הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת RNA ארוך ציטופלזמי וגרעיני מתאים ראשוניים ותאי תרבית

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64199

⸱

7 באפריל 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מציע שיטה יעילה וגמישה לבודד RNA משברים גרעיניים וציטופלזמיים באמצעות תאים בתרבית, ולאחר מכן לאמת באמצעות qPCR. זה משמש למעשה כתחליף לערכות הכנת RNA אחרות.

תקציר

ההפרדה של רכיבים תוך-תאיים היא כלי מרכזי בביולוגיה התאית כבר שנים רבות, והיא מסוגלת לספק תובנה שימושית לגבי האופן שבו מיקומם יכול להשפיע על תפקודם. בפרט, ההפרדה בין RNA גרעיני וציטופלזמי הפכה חשובה בהקשר של תאים סרטניים והחיפוש אחר מטרות חדשות לתרופות. רכישת ערכות למיצוי RNA גרעיני-ציטופלזמי יכולה להיות יקרה כאשר רבים מהחומרים הדרושים נמצאים בסביבת מעבדה טיפוסית. בשיטה הנוכחית, שיכולה להחליף ערכות יקרות יותר או תהליכים אחרים שגוזלים זמן, נדרשים רק חיץ ליזיס תוצרת בית, צנטריפוגה וספסל ועמודות טיהור בידוד RNA כדי לבודד RNA גרעיני וציטופלזמי. חיץ ליזיס משמש לליזה עדינה של הקרום החיצוני של התא מבלי להשפיע על שלמות מעטפת הגרעין, ומאפשר שחרור מרכיביו התוך-תאיים. לאחר מכן, ניתן לבודד את הגרעינים על ידי צעד צנטריפוגה פשוט מכיוון שהם בעלי צפיפות גבוהה יותר מתמיסת הליזיס. צנטריפוגה משמשת להפרדת אזורים אלה בהתבסס על הבדלי הצפיפות שלהם כדי לבודד יסודות תת-תאיים בגרעין מאלה שבציטופלסמה. לאחר שהצנטריפוגה בודדה את הרכיבים השונים, נעשה שימוש בערכת ניקוי RNA לטיהור תכולת הרנ"א, ומתבצע qPCR כדי לאמת את איכות ההפרדה, המכומתת על ידי כמות הרנ"א הגרעיני והציטופלזמי בשברים השונים. הושגו רמות מובהקות סטטיסטית של הפרדה, הממחישות את יעילות הפרוטוקול. בנוסף, ניתן להתאים מערכת זו לבידוד סוגים שונים של RNA (סה"כ, רנ"א קטן וכו'), מה שמאפשר מחקר ממוקד של אינטראקציות ציטופלסמה-גרעין, ומסייע בהבנת ההבדלים בתפקוד הרנ"א השוכנים בגרעין ובציטופלסמה.

מבוא

שבירה תאית לרכיבים תת-תאיים מאפשרת בידוד ולימוד של תחומים ביוכימיים מוגדרים ומסייעת בקביעת לוקליזציה של תהליכים תאיים ספציפיים וכיצד זה עשוי להשפיע על תפקודם1. בידוד הרנ"א ממקומות תוך-תאיים שונים יכול לאפשר דיוק משופר של ניתוח גנטי וביוכימי של אירועים ברמת השעתוק ואינטראקציות אחרות בין הגרעין לציטופלסמה, המשמש כמטרה העיקרית של פרוטוקול2 הנוכחי. פרוטוקול זה פותח כדי להבטיח בידוד של רנ"א ציטופלזמי וגרעיני, לקבוע את תפקידם בהתאמה בייצוא גרעיני, ולהבין כיצד לוקליזציה תת-תאית של רנ"א בגרעין ובציטופלסמה עשויה להשפיע על תפקודם בתהליכים תאיים. באמצעות שימוש בחומרים מסביבת מעבדה טיפוסית, ניתן היה להשיג שבר גרעיני וציטופלזמי בצורה יעילה יותר וזולה יותר מאשר פרוטוקולים שנקבעו בעבר מבלי לסכן את איכות התוצאות3.

בנוסף, חילופי מולקולות בין הציטופלסמה לגרעין יכולים להיחקר ישירות על ידי הפרדת אזורים אלה. באופן ספציפי יותר, הבנת התמליל חיונית להבנת התפתחות ומחלות. עם זאת, רנ"א עשוי להיות ברמות הבשלה שונות בכל זמן נתון ויכול לסבך את הניתוח במורד הזרם. פרוטוקול זה מאפשר את היכולת לבודד RNA משברים תת-תאיים גרעיניים וציטופלזמיים, מה שיכול לסייע במחקרים של RNA ולאפשר הבנה טובה יותר של RNA מסוים מעניין, כגון לוקליזציה של RNA לא מקודד או ניתוח של צמתים splice בתוך הגרעין.

פרוטוקול זה הותאם לבידוד רנ"א ארוך ציטופלזמי וגרעיני, כולל mRNAs, rRNA ורנ"א ארוך שאינו מקודד (lncRNAs), בשל סלקטיביות הגודל של עמודת טיהור הרנ"א המנוצלת, הניתנת לשינוי כדי לבודד רנ"א אחרים בעלי עניין. בעבר, תפקודם של רנ"א ארוך, כגון mRNA ו-lncRNAs, היה תלוי מאוד בלוקליזציה שלהם בתוך התא 4,5. לכן, חקר הייצוא מהגרעין לתחומים תת-תאיים נעשה ממוקד יותר לקראת הבנת התפקיד שיכול להיות לייצוא רנ"א או רכיבים תאיים אחרים על התא. lncRNA משמשים דוגמה מצוינת לכך, שכן תרגומם והשפעותיהם לאחר מכן מסתמכים במידה רבה על קרבה ואינטראקציות עם צורות אחרות של RNA6. יתר על כן, חילופי יסודות תאיים בין אזורים גרעיניים וציטופלזמיים קשורים למנגנוני עמידות לטיפולים שונים בסרטן7. בידודם של תאים תוך-תאיים איפשר פיתוח מעכבי יצוא גרעיני, אשר הפחית את ההשפעות של מנגנוני התנגדות לטיפולים שונים8.

לאחר הפרדת RNA גרעיני וציטופלזמי, מבוצעים צעדים לטיהור הרנ"א מעניין. מכיוון שערכות טיהור RNA נמצאות בדרך כלל במעבדות ותפקידן לטהר ולבודד רנ"א ארוך, הן משרתות היטב את מטרת פרוטוקול זה. עבור טיהור RNA, יצירת יחסים של 260:280 גדולים מ-1.8 היא קריטית כדי להבטיח את איכות הדגימות לריצוף RNA או הליכים דומים אחרים הדורשים רמות גבוהות של טוהר ובידוד. ערכים לא סדירים של 260:280 מצביעים על זיהום פנול, מה שמדגים בידוד לקוי ומניב תוצאות לא מדויקות9.

לאחר השלמת טיהור הרנ"א ואושר כי ערכי 260:280 גבוהים מטווח מקובל, נעשה שימוש ב-qPCR כדי לאמת את תוצאות הבידוד של שברים גרעיניים וציטופלזמיים. בעשותם כן, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים לאזור העניין כדי להדגים את רמות השבר הגרעיני והציטופלזמי. בפרוטוקול זה, MALAT1 ו- TUG1 שימשו כסמנים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה10. יחד, הם מאפשרים הדגמה של רמות גבוהות של שבר גרעיני עם MALAT1, בעוד שבר ציטופלזמי צפוי להיות נמוך. לעומת זאת, כאשר משתמשים ב-TUG1, רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני.

באמצעות פרוטוקול זה ניתן היה לבודד רנ"א על סמך מיקום פעולתם בתוך התא. בשל גישה נרחבת לחומרים רבים ושימוש רק בחיץ ליזה ובטכניקות צנטריפוגות מבוססות צפיפות במהלך ניסוי זה, היישום על סוגי RNA אחרים ורכיבים תאיים אחרים הוא נרחב. זה יכול לספק מידע חשוב על ידי שפיכת אור על אירועי ביטוי ספציפיים למיקום שאחרת לא ניתן היה להבחין בהם ללא הפרדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תאי K562 משמשים במחקר הנוכחי. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לעבודה עבור 1 x 10 6-5 x 106 מיליון תאים. עם זאת, ניתן להגדיל את ההליך עבור כמויות תאים גדולות יותר על ידי הגדלת הנפחים כראוי.

1. הכנת חיץ ליזיס 0.25x

  1. הכן מאגר ליזיס 0.25x על-ידי ערבוב הרכיבים הבאים המופיעים בטבלה 1A.
    הערה: הדגימות דורשות כ- 300 μL של מאגר ליזיס 0.25x. נפח מומלץ = מספר הדגימות x 300 μL.

2. הפרדת שברים גרעיניים וציטופלזמיים

  1. גלולה את התאים באמצעות צינורות 1.5 מ"ל באמצעות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2000 x גרם (טמפרטורת החדר). השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה שואפת.
    הערה: תאי K562 נוצלו במהלך פרוטוקול זה. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לקווי תאים שונים.
  2. השהה מחדש את הגלולה ב 300 μL של חיץ ליזיס קר כקרח 0.25x.
    הערה: יש לשמור על קרח למשך 2 דקות ולסובב את הצינור כל 45 שניות כדי להבטיח ליזה תקינה של התאים.
  3. סובב את הצינורות במהירות הגבוהה ביותר (12,000 x גרם) ב- 4 ° C למשך 2 דקות.
  4. לאחר הצנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant ומניחים אותו בתוך צינור חדש 1.5 מ"ל. זה יהיה החלק הציטופלזמי. כ 300 μL של החלק הציטופלזמי יושג.
  5. הגלולה הנותרת תהיה החלק הגרעיני. הוסף 500 μL של PBS קר כקרח לגלולה ולצנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: במהלך שלב זה, דנ"א עודף מוסר.

3. ניקוי RNA באמצעות ערכת טיהור RNA

הערה: פרוטוקול זה הושג באמצעות ערכת טיהור RNA זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).

  1. הפרידו בין דגימות הרנ"א הציטופלזמי לבין הדגימות הציטופלזמיות הגרעיניות (מכיוון ששלבי השבר משתנים ביניהן).
    1. כדי להפריד את החלק הציטופלזמי, הוסף 1,050 μL של חיץ ליזה RLT 3.5x (ראה טבלת חומרים) ומערבולת לזמן קצר. לאחר מכן, הוסף 750 μL של 90% אתנול וטען אותו על העמוד מתוך ערכת ניקוי RNA.
      הערה: הפתרון חייב להיות מעורבב היטב לפני הטעינה על העמודה.
    2. כדי להפריד את החלק הגרעיני, הוסף 600 μL של חיץ ליזה 3.5x ומערבולת. לאחר מכן, להוסיף 600 μL של 70% אתנול.
  2. טען שברים ציטופלזמיים וגרעיניים על עמודות RNA (ראה טבלת חומרים).
    הערה: במשך שארית שלב 3, הן הדגימה הציטופלזמית והן הדגימה הגרעינית עוקבות אחר אותו הליך. עם זאת, ודא כי דגימות אלה נשארות בלתי תלויות זו בזו.
    1. טען הן שברים ציטופלזמיים והן גרעיניים על עמודות RNA והסתובב במשך 30 שניות ב 8,000 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את עודפי הזרימה דרכה.
    2. הוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה מערכת טיהור מסחרית (מאגר RW1, ראו טבלת חומרים), סובבו שוב והשליכו את הזרימה.
    3. הוסף תמיסת DNAse (1U/uL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה, סובבו שוב והשליכו את הזרימה.
    4. הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה עדין (RPE, ראו טבלת חומרים), סחררו שוב והשליכו את הזרימה. מוסיפים 500 μL של חיץ כביסה עדין, מסתובבים שוב, אבל רק למשך 2 דקות.
    5. העבר את העמוד לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל והוסף 30 מיקרוליטר מים לעמוד הסחרור. הניחו לטור לשבת דקה אחת לפני הסיבוב כלפי מטה.

4. אימות ההפרדה הגרעינית-ציטופלזמית

  1. ביצוע סינתזת cDNA
    1. לאחר מיצוי וטיהור תאים תת-תאיים של RNA, אשרו את הפרדת התאים באמצעות qPCR. לשם כך, ראשית, המירו את הרנ"א ל-cDNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
    2. הכן מאסטרמיקס תמלול הפוך. הוסף RNA של תבנית. לדגור תגובות thermocycler.
      הערה: עבור הקסמרים אקראיים, פרמטרי הרכיבה המשמשים מופיעים בטבלה 2A. השתמש מיד בתגובת התעתיק ההפוך או אחסן בטמפרטורה של -20°C (טבלה 1B).
  2. בצע את תגובת השרשרת הכמותית של פולימראז (qPCR) וניתוח.
    1. לדלל את סינתזת cDNA עם מי DEPC (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבל ריכוז סופי של 20 ng/mL.
    2. באמצעות תערובת מאסטר PCR, הכן את התגובה עבור כל דגימה באמצעות הוראות ידניות כמפורט להלן.
    3. לרכוש בדיקות מסחריות הדרושות כדי לזהות שבר ציטופלזמי וגרעיני. השתמש ב- MALAT1 כסמן גרעיני וב- TUG1 כסמן ציטופלזמי (ראה טבלת חומרים).
      הערה: רצפים עבור MALAT1 ו- TUG1 מוצגים בטבלה 3.
    4. חשב את הנפח של כל רכיב על-ידי הכפלת כל רכיב ב- 3 עבור כל אחד מהעותקים הטכניים המשוכפלים עבור המדגם הבודד.
    5. עבור כל דגימה גרעינית וציטופלזמית, רכוש את התערובות הבאות עבור כל אחת מהן: (א) שבר גרעיני עם MALAT1, (ב) מקטע ציטופלזמי עם MALAT1, (ג) שבר גרעיני עם TUG1, ו-(ד) שבר ציטופלזמי עם TUG1 (טבלה 1C).
    6. מערבלים לזמן קצר כדי לערבב תמיסות ולהעביר 20 μL מהתערובת לכל באר של צלחת תגובה אופטית (ראה טבלת חומרים).
    7. כסו את הצלחת בסרט דבק שקוף המשמש ל-qPCR (ראו טבלת חומרים) וצנטריפוגו את הצלחת לזמן קצר כדי למנוע בועות אוויר, ולאחר מכן סובבו את הדגימה כלפי מטה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. באמצעות תוכנת תכנון וניתוח (ראה טבלת חומרים), בחר את העקומה הסטנדרטית עבור פרמטרי המחזור (טבלה 2B).
    9. באמצעות תוכנת qPCR, בחר הגדר הפעלה (איור משלים 1).
    10. בדף מאפייני קובץ נתונים, בחר פרמטרים של שיטה ומחזור קלט מטבלה 2B (איור משלים 2).
    11. לאחר הזנת פרמטרים של מחזור, בחר בכרטיסיה צלחת והזן את הדגימות שיש להפעיל (איור משלים 3). בחר התחל הפעלה.
      הערה: השלבים המתוארים בוצעו במכשיר qPCR באמצעות תערובת אב זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
  3. ביצוע ניתוח נתונים
    1. לאחר השלמת ההפעלה, צור גיליון אלקטרוני של נתונים עם שם המדגם, שם היעד ומחזור הכימות (Cq) (טבלה משלימה 1).
    2. התחל עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את החלק הגרעיני. החסר את המקטע הציטופלזמי MALAT1 מהמקטע הגרעיני MALAT1 (טבלה 4).
    3. לאחר מכן, חשב את ΔCq (2^(-value)) (טבלה 5).
    4. המשך עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את המקטע הציטופלזמי, החסר את החלק הגרעיני MALAT1 מהמקטע הציטופלזמי MALAT1, ולאחר מכן חשב את ΔCq (2^(-value)) (טבלה 6).
      הערה: כאשר מסתכלים על ΔCq, נצפה כי לשבר MALAT1 הגרעיני (הדגשה ירוקה) יש סמן MALAT1 גדול יותר מאשר לציטופלסמה (הדגשה אדומה), אך כעת נדרש אישור כדי להבטיח שהמקטע הציטופלזמי הוא בעיקר ציטופלסמה וכי החלק הגרעיני אינו מכיל זיהום ציטופלזמי.
    5. עם דגימות TUG1, בצע את אותו חישוב כמו לעיל (שלבים 4.3.2-4.3.4) (טבלה 7).
      הערה: כשמסתכלים על ΔCq, רואים שלשבר TUG1 הציטופלזמי (הדגשה ירוקה) יש סמן TUG1 גדול יותר מהשבר הגרעיני (הדגשה אדומה), ובכך מאשר הפרדה טובה בין שברים ציטופלזמיים וגרעיניים (טבלה 8, איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להבטיח בידוד גרעיני וציטופלזמי, בוצע qPCR כדי לאמת את התוצאות. בעשותם כן, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים לאזור העניין כדי להדגים את רמות השבר הגרעיני והציטופלזמי. במחקר זה, MALAT1 ו- TUG1 שימשו כפריימרים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה. יחד, הם מאפשרים הדגמה של רמות גבוהות של שבר גרעיני עם MALAT1 כבקרה חיובית עבור יסודות גרעיניים, בעוד ששבר ציטופלזמי צפוי להיות נמוך. לעומת זאת, כאשר TUG1 קיים כבקרה חיובית עבור יסודות ציטופלזמיים, אז רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני. ניתן לראות זאת

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לאורך הפרוטוקול, ננקטו כמה צעדים כדי לייעל את האלמנטים כדי להיות היעילים ביותר עבור קו התא של עניין. בעוד השלבים בתוך הפרוטוקול הם פשוטים יחסית, ניתוח והתאמות קלות במהלך היבטים קריטיים של הפרוטוקול עשויים להיות נחוצים. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא שינוי ריכוז חיץ הליזיס לריכוז תקין בהתבסס על קו העניין של התא והמטרה התאית. מאחר שניצול חיץ הליזה תלוי במידה רבה בהפרעה של קרומי התא, קיימת שונות טבעית ביעילות של חיץ ליזה על קווי תאים שונים, שכן ישנם הבדלים קלים בשבריריות התא ובחדירות הממברנה בין קווי תאים שונים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

נתמך על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, קרן רוברט ווד ג'ונסון, קרן הצדקה דוריס דיוק, קרן אדוארד פ. אוונס והמכון הלאומי לסרטן (1K08CA230319).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Agilent TapestationAgilentG2991BAמערכת Agilent TapeStation היא פתרון אלקטרופורזה אוטומטי לבקרת איכות הדגימה של דגימות DNA ו-RNA.
0.5% Nonidet P-40Thermo-Fischer28324משמש לייצור מאגר ליזה
50 מ"מ Tris-Cl pH 8.0תרמו-פישר15568025משמש בייצור מאגר ליזה
MALAT1 GE AssayThermo-FischerHs00273907_s1משמש לאישור שבר גרעיני.
צלחת תגובה אופטית 96 בארות של MicroAmp עם ברקודתרמו-פישר4326659צלחת התגובה האופטית של Applied Biosystems MicroAmp 96 בארות עם ברקוד מותאמת כדי לספק דיוק טמפרטורה ואחידות ללא תחרות להגברת PCR מהירה ויעילה. צלחת זו, הבנויה מחתיכה קשיחה אחת של פוליפרופילן בפורמט של 96 בארות, תואמת למערכות PCR בזמן אמת של 96 בארות ומחזורים תרמיים של Applied Biosystems.
סרט דבק אופטי MicroAmpתרמו-פישר4311971סרט הדבק האופטי MicroAmp של Applied Biosystems מפחית את הסיכוי לזיהום באר לבאר ואידוי דגימה כאשר הוא מוחל על מיקרו-פלטה במהלך qPCR
PBSGibco20012-023תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) היא תמיסת מלח מאוזנת המשמשת למגוון יישומי תרבית תאים, כגון שטיפת תאים לפני דיסוציאציה, הובלת תאים או דגימות רקמה, דילול תאים לספירה והכנת ריאגנטים.
ערכת ניקוי RNA Qiagen-Rneasy Mini KitQiagen74106מאפשרות ניקוי RNA יעיל של תגובות אנזימטיות וניקוי RNA מטוהר בשיטות שונות. כולל מאגרי RW1, RLT, RW1 המוזכרים לאורך כל הפרוטוקול.
QuantStudio 6Thermo-FischerA43180qPCR המשמשת במהלך הפרוטוקול. כולל תוכנת תכנון וניתוח לניתוח דגימות פיצול
מאגר RLTQiagen79216מאגר ליזה מערכת ניקוי RNA
מאגר RPE מאגרכביסה Qiagen1018013ניקוי
RNA מאגר RW1 מאגרQiagen1053394מאגר כביסה ערכת ניקוי RNA
מבחני ביטוי גנים של TaqmanThermo-Fischer4331182מבחני ביטוי גנים של Applied Biosystems TaqMan מייצגים את האוסף הגדול ביותר של בדיקות מתוכננות מראש בתעשייה עם למעלה מ-2.8 מיליון בדיקות על פני 32 מינים אוקריוטיים וחיידקים רבים. מבחני ביטוי גנים של TaqMan מאפשרים לך לקבל תוצאות במהירות ללא בזבוז זמן באופטימיזציה של פריימרים ירוקים של SYBR וללא זמן נוסף המושקע בריצה וניתוח עקומות התכה.
TaqMan Universal PCR Master MixThermo-Fischer4305719TaqMan Universal PCR Master Mix הוא פתרון הריאגנט האידיאלי כאשר אתה זקוק לתערובת מאסטר עבור יישומי DNA נוקלאז מרובים בגודל 5 אינץ'. ריאגנטים של אפלייד ביוסיסטמס אומתו עם מבחני TaqMan ומערכות בזמן אמת של אפלייד ביוסיסטמס כדי להבטיח ביצועים רגישים, מדויקים ואמינים בכל פעם.
TUG1 GE AssayThermo-FischerHs00215501_m1משמש לאישור שבר ציטופלזמי.
מים שטופלו במים UltraPure DEPC750024מים שטופלו ב-UltraPure DEPC מתאימים לשימוש עם RNA. הוא מוכן על ידי דגירה עם 0.1% דיאתילפירוקרבונט (DEPC), ולאחר מכן עובר חיטוי כדי להסיר את ה-DEPC. סטרילי מסונן.
ערכות ניקוי RNA תוכנת ערכת

מקורות

  1. Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
  2. Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. RNA localization in development. Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).
  3. Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
  4. Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
  5. Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
  6. Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012(2015).
  7. El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35(2016).
  8. Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
  9. Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
  10. Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
  11. Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
  12. Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. Bacterial Cell Wall. , Elsevier. (1994).
  13. Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
  15. Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).
  16. Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).
  17. Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, Supplement 1 233(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד RNA גרעיניבידוד RNA ציטופלזמיבופר ליזיסRNA מתאי מקורהפרדת תאייםהפרדת RNA סוב-צלולריתPCR כמותיתיקוף qPCRוסטרן בלוטאלקטרופורזה של RNA
הכנת RNA ארוך ציטופלזמי וגרעיני מתאים ראשוניים ותאי תרבית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.