשמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
נגד KCC2 pThr906אוניברסיטת דנדיS959Cמשמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
נגד עכברטכנולוגיית איתות תאים66002משמש כנוגדנים משניים לכתמים מערביים
נגד NKCC1אוניברסיטת דנדיS841Bמשמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
נגד NKCC1 pThr203/207/212אוניברסיטת דנדיS763Bמשמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
נגד ארנבטכנולוגיית איתות תאיםC29F4משמש כנוגדנים משניים לכתמים מערביים
נגד כבשיםabcamab6900משמש כנוגדנים משניים לכתמים מערביים
נגד SPAKאוניברסיטת דנדיS669Dמשמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
אנטי-&בטא;-טובולין IIIסיגמא-אולדריץ'T8578משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
בנזאמיןמרק בריטניה135828משמש כמרכיב של מאגר ליזה
בטא-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M3148משמש כמרכיב של מאגר העמסה ומאגר ליזה
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209משמש לכימות חלבון ליזאט
מכשירי יציקהAtto WSE-1165Wמשמש להפעלת צנטריפוגה אלקטרופורזה של עמוד SDS
Eppendorf5804משמש להכנת ליזאט
צנטריפוגהVWRMicroStar 17Rמשמש לדגימות מסתובבות
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D2650-100MLמשמש לניסוי תרבית תאים
חלב דל שומן מיובשMarvel N/ Aמשמש לייצור חסימה מאגר
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוהSigma-AldrichD6429משמש לתרבית
תאים מגיב ECLפרקין אלמרORTT755/2655משמש לפיתוח תמונה לכתמים מערביים
EDTAFisher ScientificD/0700/53משמש כמרכיב של מאגר ליזה
EGTASigma-Aldriche4378משמש כמרכיב של ליזה
מאגר אלקטרופורזה ספק כוחBioRadPowerPAC HCלאספקת חשמל להפעלת אלקטרופורזה SDS-page
אתנולThermoFisherE/0650DF/17משמש להכנת ציוד מעוקר וסביבה
סרום בקר עוברי -  מושבת בחוםMerck Life Sciences UKF9665משמש לתרבית תאים
FumehoodWalkerA7277משמש לתרבית תאים
ג'ל בולטינג - WhatmanGE Healthcare 10426981משמש בכתמים מערביים להכנת כריך העברה
GlycineSigma-Aldrich15527משמש לייצור מאגרים
תוכנת GraphPad PrismGraphPad Software, Inc., ארה"בגרסה 6.0משמש להתוויית גרפים וניתוח נתונים עבור   Western Blotting
HClAcros Organics10647282משמש לייצור ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE 
בלוק חימוםQBT1משמש לחימום דגימות טעינת WB
תאי HEK293 MerckUK12022001-1VLקו תאים לניסוי תרבית
תוכנת ImageJוויין רסבנד ותורמים; NIH, ארה"ב ImageJ 1.53eמשמש למדידת עוצמות הלהקה מתמונות כתמים מערביות
מערכת הדמיהBioRadChemiDoc MPמשמש לצילום תמונות כתמים מערביים
חממהLEECLEEC דיוק 190Dמשמש לתרבית תאים
איזופרופנולHoneywell24137משמש ליציקת ג'ל לאלקטרופורזה
תמיסת L-גלוטמיןSigma-AldrichG7513משמש לתרבית תאים
ליתיום דודציל סולפט (LDS)NovexNP0008משמש כמאגר טעינה למערב ספיגה
MEM חומצת אמינו לא חיונית Merck Life Sciences UKM7145משמש לתרבית תאים
מיקרוצנטריפוגהEppendorf5418משמש להכנת ליזטים לקורא
מיקרו-פלטותBioRadiMarkמשמש לקריאת ריכוז חלבון ליזאט
Microsoft Powerpointמיקרוסופט, ארה"בPowerPoint2016משמש לעריכת תמונות כתמים מערביים
סמןמשקל מולקולריBioRad1610373משמש לספיגה מערבית
N-ethylmaleimideThermo Fisher Scientific23030משמש לניסוי תרבית תאים
קרום ניטרוצלולוזהFisher Scientific45004091משמש לספיגה מערבית
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140122משמש לתרבית תאים
מד pHמטלר טולדושבע קומפקטי s210משמש לניטור pH של תמיסות חיץ
פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)סיגמא-אולדריץ'P7626משמש כמרכיב של מאגר
ליזה מאגר פוספט מי מלחSigma-AldrichD8537משמש לתרבית תאים
PKCδ pThr505טכנולוגיית איתות תאים9374משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
חלבון Sepharose GGeneronPG50-00-0002משמש למשקעים חיסוניים
נתרן כלוריSigma-AldrichS7653משמש כמרכיב של מאגר כביסה
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S7653משמש להכנת מאגר TBS-T
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'L5750משמש להכנת ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE 
נתרן אורתובנאדאטSigma-AldrichS6508משמש כמרכיב של מאגר ליזה
נתרן פירובטSigma-AldrichS8636משמש לתרבית תאים
נתרן-ובטא;-גליצרופוספטMerck UKG9422משמש כמרכיב של מאגר ליזה
Staurosporine (מ-Streptomyces sp.)ציוד מעבדה מדעי, בריטניהS4400-1MGמשמש לניסוי תרבית תאים
SucroseScientifc Laboratory SuppliesS0389משמש כמרכיב של מאגר ליזה
TEMEDSigma-AldrichT7024משמש לייצור ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE 
תא העברהBioRad1658005EDUמשמש בכתמים מערביים להעברת חלבון על הממברנה
TrisSigma-AldrichT6066משמש לייצור ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787משמש כמרכיב של מאגר ליזה
Trypsin-EDTA SolutionMerck Life Sciences UKT4049משמש לתרבית תאים
Tween-20Sigma-AldrichP3179משמש כמאגר TBS-T
משאבת ואקוםצ'ארלס אוסטןDymax 5משמש לתרבית תאים
מערבולתתעשיות מדעיותK-550-GEמשמש בהכנת דגימה
מערבל מערבולתתעשיות מדעיות בע"מVortex-Genie  K-550-GEמשמש לערבוב דגימה שנפתרה
מיםGrant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5משמש לדגירה של פתרונות
' מענק WB אמבט

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776(2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142(2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65(2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78(2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967(2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3(2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986(2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820(2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429(2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992(2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255(2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032(2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10(2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

KCC2 FunctionNeuronal KCC2KCC2 PhosphorylationChloride HomeostasisGABAergic InhibitionProtein QuantificationHEK293 CellsKinase Regulatory SitesProtein Kinase C

מאמרים קשורים