Method Article

שיטה חזותית רגישה לאיתור חיידקים מייצרי מימן גופרתי

DOI:

10.3791/64201

⸱

June 27th, 2022

 , 
1Department of Microbiology, School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, 2National Experimental Teaching Demonstration Center of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי חיידקים מייצרי מימן גופרתי עם פרוטוקול שונה המשמש למשקעים ביסמוט סולפיד (BS). היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ואינו דורש ציוד מיוחד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימן גופרתי (H2S) הוא גז רעיל המיוצר על ידי חיידקים בפרוטאוליזה של חומצות אמינו וחלבונים המכילים גופרית הממלא תפקיד חשוב בבריאות האדם. בדיקת הייצור H2S היא אחת מבדיקות הזיהוי הביוכימיות החשובות של חיידקים. השיטות המסורתיות הן לא רק מייגעות וגוזלות זמן, אלא גם נוטות לעכב את צמיחת החיידקים בשל ההשפעה הרעילה של מלחי מתכות כבדות בתווך המכיל גופרית, מה שמוביל לעתים קרובות לתוצאות שליליות. כאן הקמנו שיטה פשוטה ורגישה לזיהוי H2S בחיידקים. שיטה זו היא גרסה שונה של משקעי ביסמוט סולפיד (BS) המשתמשת בלוחות מיקרוטיטר שקופים של 96 בארות. תרבית חיידקים שולבה עם תמיסת ביסמוט המכילה L-ציסטאין וטופחה במשך 20 דקות, שבסופה נצפה משקע שחור. מגבלת הזיהוי החזותי עבור H 2 S הייתה0.2מילימול. בהתבסס על שינוי הצבע החזותי, ניתן להשיג זיהוי פשוט, בעל תפוקה גבוהה ומהיר של חיידקים מייצרי H2S. לסיכום, שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי ייצור H2S בחיידקים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים המייצרים מימן גופרתי יכולים לנצל חומצות אמינו וחלבונים המכילים גופרית כדי לייצר מימן גופרתי (H2S). הייצור של H2S מתרחש בדרך כלל בחיידקים ממשפחת Enterobacteriaceae גראם-שליליים וגם בחברים Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. ו-Shewanella spp.1. חיידקים אלה יש את היכולת להפחית סולפט לתוך מימן גופרתי (H2S) על מנת לקבל אנרגיה. מימן גופרתי היה מעורב בפיתוח עמידות חיידקית לתרופות. H2S מגן על חיידקים מפני הרעילות של מיני חמצן תגובתי (ROS), ובכך נוגד את ההשפעה האנטיבקטריאלית של אנטיביוטיקה 2,3. H2S יש גם השפעה פיזיולוגית חשובה בשמירה על הומאוסטזיס. ברמות העל-פיזיולוגיות, H2S הוכח כרעיל מאוד לגוף. בגוף האדם, H2S יש תפקיד נוסף כמולקולת איתות גז המעורבת במגוון תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. H2S יכול לווסת את התפקוד הסיסטולי של הלב וממלא תפקיד פיזיולוגי חשוב בהרפיית כלי הדם, עיכוב עיצוב מחדש של כלי הדם והגנה על שריר הלב 4,5. H2S גם משחק תפקיד חשוב בוויסות מערכת העצבים ומערכת העיכול 6,7. נמצא כי כאשר הם נחשפים לאנטיביוטיקה קוטלת חיידקים, חיידקים מייצרים מיני חמצן תגובתי קטלניים (ROS) המובילים למוות תאי 8,9,10,11.

כבדיקה ביוכימית נפוצה בקורסי מעבדה מיקרוביולוגיים, בדיקת מימן גופרתי היא ניסוי חשוב בזיהוי חיידקים, במיוחד חיידקים ממשפחת Enterobacteriaceae. כיום, בדיקת מימן גופרתי מבוצעת בדרך כלל על מספר רב של חומצות אמינו המכילות גופרית ומדיום אצטט עופרת המחוסנים בחיידקים לבדיקה. לאחר תקופה של דגירה (2-3 ימים), התוצאות נשפטות על ידי התבוננות אם מדיום התרבית או רצועת נייר אצטט עופרת מושחרים בגלל ייצור אצטט עופרת11. עם זאת, שיטות מסורתיות אלה הן לא רק מייגעות וגוזלות זמן, אלא גם נוטות לעכב את צמיחת החיידקים בשל ההשפעה הרעילה של מלחי מתכות כבדות בתווך המכיל גופרית, מה שמוביל לעתים קרובות לתוצאות שליליות. נקבעה שיטה מבוססת ביסמוט לזיהוי H2S12,13. H2S יכול להגיב עם ביסמוט, וליצור משקעים גופרתיים ביסמוט שחור. על מנת לבצע רפורמה בבדיקה ביוכימית זו, יש לקבוע שיטה פשוטה ומהירה ללא תופעות לוואי על צמיחת חיידקים. כאן, הקמנו שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים מייצרי מימן גופרתי הגדלים בסביבה חוץ גופית באמצעות ביסמוט סולפיד כמצע בפורמט צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זני חיידקים

הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בתשעה זנים סטנדרטיים, כולל סלמונלה פאראטיפי A, סלמונלה פאראטיפי B, פוסובקטריום נוקלאטום, אנטרוקוקוס פאקליס, סטפילוקוקוס זהוב, Pseudomonas aeruginosa PAO1, אירומונס הידרופילה YJ-1, Proteus vuigaris ודלקת ריאות קלבסיאלה (טבלה 1). סלמונלה פאראטיפי A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, ו Proteus vuigaris יכול לייצר H2S, כפי שתואר בספרות קודמת1.

  1. הכנת תרבית חיידקים
    1. העבר מושבת חיידקים אחת של סלמונלה paratyphi A, סלמונלה paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, ודלקת ריאות Klebsiella מצלחת אגר Luria-Bertani (LB) ל 100 מ"ל של LB בינוני ותרבית ב 37 ° C במשך 12-16 שעות עד ריכוז החיידקים הוא בערך 1 x 109 תאים / מ"ל (כפי שמצוין על ידי OD600 = 1).
    2. העבר מושבת חיידקים אחת של Fusobacterium nucleatum ו- Proteus vuigaris מצלחות אגר של מרק סויה טריפטיקז (TSB) ל -100 מ"ל של TSB בינוני ותרבית ב 37 ° C אנאירובית במשך 24 שעות עד ריכוז החיידקים הוא בערך 1 x 109 תאים / מ"ל (כפי שמצוין על ידי OD600 = 1).

2. בדיקת זיהוי H2S

  1. בדיקת ייצור מימן גופרתי
    1. יש לערבב 100 μL של תרבית חיידקים עם 100 μL של תמיסת ביסמוט שהוכנה לאחרונה (pH 8.0; 10 mM ביסמוט (III) כלוריד, 0.4 M triethanolamine-HCl, 20 mM פירידוקסל 5-פוספט מונוהידרט, 20 mM EDTA ו-40 mM L-ציסטאין) בצלחות מיקרוטיטר 96 בארות ובתרבית במשך 20 דקות ב-37°C. עבור כל זן חיידקי, לבצע את הניתוח משולש.
    2. לאחר 20 דקות, בדוק אם יש שינוי צבע. אם צבע התמיסה משתנה מצהוב בהיר לשחור, הדבר מצביע על כך שהחיידקים מסוגלים לייצר H2S. חזור על מדידה זו 3x.
  2. רגישות השיטה
    1. לקבוע את הרגישות של השיטה באמצעות ריכוזים שונים של hydrosulfide נתרן (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM, ו 0 mM, מעורבב עם BS פתרון 14.
    2. קבע את נוכחותו של HS−/S2− על ידי התבוננות בהיווצרות של משקע BS שחור. הניקוד את צבע הבארות באמצעות סולם חזותי מהפקת צבע ללא ייצור צבע (-) להפקת צבע שחור כהה ביותר (++++++).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתור חיידקים מימנים גופרתיים
הביצועים של בדיקת H2S נחקרו באמצעות תרביות טהורות של זני חיידקים נבחרים, כמפורט בטבלה 1. התוצאות הצביעו על כך שסלמונלה פאראטיפי B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, ו- Proteus vuigaris יכולים לייצר H2S עם משקע BS שחור, בעוד Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, ו - Klebsiella pneumoniae לא הראו ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת ייצור מימן גופרתי היא אחת הבדיקות הפנוטיפיות המקובלות לזיהוי והתמיינות של זני חיידקים. מיני חיידקים רבים יכולים לייצר מימן גופרתי בסביבתם הטבעית, כגון מים ימיים. מיני חיידקים אלה כוללים סלמונלה sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., כמה זנים של Klebsiella sp., Escherichia coli, וכמה מינים של Clostridiaאנאירובית 15,16. עם זאת, הרגישות של שיטת הבדיקה המסורתית H2S נמוכה, והשיטה גוזלת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי פיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD) ופרויקט המחקר של רפורמת ההוראה של אוניברסיטת התרופות של סין (2019XJYB18).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ביסמוט (III) כלורידשנחאי מקלין ביוכימיה ושות', בע"מ7787-60-2
EDTAנאנג'ינג ריאגנט כימי ושות', בע"מ60-00-4
Enterococcus faecalis  ATCC 19433
Fusobacterium  נוקלאטום  ATCC 25586
Klebsiella pneumoniae  ATCC 43816
L-ציסטאיןאמרסקו52-90-4
Proteus  vuigaris  CMCC 49027
Salmonella paratyphi ACMCC50001
Salmonella paratyphi BCMCC50094
Staphylococcus  אוראוס ATCC 25923
Triethanolamine-HClשנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ637-39-8

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
  2. Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
  3. Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
  4. Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167(2015).
  5. Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
  6. Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
  7. Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908(2015).
  8. Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
  9. Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
  10. Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
  11. Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
  12. Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
  13. Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166(2015).
  14. Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
  15. Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
  16. Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
  17. Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
  18. Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogen Sulfide DetectionH2S Producing BacteriaBismuth Sulfide PrecipitationVisual Detection MethodMicrotiter Plate AssayBacterial Biochemical IdentificationSulfur Amino Acid MetabolismBlack Precipitate FormationHigh Throughput ScreeningBacterial Culture Assay

Related Articles