ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI

סיכום

זוהי שיטה נפוצה עבור דיסקציה של גונאד C. elegans ואחריה סדק הקפאה, אשר מייצרת דגימות germline עבור immunofluorescence באמצעות צביעת נוגדנים, או עבור צביעת DAPI פשוטה כדי לדמיין DNA. פרוטוקול זה זכה להצלחה עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת מחקר ובהתנסות מחקרית לתואר ראשון מבוססת קורסים.

תקציר

הנבט C. elegans מהווה מודל מצוין לחקר מיוזה, בין השאר בשל הקלות של ביצוע ניתוחים ציטולוגיים על בעלי חיים מנותחים. תכשירי הר שלמים משמרים את המבנה של גרעינים מיוטיים, וחשוב מכך, כל זרוע גונד מכילה את כל שלבי המיוזה, המאורגנת בהתקדמות טמפורלית-מרחבית המקלה על זיהוי גרעינים בשלבים שונים. להרמפרודיטים בוגרים יש שתי זרועות גונאד, שכל אחת מהן מאורגנת כצינור סגור עם תאי גזע נבטים מתרבים בקצה הסגור הדיסטלי וביציות תאיות בקצה הפתוח הפרוקסימלי, המצטרפים למרכז ברחם. דיסקציה משחררת זרוע גונד אחת או שתיים מחלל הגוף, ומאפשרת לדמיין את כל המיוזה. כאן מוצג פרוטוקול נפוץ לאימונופלואורסצנציה כנגד חלבון בעל עניין, ואחריו מכתים DAPI כדי לסמן את כל הכרומוזומים. צעירים משותקים בלבמיזול ומנותחים במהירות באמצעות שתי מחטי מזרק. לאחר שחול germline, הדגימה קבועה לפני שעברה סדק הקפאה בחנקן נוזלי, אשר מסייע לחדור את הציפורן ורקמות אחרות. לאחר מכן ניתן לייבש את הדגימה באתנול, לייבש אותה ולדגירה באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים. DAPI מתווסף לדגימה במדיום ההרכבה, המאפשר הדמיה אמינה של דנ"א ומקל על מציאת בעלי חיים להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקה זו מאומצת בקלות על ידי מי שמכיר את הטיפול ב - C. elegans לאחר מספר שעות שהושקעו בתרגול שיטת הדיסקציה עצמה. פרוטוקול זה נלמד לתלמידי תיכון ולתואר ראשון העובדים במעבדת מחקר ושולב בהתנסות מחקרית לתואר ראשון מבוססת קורסים במכללה לאמנויות ליברליות.

מבוא

מיוזה היא חלוקת תאים מיוחדת המשמשת ליצירת גמטות (ביציות וזרע/אבקה) בכל האורגניזמים המתרבים מינית ^1,2. רקומבינציה מוצלבת היא חילופי גומלין של דנ"א בין כרומוזומים הומולוגיים; הוא חיוני למיוזה, הן מספק מקור חשוב למגוון גנטי והן מקדם את יציבות הגנום לאורך דורות. כרומוזומים שאינם מצליחים ליצור לפחות קרוסאובר אחד במהלך המיוזה יפרידו באופן אקראי, מה שעלול לגרום לאי-הפרדה של כרומוזומים, וליצור גמטות עם מספר שגוי של כרומוזומים – מצב שהוא בדרך כלל קטלני עבור צאצאים כתוצאה³. במהלך מיוזה, קרוסאוברים מושרים על ידי שברי דנ"א דו-גדיליים מתוכנתים⁴. תת-קבוצה של שברים אלה תתוקן כהצלבות המספקות קישורים פיזיקליים של דנ"א, הנקראים כיאסמטה, המסייעים לכוון כרומוזומים הומולוגיים לקראת חלוקת התא⁵. שלבים מיוטיים נשמרים מאוד בכל האאוקריוטים, והקונפורמציה הכרומוזומלית שלהם מאפשרת לזהות אותם בקלות.

כמושג יסוד בביולוגיה, מיוזה היא נושא שהתלמידים נתקלים בו פעמים רבות בקורסים שונים בביולוגיה. לעתים קרובות הם מתוודעים למכניקה של הפרדת כרומוזומים מיוטיים בתיכון, בעוד שקורסים ברמת המכללה מתמקדים בביולוגיה של התא של הפרדה ובהשפעה הגנטית של רקומבינציה מוצלבת. עם זאת, מיוזה היא מושג מסובך לשמצה עבור תלמידים רבים¹. כישלון בהבנת הקשר בין גנים, דנ"א, כרומוזומים ומיוזה עלול ליצור תפיסות מוטעות של תלמידים ופערים בהבנה המעכבים הבנה מלאה של התורשה הגנטית ^6,7. אחת הדרכים לשפר את הבנת התלמידים בנושאים מופשטים היא לספק פעילויות קונקרטיות מעשיות. לדוגמה, כאשר מלמדים מיוזה, מדריכים יכולים לבחור מתוך פעילויות המחקות אנליזה מולקולרית⁸, מודלים תלת-ממדיים המאפשרים לתלמידים לתפעל מולקולות⁹, או משחקי תפקידים שבהם התלמידים עצמם פועלים מתוך הכוריאוגרפיה המולקולרית¹. שילוב מחקר עם תוצאות לא ידועות הוא דרך יעילה במיוחד לשיפור הבנת התלמידים. פרקטיקה זו ידועה כחוויה מחקרית מבוססת קורסים לתואר ראשון (CURE) ויש לה יתרון נוסף של חיזוק עמדות וסוכנות סטודנטים, במיוחד עבור אלה השייכים לקבוצות שנותרו בתת-ייצוג ב- STEM^10,11. תולעת הנמטודה Caenorhabditis elegans מקובלת במיוחד על מחקרים בכיתה של התנהגות, פוריות וצלבים גנטיים, והיא מודל יעיל להכרת התלמידים למחקר ביולוגי¹².

C. elegans יוצר אורגניזם מודל רב עוצמה לביולוגיה של התא על ידי שילוב של גנטיקה מולקולרית עם ניתוח ציטולוגי פשוט. הוא גם מתאים במיוחד לשימוש בכיתת ביולוגיה ^13,14,15. הם קלים וחסכוניים לתחזוקה במעבדה, ומייצרים מאות צאצאים כל 3 ימים, הן בטמפרטורת החדר הסטנדרטית והן ב -20 מעלות צלזיוס, טמפרטורת הדגירה הנפוצה ביותר. חשוב לציין, ניתן להקפיא אותם כמלאי גליצרול ולשמור אותם במקפיא של -80 מעלות צלזיוס, מה שאומר שכל טעויות גידול שנעשו על ידי חוקרים מתחילים ניתנות לתיקון בקלות¹⁶. יתר על כן, הגנום המבואר היטב שלו מאפשר טכניקות גנטיות קדימה ואחורה^17,18, מה שמאפשר להשתמש ב- C. elegans כדי לענות על שאלות ביולוגיות החל מהמולקולרי ועד האבולוציוני. לבסוף, חוקרי C. elegans יצרו קהילה תומכת שלעתים קרובות מוכנה לספק עזרה וייעוץ למדענים מתחילים¹⁹. יתרונות אלה הובילו לכך ש- C. elegans שולבו במספר CUREs בסוגים שונים של מוסדות 12,19,20,21,22,23.

בנוסף ליתרונותיו למחקר ולהוראה, C. elegans הפך למודל פופולרי למחקרים על פיתוח מיוזה וחיידקים^24,25,26. הבהירות האופטית של בעלי חיים אלה מפשטת את הגישות הציטולוגיות²⁷, ובמבוגרים, גונדות מייצגות כמעט מחצית מהחיה, ומספקות מאות תאים מיוטיים למחקר. בגונדות, גרעיני נבט מיוטיים מסודרים כמו פס ייצור (איור 1); שכפול מיטוטי מתרחש בקצה הדיסטלי של הגונאד, כאשר גרעינים מתקדמים בשלבים מיוטיים כשהם נודדים לעבר הקצה הפרוקסימלי של הגונד, שם עוברים מופרים מגיחים מהפות. מכיוון שהארגון המרחבי הסטריאוטיפי מייצג גם התקדמות טמפורלית באמצעות מיוזה, ניתן לזהות בקלות שלבים שונים על סמך הארגון הכרומוזומלי שלהם ומיקומם בגונד. לבסוף, תהליכים המשבשים את המיוזה וגורמים לאנופלואידיה יוצרים פנוטיפים פשוטים לאפיון, אפילו עבור טירונים: סטריליות, קטלניות עוברית, או שכיחות גבוהה של זכרים (הפנוטיפ שלו)²⁸.

זהו פרוטוקול פשוט להדמיית כרומוזומים מיוטיים ב- C. elegans. הרכבה, דיסקציה, תיקון וכתמי נוגדנים מבוצעים כולם על אותה שקופית מיקרוסקופ, מה שמפשט את הפרוטוקול ומאפשר שחזור דגימה כמעט מושלם. שיטה זו פועלת עבור צביעת DAPI פשוטה כדי לדמיין כרומוזומים וניתן להשתמש בה עבור אימונופלואורסצנציה כדי לדמיין את לוקליזציה של חלבונים בגונד. התלמידים מנתחים גונדות באמצעות מיקרוסקופי ניתוח בסיסיים, מייצרים תכשירים שלמים להדמיה של דנ"א או אימונופלואורסצנציה, ומדמיינים אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב. פרוטוקול זה נלמד לתלמידי תיכון ולתואר ראשון העובדים במעבדת מחקר של C. elegans ושולב ב- CURE במכללה לאמנויות ליברליות¹². למרות של-CURE היה גודל כיתה קטן יחסית, פרוטוקול זה יהיה מקובל על כיתות במגוון מוסדות בשל העלות הנמוכה יחסית של זני תולעים וריאגנטים. המדריכים יוגבלו רק על ידי מספר המיקרוסקופים המנתחים הזמינים לשימוש. ביישום הקודם התלמידים עבדו בקבוצות של שלושה כדי לחלוק מיקרוסקופ אחד והתקיים במשך שלושה מפגשים בני 90 דקות: הראשון לתרגל דיסקציה, השני ליישם דיסקציה וצביעת DAPI, והשלישי כדי לצלם שקופיות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב. השתתפות במחקר לתואר ראשון מעניקה יתרונות רבים לסטודנטים^11,29, הן ברמה האקדמית והן ברמה האישית. הטמעת מחקר בקורסים באמצעות CUREs מאפשרת לתלמידים להשתתף במחקר בזמן השיעור הרגיל^11,30,31, מה שהופך את החשיפה להטבות אלה לנגישה ושוויונית יותר.

פרוטוקול

1. ג. אלגנס

הערה: ראה פרוטוקול תחזוקה¹⁶ של C. elegans ו- Elgin et al.32 לפרטים נוספים. ניתן לרכוש בקלות זנים מסוג C. elegans מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (https://cgc.umn.edu) והם נשלחים בדואר רגיל לכל מקום בארה"ב. כל זן עולה 10 דולר, וכל מעבדה/משתמש משלם אגרה שנתית של 30 דולר.

1. בטכניקה סטרילית, מכינים צלחות אגר בינוניות לגידול נמטודה בקוטר 6 ס"מ (צלחות אגר NGM).
   הערה: ניתן לאחסן צלחות מוזגות במהופך בשרוולי הפלסטיק המקוריים שלהן או במיכלים אטומים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
   1. כדי להכין צלחות אגר NGM, הוסיפו 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של פפטון באקטו, 20 גרם של אגר NGM, ו- ddH₂O עד 1 L (~ 975 מ"ל). סובבו את המדיה באופן אוטומטי באמצעות מחזור נוזל בטמפרטורה של 121°C למשך 20 דקות. מצננים ל 55 מעלות צלזיוס, ובעזרת טכניקה סטרילית, מוסיפים 1 מ"ל של כולסטרול, 0.5 מ"ל של 1 M CaCl₂, 1 מ"ל של 1 M MgSO₄, ו 25 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט חיץ (pH 6).
      הערה: כדי ליצור חיץ פוספט אשלגן של 1 M, יש לערבב 108.3 גרם של KH 2 PO 4 (מונובסיק) ו-35.6 גרם של K₂HPO₄ (dibasic); במידת הצורך, התאם את ה- pH ל- 6 באמצעות KOH. הוסף ddH₂O עד 1 L (בדרך כלל ~ 900 מ"ל) ו autoclave במשך 40 דקות ב 121 °C. 1 ליטר של NGM עושה כ 100 צלחות המכילות 10 מ"ל כל אחד.
2. באמצעות פיפט סרולוגי או העברה, לזהות את הצלחות עם שלוש טיפות של תרביות חיידקים E.coli OP50 (~ 150 μL). נסו לזהות במרכז הצלחת ולהימנע מהנחת כתמים קרובים מדי לקצוות הצלחת; זה ירתיע את בעלי החיים מלזחול במעלה דפנות הצלחות ולייבש.
3. ברגע שהדשא החיידקי מתייבש, אחסנו את הצלחות המנוקדות במהופך בטמפרטורת החדר (RT) למשך עד שבועיים. לוחות תצפית לפחות 1-2 ימים לפני השימוש יאפשרו למדשאות החיידקים לגדול עבים יותר ולתמוך בצפיפות גבוהה יותר של בעלי חיים.
   הערה: כדי להכין תרביות חיידקים OP50, ניתן להזמין OP50 מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis. חיידקי OP50 מפוספסים ממלאי גליצרול על צלחת LB כדי להבטיח מושבות בודדות ונשמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שבועות. תרביות חיידקים מדגם OP50 גדלות ב-LB למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ממושבה אחת - אין צורך בטלטול. כדי להכין מדיה LB, להוסיף 10 גרם של טריפטון, 10 גרם של NaCl, 5 גרם של תמצית שמרים, 950 מ"ל של ddH 2 O, להתאים את ה-pH ל 7 עם 10 N NaOH ולהתאים את הנפח הסופי ל 1 L עם ddH₂O. Aliquot לתוך כמויות של 100 מ"ל ו autoclave במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
4. כדי ליצור מלאי עבודה עבור כל זן, בחר שלושה הרמפרודיטים בשלב L4 על צלחת NGM מנומרת. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס. מצב התרבות הסטנדרטי הוא 20 מעלות צלזיוס. אם הגישה לאינקובטורים מבוקרי טמפרטורה אינה זמינה, שמור על התרביות על הספסל העליון ב- RT.
   הערה: הרמפרודיטים בשלב L4 יכולים להיות מבוימים בקלות הן לפי גודל (קטן יותר ממבוגרים) והן לפי נוכחות של חצי עיגול מובחן באמצע גופם (הפות המתפתח). ב 20 מעלות צלזיוס, בעלי חיים יגיעו לשלב L4 34-46 שעות לאחר הבקיעה (שזה בערך 40-52 שעות לאחר הנחת העוברים). ראו Corsi et ^al.14 לפרטים נוספים על עיתוי שלבי ההתפתחות.
   1. העבר את התרבויות לטמפרטורות שונות כדי לשלוט בקצב ההתפתחות. בעלי חיים יגדלו מהר יותר בטמפרטורות גבוהות יותר ואיטיים יותר בטמפרטורות נמוכות יותר. הם יתחילו להיות סטריליים בטמפרטורות גבוהות מ -25 מעלות צלזיוס.
      הערה: חלק מהגנוטיפים המוטנטים רגישים לטמפרטורה ויציגו פנוטיפים שונים בהתאם לטמפרטורת התרבות.
5. שמור על מלאי העבודה על ידי בחירת שלושה הרמפרודיטים בשלב L4 לצלחת NGM מנומרת חדשה כל 4 ימים. פעולה זו תבטיח אוכלוסייה קבועה וניזונה היטב עם מגוון רחב של שלבי התפתחות.

2. דיסקציה של גונד

1. איסוף מבוגרים תואמי גיל: 12-24 שעות לפני הנתיחה, בחרו הרמפרודיטים בשלב L4 לצלחת NGM מנומרת חדשה - אלה גדלים לבוגרים צעירים למחרת, וזה אידיאלי לדיסקציה. מספר ההרמפרודיטים בשלב L4 יהיה תלוי בניתוח הציטולוגי המבוצע; בדרך כלל, 10-20 הרמפרודיטים מנותחים לכל שקופית, עם שתיים עד ארבע שקופיות שנוצרות בכל מצב.
   הערה: גונדות מובלעות בצורה היעילה ביותר בבעלי חיים שניזונו היטב. הקפידו לקטוף הרמפרודיטים L4 ממלאי עבודה שאינו מורעב (כלומר, עדיין יש מדשאה חיידקית נראית לעין על הצלחת). בעלי חיים מורעבים נוטים לעבור הבלטות גונדות לא שלמות, מה שמקשה לדמיין אותם.
   1. אם מעריכים שלבים מאוחרים יותר של מיוזה, כמו דיאקינזיס, מנתחים מבוגרים (48 שעות לאחר L4) מכיוון שהם צוברים יותר גרעינים בשלב דיאקינזיס, מה שמפשט את הניתוח. עם זאת, החוקרים צריכים לשים לב לאפשרות כי השפעות מסוימות עשויות להיגרם על ידי גיל אימהי מתקדם.
2. היכונו לנתיחה.
   1. הכן M9: הוסף 3 גרם של KH 2 PO 4 (מונובסיק), 6 גרם של Na 2 HPO₄ (dibasic), 5 גרם של NaCl, והוסף ddH₂O ל 100 מ"ל. Autoclave את הפתרון במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, לתת לו להתקרר, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1 M MgSO₄ באמצעות טכניקה סטרילית.
   2. הכינו חיץ ניתוח: ערבבו 1 μL של 10% Tween 20, 12 μL של 100 mM levamisole, 10 μL של 10x M9, ו 77 μL של ddH₂O.
      הערה: Tween 20 כלול במאגר החיתוך כדי להפחית את מתח הפנים ולחדור עוד יותר לקרום הרקמות.
   3. הכן תמיסת תיקון (2% PFA [100 μL]): ערבב 12.5 μL של 16% פרפורמלדהיד (PFA), 10 μL של 10x M9, ו- 77.5 μL של ddH₂O; הקפידו להשתמש באמפולה טרייה של PFA (פתוחה לא יותר משבועיים).
      התראה: PFA הוא כימיקל מסוכן, ויש להכין תמיסת תיקון במכסה האדים.
   4. הגדרת שיטת ההקפאה - חנקן נוזלי קל יותר לניהול, אך במידת הצורך ניתן להשתמש בבלוק אלומיניום על גבי קרח יבש.
      1. שיטת חנקן נוזלי: הניחו פלסטיק או צנצנת קופלין מפלסטיק בקופסת פוליסטירן. ממלאים את הכוס בחנקן נוזלי (גלישה לתוך מיכל פוליסטירן זה בסדר). קבעו את הפינצטה בקרבת מקום. באופן אידיאלי, הכוס צריכה להיות צרה מספיק כדי למנוע משקופיות מיקרוסקופ ליפול אופקיות לחלוטין - שקופיות צריכות לשכב בהטיה ולהיות קלות לאחיזה בפינצטה.
         הערה: חשוב להשתמש במיכלי פלסטיק בעת עבודה עם חנקן נוזלי ולא זכוכית כדי למנוע התנפצות עקב קירור מהיר.
      2. שיטת קרח יבש:
         1. הניחו גוש אלומיניום שטוח על קרח יבש במיכל פוליסטירן או בדלי קרח מלבני. קל יותר להקפיא את השקופיות אם החלק העליון של הבלוק יושב מעל החלק העליון של המיכל.
         2. לבושים בכפפות, לוחצים בעדינות על גוש האלומיניום כדי להבטיח מגע טוב עם קרח יבש ומזרזים את תהליך הקירור (הוא עלול לשחרר צווחה כשהמתכת מתקררת במהירות). הגדר סכין גילוח בקרבת מקום.
         3. השאירו את גוש האלומיניום על קרח יבש למשך 30 דקות לפחות לפני הפסקת ההקפאה כדי לאפשר קירור מלא, הנחוץ להקפאה מהירה.
            הערה: באופן אידיאלי, יש להשתמש בגושי קרח יבש מוצקים, מה שעוזר לפני השטח להישאר בגובה. במידת הצורך, בלוק אלומיניום ניתן להציב על כדורי קרח יבשים, אבל יש להקפיד כדי להבטיח כי פני השטח נשאר ברמה.
         4. פני השטח של בלוק האלומיניום יאספו כפור, מה שיכול למנוע מגע קרוב בין המגלשות לבלוק. השתמש בסכין הגילוח כדי לגרד את הכפור מעל פני השטח, תוך ניקוי שטח לכל שקופית. כיסוי מיכל פוליסטירן עם מכסה יעזור למנוע הצטברות כפור מוגזם.
   5. מלאו צנצנת קופלין ב~40 מ"ל של 95% אתנול.
   6. מלאו שלוש צנצנות קופלין עם ~ 40 מ"ל של PBS-T.
      הערה: כדי ליצור PBS-T, יש לערבב 100 מ"ל של 10x PBS, 5 מ"ל של Triton X-100 ו-2 מ"ל של 0.5 M EDTA (pH 8). הוסף 873 מ"ל של ddH2O. יש לנער במרץ כדי להמיס את Triton X-100. כדי ליצור 10x PBS, יש לערבב 25.6 גרם של Na 2 HPO 4·7H 2 O, 80 גרם של NaCl, 2 גרם של KCl ו-2 גרם של KH₂PO₄. הוסף ddH₂O כדי להעלות את עוצמת הקול עד 1 L. Autoclave למשך 40 דקות בטמפרטורה של 121°C. חומר הניקוי Triton X-100 כלול במאגר הכביסה PBS-T כדי להפחית את מתח הפנים ולשפר את השמירה על בעלי חיים שלמים על המגלשה.
3. נתחו את החיות על מכסה זכוכית בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ. שלב זה רגיש לזמן עקב אידוי החיץ המנתח. זה אמור לקחת פחות מ 5 דקות כדי לסיים נתיחות.
   הערה: Levamisole משמש כדי לשתק בעלי חיים כדי להקל עליהם לנתח, אבל השארתם ב levamisole במשך זמן רב מדי יגרום שחול gonad עניים. הכי קל להפחית את מספר בעלי החיים המנותחים בכל שקופית על מנת להתאים למסגרת הזמן של 5 דקות.
   1. הנח שקופית החזקה על הבמה של מיקרוסקופ מנתח - שקופית האחיזה משמשת להזזת הכיסוי בקלות רבה יותר, וניתן לעשות בה שימוש חוזר ללא הגבלת זמן (איור 2A, תמונה שמאלית).
   2. הניחו את הכיסוי על גבי מגלשת ההחזקה ופיפט 4 μL של תמיסת החיתוך במרכז הכיסוי. הזז את השקופית המחזיקה לצד אחד של הבמה כדי לפנות את התצוגה.
   3. בחר 10-20 הרמפרודיטים לתוך טיפת תמיסת הניתוח. בחר מספיק בעלי חיים כדי לצלם ~ 10 לכל שקופית, אבל לא כל כך הרבה כי הם לא יכולים להיות מנותח בתוך 5 דקות.
   4. נתחו את החיות באמצעות שתי מחטי מזרק, אחת לכל יד (איור 2A).
      1. חצו את נקודות המחטים כדי ליצור צורת X והשתמשו בתחתית ה-X כדי להצמיד מבוגר אל פני השטח של הכיסוי.
         הערה: זה יכול לקחת תרגול כדי לגלות את הדרך הטובה ביותר להחזיק כל מחט במונחים של זווית וסיבוב. התחילו בהחזקת המחטים כאשר השיפועים שלהן (הקצה המשופע) פונים כלפי מטה. ראו את הדיון לקבלת הצעות ללמידה הראשונה לנתח בנפח גדול יותר (איור 2D).
      2. מקמו את צורת ה-X מיד מאחורי הלוע, בערך 1/5 מאורך הגוף של מבוגר צעיר, או ממש מתחת לחלק הברור של הראש (איור 2A, דיאגרמה ימנית).
      3. ערפו את החיה בתנועת מספריים אחת (כמו חיתוך מזון בסכין ומזלג). שחול טוב יגרום לכך שזרוע אחת של הגונד (או לפעמים שתי הזרועות) תשתחרר במלואה מחלל הגוף, יחד עם אחד או שני חצאי המעיים (איור 2B, תמונה שמאלית). המעיים ייראו כהים יותר וברוחב אחיד, ואילו הגונד ייראה צלול עם קצה מחודד דיסטלי.
         1. כל חיה צריכה להיחתך רק פעם אחת; אם הגונד לא פולט לאחר ביצוע החתך, פשוט עברו לחיה הבאה. החתך הראשון מפחית באופן משמעותי את הלחץ ההידרוסטטי בגוף, מה שהופך כל חתך נוסף לא סביר לגרום שחול טוב יותר. אקסטרוזיות לא שלמות או גרועות נראות בקלות בזמן ההדמיה וניתן להתעלם מהן (איור 2B, תמונה ימנית).
            הערה: אל תנסה להפריד את הגונד מהפגר - פעולה זו בדרך כלל תקרע את הרקמה ותגביל את מספר השלבים המיוטיים שניתן לנתח.
      4. חזור על הנתיחה של שאר בעלי החיים על תלוש הכיסוי.
4. תקן את המדגם עם פורמלדהיד.
   1. עובד בעדינות, פיפט 4 μL של פתרון התיקון על כיסוי קרוב מאוד טיפה עם בעלי חיים. באופן אידיאלי, הטיפות קרובות מספיק כדי להתמזג; הימנעו מלהכניס ישירות לתוך טיפת הנתיחה ולעקור את הפגרים המנותקים.
   2. הצמד את הכיסוי לשקופית ההחזקה באמצעות אצבע אחת. ביד השנייה, הזיזו בעדינות את הכיסוי כמה פעמים כדי לערבב את הטיפות. ריכוז התיקון הסופי הוא 0.8% PFA.
   3. החזקת מגלשה טעונה חיובית מלפנים כלפי מטה, השתמש בה כדי להרים את הכיסוי במרכז המגלשה. גע בעדינות בטיפת הדגימה, ומתח הפנים של הטיפה ירים את הכיסוי.
      הערה: למגלשות טעונות חיובית יש ציפוי אלקטרוסטטי המסייע לרקמות להיצמד למשטח כדי למנוע אובדן דגימה.
      1. אם תרצה, מקם את הכיסוי באלכסון, כך שפינה אחת תלויה מהקצה העליון או התחתון של השקופית ב-1 מ"מ. השארת תקרה תקל על פיצוח הכיסוי לאחר הקפאה (איור 2C).
   4. הגדר את השקופית על הספסל ותקן בדיוק 5 דקות ב- RT. במהלך תקופה זו, תייג את השקופית בעיפרון.
      הערה: זה נפוץ לתקן יתר על המידה את הדגימות, אשר ניתן לזהות על ידי הרחקה של נוגדנים מגרעינים או אפילו כל הרקמות. בנוסף, נוגדנים מסוימים רגישים במיוחד לפורמלדהיד. במקרים אלה, להפחית את זמן הקיבוע, או להקטין את הריכוז הסופי של פורמלדהיד בשימוש.
5. הקפאת סדק
   1. מיד לאחר התיקון, הקפיאו את השקופיות.
      1. אם אתם משתמשים בחנקן נוזלי: החזיקו את הקצה המסומן של השקופית עם פינצטה והורידו אותו בעדינות לחנקן נוזלי. שחררו את המגלשה כך שהיא תישען על צד הכוס, מכסה את הצד כלפי מעלה. המגלשות מוקפאות תוך 10 שניות (ברגע שהנוזל מפסיק לרתוח).
      2. אם משתמשים בקרח יבש: מגרדים את הכפור מפני השטח של גוש האלומיניום בעזרת סכין גילוח. החזיקו היטב את הקצה המסומן של המגלשה והניחו אותו על המשטח הנקי, תוך הפעלת לחץ מסוים כלפי מטה כדי להבטיח מגע מלא עם הבלוק. הכיסוי צריך להיות לגמרי על משטח הבלוק. הקפאה מתרחשת תוך 10 שניות וניתן לאשר אותה חזותית כאשר הדגימה מתחת לכיסוי הופכת לקרח.
      3. עבור שתי השיטות, השאירו את השקופיות למשך 5 דקות לפחות כדי להקפיא לחלוטין.
         הערה: לאחר ההקפאה, ניתן להשאיר את השקופיות בחנקן נוזלי או על הבלוק למשך 15-20 דקות, כל עוד הן נשארות קפואות. זה מאפשר לאסוף מספר שקופיות בשלב זה לפני שממשיכים לשלב הפיצוח.
   2. עבודה מהירה, לפצח את הכיסוי להחליק את הדגימה. שלב זה תלוי זמן. הסר את כיסוי הכיסוי וטבל את השקופית באתנול לפני שהדגימה מתחילה להפשיר.
      1. הסר את השקופית הקפואה (באמצעות פינצטה לחנקן נוזלי).
      2. אחזו בחוזקה בקצה הקצר המסומן של המגלשה והצמידו קצה אחד ארוך לספסל.
      3. ביד השנייה, אחזו בחוזקה בתער, והחליקו את קצה סכין הגילוח במורד המגלשה כדי להזיז את הכיסוי מהדגימה והרחק ממנה. שלב זה קל מעט יותר אם הכיסוי ממוקם עם שלוחה פינתית (איור 2C).
6. הניחו מיד את השקופית בצנצנת קופלין המכילה 95% אתנול ב-RT. השאירו את השקופיות באתנול למשך 5 דקות לפחות.
   הערה: ניתן להשאיר שקופיות באתנול לזמן מה - זה מאפשר לאסוף מספר שקופיות בשלב זה לפני שממשיכים לשטיפה. ניתן גם לאחסן שקופיות בשלב זה למשך מספר ימים. אם מאחסנים, הזיזו את צנצנת הקופלין של שקופיות באתנול ל-20 מעלות צלזיוס.
7. שטפו את השקופיות ב-PBS-T שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת ב-RT. השתמשו ב-PBS-T טרי לכל כביסה.
8. אם אתם מכתימים בנוגדנים, המשיכו לשלב 3 (צביעת נוגדנים). אם רק מכתים עם DAPI כדי לדמיין כרומוזומים, המשך לשלב 4 (הרכבה והדמיה).

3. מכתים נוגדנים

1. דגירה ראשונית של נוגדנים
   הערה: כאשר עובדים על תנאים מתאימים לנוגדנים חדשים, חשוב לכלול את הבקרות השליליות הבאות כדי לאמת את הספציפיות של האות הפלואורסצנטי: 1) שקופית שאין לה נוגדן ראשוני ויש לה נוגדן משני בלבד; 2) שקופית עם נוגדן ראשוני בלבד חסר נוגדן משני. כל אחת מהבקרות השליליות הללו אמורה לייצר חוסר מוחלט של אות. אם מזוהה פלואורסצנטיות בשקופית הנוגדנים המשניים בלבד, יש להגדיל את דילול הנוגדנים המשני או להשתמש במדרס אחר. אם פלואורסצנציה מזוהה בשקופית הנוגדנים העיקרית בלבד, סביר להניח שהיא נובעת מאוטופלואורסצנציה או מזהמים פוטנציאליים אחרים.
   1. לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר דילול נוגדנים (50 מ"ג BSA + 50 μL של 10% נתרן אזיד + 10 מ"ל של PBS-T ) - להכין דילול נוגדנים מספיק כדי להשתמש 20-30 μL לכל שקופית.
   2. הכנת תא לח: מרפדים את תחתית מיכל הפלסטיק במכסה אטום במגבות נייר לחות. הניחו שכבה אחת של פיפטות פסטר מזכוכית על גבי מגבות הנייר. פיפטות אלה יוצרות משטח המאפשר למגלשות להישאר בגובה ושומר עליהן מוגבהות ממגבות הנייר.
      הערה: עבור תאים לחים, עדיף להשתמש במיכלי אחסון מזון מפלסטיק עם מכסי הצמדה, מה שמקל על פתיחה וסגירה של המיכל מבלי להפריע למגלשות שבתוכם. חפשו אחד ארוך מספיק עבור פיפס פסטר אך יש לו גם תחתית שטוחה יחסית ללא כניסות כדי לאפשר לשקופיות לנוח אופקית לחלוטין.
   3. הסר את השקופית משטיפת PBS-T הסופית. עבוד במהירות משלב זה קדימה כדי לשמור על הדגימה רטובה בכל עת ולמנוע אידוי. אם הדגימה מתייבשת, הכתמת הנוגדנים תושפע לרעה.
   4. ייבשו את כל משטח המגלשה באמצעות רקמת ניגוב המקופלת למלבן קומפקטי. נגבו את החלק הקדמי והאחורי של המגלשה, אך השאירו הרבה מקום מסביב לדוגמה. היזהרו במיוחד בעת ייבוש המשטח ליד הדגימה - הימנעו מלהתקרב יותר מדי לדגימה, מה שמשאיר אזור בערך בגודל של הכיסוי לא מיובש. עם זאת, ודא כי היקף המדגם יבש לשלב הבא.
   5. ציירו עיגול סביב הדגימה באמצעות עט PAP הידרופובי. השתמש בזהירות כדי להקיף את כל אזור הדגימה, אך הימנע מלהפריע לפגרי בעלי חיים הנראים על פני השקופית. המתן ~ 5 שניות כדי לאפשר למחסום להתייבש לחלוטין.
      הערה: יש צורך במחסום הידרופובי כדי להכיל את תמיסת הנוגדנים העיקרית מכיוון שפני השטח של המגלשה מצופים ב- PBS-T, המכיל חומר ניקוי. עט PAP פועל בצורה הטובה ביותר על משטח החלקה יבש, ולכן חשוב ליצור היקף יבש סביב הדגימה. השארת האזור הקרוב ביותר לדגימה ללא התייבשות מגנה על הדגימה במהלך שלב זה
   6. בעבודה מהירה, השתמש בפינה או בקצה של רקמת הניגוב המקופלת כדי לשלוף נוזלים מהדגימה בתוך המחסום ההידרופובי. היזהרו כדי למנוע הפרעה לפגרי בעלי חיים.
   7. מיד פיפט 20 μL של תמיסת הנוגדנים העיקרית לתוך הטבעת שנוצרה על ידי מחסום הידרופובי. יש להקפיד על צנרת עדינה ובזווית כדי למנוע שיבוש פגרים. הימנעו מפיפטה ישירות על כל פגר.
   8. הטה את ההחלקה בעדינות כדי להבטיח שכל פני השטח בתוך המחסום ההידרופובי מכוסים על ידי התמיסה.
      הערה: עדיף אם למחסומים ההידרופוביים יש היקף פנימי של 1-1.5 ס"מ, המכוסה במלואו על ידי 20 μL של תמיסת הנוגדנים. רוחב ההיקף יהיה תלוי באופן חלוקת הפגרים במהלך שלב ההקפאה-סדק. מחסומים רחבים יותר עשויים לדרוש נפח גדול יותר של תמיסת נוגדנים. אם רוצים, ניתן להניח בעדינות ריבועים קטנים של פרפילם (חתוכים לגודל של 18 מ"מ x 18 מ"מ) על גבי הדגימה. ריבועי הפרפילם יבטיחו שתמיסת הנוגדנים מכסה את כל הדגימה וגם תסייע במניעת אידוי.
   9. חזור על שלבים 3.1.3-3.1.8 עבור שאר השקופיות.
   10. העבירו בזהירות את המגלשות לתא הלח, כדי לוודא שהתמיסה נשארת כלולה בתוך המחסום ההידרופובי ושהמגלשות נחות לגמרי.
   11. דגירה של המגלשות למשך הלילה ב- RT. בהתאם לנוגדן, ניתן לקצר שלב זה ל -6 שעות או לבצע לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על ידי שמירה על החדר הלח בחדר קר או במקרר.
       הערה: שימוש בתא לח ובמחסומים הידרופוביים מספיק בדרך כלל כדי למנוע אידוי של תמיסת הנוגדנים, אפילו לדגירות ארוכות במהלך הלילה. עם זאת, אם אידוי מתגלה כבעיה, ריבועים קטנים של פרפילם יכולים להיות ממוקמים בעדינות על כל דגימה, מה שיסייע במניעת אידוי. ניתן להסיר אותם בשלב השטיפה הראשון: לטבול כל שקופית בצנצנת קופלין מלאה ב-PBS-T (ללא שקופיות אחרות), ולאפשר לפרפילם לצוף הרחק מהדגימה. הסר את הפרפילם מצנצנת קופלין לפני שתשתמש באותה צנצנת כדי להסיר את הפרפילם מהשקופית הבאה.
2. שטפו את השקופיות בצנצנות קופלין המכילות ~ 40 מ"ל של PBS-T שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת ב- RT. השתמשו ב- PBS-T טרי לכל כביסה.
   1. במהלך שטיפות אלה, יש לדלל את הנוגדן המשני במאגר דילול הנוגדנים. הכן דילול נוגדנים מספיק כדי להשתמש ב-20-30 μL לכל שקופית. מקובל להשתמש בנוגדנים משניים מצומדים של Alexa Fluor המדוללים בשעה 1:200.
3. דגירה משנית של נוגדנים
   1. הסר את השקופית משטיפת PBS-T הסופית. עבוד במהירות משלב זה קדימה כדי לשמור על הדגימה רטובה בכל עת ולמנוע אידוי.
   2. יבשו את המגלשה באמצעות רקמת ניגוב מקופלת. הימנע מייבוש האזור הכלול על ידי המחסום ההידרופובי.
   3. בעבודה מהירה, השתמש בפינה או בקצה של רקמת הניגוב המקופלת כדי לשלוף נוזלים מהדגימה בתוך המחסום ההידרופובי. היזהרו שלא לשבש את פגרי בעלי החיים.
   4. מיד הזרימו 20 μL של תמיסת הנוגדנים המשנית לתוך הטבעת שנוצרה על ידי המחסום ההידרופובי. יש להקפיד על צנרת עדינה ובזווית כדי למנוע הפרעה לפגרים.
   5. הימנעו מפיפטה ישירות על כל פגר. ודא כי כל פני השטח בתוך המחסום ההידרופובי מכוסה על ידי הפתרון. היקפי מחסום רחבים יותר עשויים לדרוש נפח גבוה יותר של תמיסת נוגדנים. אם תרצה, כסה את הדגימה בריבוע קטן של פרפילם (ראה הערה להלן שלב 3.1.8).
   6. העבירו בזהירות את המגלשה לתא הלח, וודאו שהתמיסה נשארת כלולה בתוך המחסום ההידרופובי ושהמגלשה נחה לגמרי. החלף את המכסה על התא הלח כדי לשמור על המגלשה בחושך.
   7. חזור על שלבים 3.3.1-3.3.6 עבור שאר השקופיות.
   8. דגירה בחושך במשך 4 שעות ב- RT.
      הערה: בהתאם לנוגדן, ניתן לקצר שלב זה לשעתיים או להאריך אותו ל-6 שעות. אם החדר הלח אינו חשוך, הניחו אותו במגירה או כסו אותו בקופסת קרטון. לחלופין, ניתן לעטוף את התא הלח ברדיד אלומיניום כדי לשמור על המגלשות בחושך.
4. שטפו את השקופיות בצנצנות קופלין המכילות ~ 40 מ"ל של PBS-T שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת ב- RT. השתמשו ב- PBS-T טרי לכל כביסה.

4. הרכבה והדמיה

1. התכוננו להרכבת הדגימה על ידי הרכבה בינונית + DAPI (2 מיקרוגרם/מ"ל), כיסויי זכוכית של 18 מ"מ x 18 מ"מ ולק בהישג יד.
2. יש להסיר את המגלשה מהשטיפה הסופית ולייבש באמצעות רקמת ניגוב מקופלת. הימנע מייבוש האזור הכלול על ידי המחסום ההידרופובי.
3. באמצעות הפינה של רקמת הניגוב המקופלת, יש לפתות בזהירות נוזלים מהדגימה שבתוך המחסום. הסר את רוב הנוזלים בשלב זה, אך מבלי לתת לפגרים להתייבש לחלוטין.
4. בעבודה מהירה, הוסף 8 μL של מדיום הרכבה לדגימה. פיפט בעדינות ובזווית כדי למנוע הפרעה לפגרים. הימנעו מפיפטה ישירות על הפגרים.
5. עדיין עובד במהירות, הורד בזהירות כיסוי זכוכית על הדגימה.
   1. בועות אוויר עלולות לשבש את ההדמיה ולהוביל להתפרקות הדגימה. כדי למזער בועות אוויר, הנח קצה אחד של הכיסוי על השקופית שליד הדגימה, כך שהוא מוחזק באלכסון מעל הדגימה. זה יכול לעזור להניח את הקצה הגבוה יותר של הכיסוי על עיפרון או פינצטה. לאחר מכן הורידו באיטיות את הקצה הגבוה יותר של הכיסוי כלפי מטה - תנועה זו מאפשרת למדיום ההרכבה ליצור אטימה נוזלית המתקדמת מקצה אחד לקצה הנגדי.
6. חזור על שלבים 4.2-4.5 עבור שאר השקופיות.
7. אטמו את הכיסויים עם לק. יש להיזהר מלחיצה כלפי מטה על הכיסוי (אשר ירסק את הדגימה) או מהסרת הכיסוי אופקית (אשר תמרח את הדגימה).
   1. הוסיפו נקודה קטנה של לק לכל פינה של מכסה (ברוחב ~1 מ"מ). אלה יעזרו להחזיק את הכיסוי במקום. תנו לנקודות להתייבש לחלוטין.
   2. כאשר הפינות יבשות לחלוטין, אטמו את הקצוות עם לק. ודא שהלק ממלא לחלוטין את הרווח בין הכיסוי להחלקה, אך הימנע מכיסוי הדגימה יותר מדי. עדיף לשמור על חפיפה של 1 מ"מ על הכיסוי. יש להשתמש רק בכמות הלק הדרושה. הימנע משימוש רב מדי או שיש עודף לק, אשר יכול לקחת זמן רב להתייבש ומסתכן בפגיעה מטרת המיקרוסקופ.
      הערה: עדיף להשתמש בלק צבעוני במקום שקוף, מה שמקל על ראיית גבול החותם ומסייע במניעת הדמיה של בעלי חיים הנמצאים מתחת לגבול הלק.
   3. יש לאפשר ללק להתייבש לחלוטין לפני ההדמיה. שלב זה חשוב, שכן לק רטוב עלול לפגוע קשות במטרות המיקרוסקופ.
      הערה: יש לשמור את השקופיות בחושך ככל האפשר מכאן והלאה. השתמשו בקופסת קרטון שטוחה כדי לכסות אותם בזמן שהם מתייבשים על הספסל.
8. אחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שבועות לפני ההדמיה. במידת הצורך, אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -20°C למשך זמן ארוך יותר.
9. תמונה באמצעות מיקרוסקופיית אור פלואורסצנטית סטנדרטית.
   1. עבור כל שקופית, ראשית, בדוק את הדגימה כולה ב- 10x בערוץ DAPI כדי לזהות גונדות בולטות היטב ולציין את מיקומן. ברוב היישומים, הימנעו מהדמיית גונדות מנותקות, לא שלמות או מכוסות חלקית על ידי חלק אחר של החיה. עבור רוב בעלי החיים, רק זרוע גונד אחת תהיה גלויה וגלויה במלואה.
      הערה: זה יכול להיות מועיל לצלם תמונה בהגדלה נמוכה יותר במחיר של פי 10 מכל הגונד בערוץ DAPI כדי להשתמש בה להתמצאות מאוחרת יותר או לזהות את המיקום של גרעינים ספציפיים.
   2. בהתאם ליישום, ניתן לצלם תמונות ברזולוציה של 40x, 63x או 100x. אם יש ללכוד את הגונד כולו, צור מונטאז' עם גבולות חופפים. בזמן ההדמיה, זכור כי הגונד הוא צינור חלול, עם גרעינים צפופים ביותר בחלק העליון והתחתון.

תוצאות

DAPI נקשר בחוזקה לדנ"א, והכתמים שלו חזקים אפילו במגוון רחב של תנאים (איור 3A,B). זה צריך להיות נוכח בכל הגרעינים ולכן עושה שליטה חיובית יעילה על נוכחות של כל רקמת תולעת על המגלשה ואת היכולת לזהות פלואורסצנציה על המיקרוסקופ. צביעה יעילה כאשר הנוגדן נמצא בתוך גרעינים מיוטיים (איור 3A,B). לדוגמה, איור 3A,B מראה גרעיני פכיטן בינוניים המוכתמים ב-DAPI ונוגדן המכוון ל-RAD-51, סמן לשברים דו-גדיליים. KLE-2 הוא מרכיב של קונדנסין, קומפלקס חלבונים שמור מאוד שמבנה כרומוזומים כהכנה למיטוזה ומיוזה. למוטציות kle-2/+ יש פגמים קלים במבנה הכרומוזומים, כפי שמוצג על ידי צביעת DAPI מעט לא מסודרת ועלייה במספר השברים הדו-גדיליים המשתקפת במספר הגבוה יותר של מוקדי RAD-51 (איור 3B). טעות נפוצה עבור אימונופלואורסצנציה היא השארת הדגימה בפתרון התיקון למשך זמן רב מדי. קיבוע יתר עלול להוביל להכתמה לא מוצלחת מכיוון שהוא בדרך כלל מונע מהנוגדנים להתפזר לגרעינים. ניתן לזהות טעות זו כאשר הנוגדן מתפזר באזורים הציטופלסמיים של הגונד, אך נראה כי הוא אינו נכלל בגרעינים.

בגרמלין (איור 1), גרעינים מתרבים באופן מיטוטי בקצה הדיסטלי, נכנסים למיוזה במהלך אזור המעבר, ומתקדמים דרך פכיטן (שלעתים קרובות מחולק לשלושה שלבים שווים על ידי מספר שורות גרעינים) לפני שהם נכנסים לדיפלוטן ולבסוף לדיאקינזיס. ביציות בדיאקינזיס ממוספרות על סמך קרבתן לזרעונים, כאשר הביצית -1 היא הפרוקסימלית ביותר לזרעונים, הביצית -2 היא הדיסטלית הבאה, וכן הלאה. ל-C. elegans יש שישה כרומוזומים, המתבטאים כאליפסות קומפקטיות בגרעיני דיאקינזיס. כל אחד מהם מייצג זוג הומולוגי של שני כרומטידים אחיות המוחזקים יחד על ידי כיאזמה, הנקראת גם דו-ערכית (איור 3C). מוטנטים, כמו spo-11, שמשבשים את היווצרות ההצלבה לא יצליחו ליצור כיאסמטה; לכן, גרעיני דיאקינזיס יכללו 12 גופי DAPI נפרדים (הנקראים גם חד-ערכיים), אחד עבור כל כרומטיד אחות (איור 3D).

איור 1: גרעיני Germline ערוכים באופן מרחבי-טמפורלי המייצג את התקדמותם באמצעות מיוזה . (A) הרמפרודיט בוגר שלם מוכתם ב-DAPI. גונד ושלבים מיוטיים מתוארים, מן הקצה הדיסטלי (כוכבית) לאזור הפרוקסימלי (ביצית -1, מסומן עם חץ), אשר מכיל את spermatheca (משולש). סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (B) תמונה פלואורסצנטית מוקרנת של גונד הרמפרודיט מנותק המוכתם ב- DAPI. שלבים מיוטיים מסומנים, כאשר גרעינים מייצגים מוצגים בכניסות (כל הסטים מוצגים בקנה מידה אחד עם השני). גרעינים יכולים להיות מבוימים בקלות על סמך מיקומם בנבט והמורפולוגיה של הכרומוזום האופייני, תוך התקדמות מהאזור המיטוטי בקצה הדיסטלי (כוכבית), לאזור המעבר, דרך פכיטן, דיפלוטן ודיאקינזיס. הזרעון מסומן במשולש. נתון זה הותאם מ- Hillers et al. תחת רישיון CC BY 3.0²⁸. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: הדגמה של הגדרת דיסקציה. (A) שלב המיקרוסקופ במהלך דיסקציה. בעלי חיים מנותחים ב-4 μL של תמיסת דיסקציה על כיסוי המונח על מגלשת האחיזה, המשמשת להזזת הכיסוי לתצוגה. התרשים מציג מיקום מחט אידיאלי. מחטים מוחזקות עם קצה משופע הפונה כלפי מטה, חוצה את אזור הלוע. חיצים ורודים מדגימים תנועה דמוית מספריים למחטים. הקו המקווקו הוורוד מראה את מיקום החיתוך האידיאלי. (B) תמונות של בעלי חיים מנותחים, עם דוגמה של שחול מלא ושחול לא שלם. קטעים של גונדות בולטות ומעיים מסומנים. (C) תמונה המדגימה את שלב ההקפאה-סדק. יש להחזיק את המגלשה בחוזקה ביד אחת, כאשר צד הכיסוי פונה הרחק מהגוף. הקצה הנגדי ניצב על הספסל. סכין הגילוח צריך להיות מוחזק ביד השנייה. החץ הוורוד מציין את כיוון התנועה של סכין הגילוח כדי להזיז את הכיסוי מהמגלשה, עם סיבוב קל כך שמכסה הכיסוי מתרחק מהגוף. שים לב שהכיסוי הוצב כך שפינה אחת תלויה מעל הקצה הארוך של המגלשה. (D) תמונה של ההתקנה לתרגול נתיחה בכלי צביעה של עובר זכוכית. בעלי חיים ממוקמים 50-200 μL של פתרון דיסקציה, אשר שולל את הבעיה של אידוי ומאריך את הזמן עבור דיסקציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: תוצאות פלואורסצנטיות מייצגות של גרעיני נבט. (A,B) תחזיות Z-stack של גרעיני פכיטן מאוחרים המוכתמים בנוגדן RAD-51 (ירוק) ו-DAPI (אדום) ב-(A) מסוג בר ו-(B) kle-2/+ heterozygotes. (ג,ד) הקרנות Z-stack של גרעין דיאקינזיס יחיד המוכתם ב-DAPI ב-(C) מסוג פראי (עם שישה גופים מכתימים של DAPI) ו-(D) מוטציות spo-11 (עם 12 גופים מכתימים של DAPI). סרגלי קנה מידה מייצגים 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

דיון

רבייה מינית דורשת יצירת גמטות הפלואידיות, המיוצרות באמצעות חלוקת תאים מיוחדת של מיוזה. C. elegans הפך למודל פופולרי למחקר ציטולוגי של מיוזה בשל השקיפות האופטית שלו, אנטומיה נוחה של חיידקים וגנטיקה רבת עוצמה²⁸. ניסויים אורגניזמים פשוטים המעריכים פוריות וקטלניות עוברית יכולים להיות משולבים עם גנטיקה מולקולרית כדי לענות על שאלות רבות במעבדה או בכיתה. לדוגמה, מכיוון שהצלבות חיוניות להפרדה תקינה של כרומוזומים, תהליכים המשבשים את היווצרותם או את פעולתם ייצרו גמטות אנאופלואידיות. בתורו, aneuploidy מוביל צאצאים בלתי נסבלים, אשר ניתן להעריך בקלות על ידי ספירת צאצאים, או באמצעות שיטה קצת יותר מסובך של קביעת קטלניות עוברית. מבחינה ציטולוגית, מחסור בהצלבות ישפיע על מספר הגופים המכתימים DAPI שנצפו במהלך דיאקינזיס. החוסן של צביעת DAPI וקלות הניקוד הופכים את זה לניסוי אידיאלי ללמד טכניקות ציטולוגיות. הפריסה הטמפורלית-מרחבית של גרעינים בגרמן ההרמפרודיט מספקת תמונת מצב של כל שלב של מיוזה ברגע אחד בזמן. לגרעינים לוקח בערך 54 שעות להתקדם מהקצה המיטוטי הדיסטלי של הנבט לקצה הפרוקסימלי (לדוגמה, ראו Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 ו- Libuda et ^al.35). תזמון מבוסס היטב זה של התקדמות מיוטית מאפשר תיוג מרדף דופק או ניסויים הפוגעים בדנ"א.

מכיוון שצביעת DAPI כמעט תמיד עובדת, היא משמשת כבקרה טכנית שימושית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית (ויכולה לספק סיפוק למיקרוסקופיסטים באימון). צביעת נוגדנים יכולה להיות משתנה יותר והיא מדד טוב לשכפול בין שכפולים. C.elegans gonads יכול להיות קשה לתקן באופן עקבי, שכן שלב זה דורש איזון בין שימור המבנה הכרומוזומלי תוך מתן אפשרות לפיזור נוגדנים מספיק. תיקון עם פורמלדהיד משמר בצורה הטובה ביותר את המורפולוגיה הכרומוזומלית, והכנת פורמלדהיד טרי מאמפולות פרפורמלדהיד סיפקה את התוצאות הניתנות ביותר לשחזור. ניתן גם להשתמש בפורמלדהיד שהוכן מפורמלין (37% פורמלדהיד מימי ומתנול). ייתכן שיהיה צורך לקבוע באופן אמפירי את חוזק הקיבוע ואת התזמון עבור כל נוגדן. שיטות חלופיות כוללות דילוג על קיבוע הפורמלדהיד בשלב 2.4, ולאחר הקפאת סדק, טבילה ב-100% אתנול בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, או טבילה ב-100% מתנול למשך 10 דקות ולאחריה טבילה ב-100% אצטון למשך 10 דקות ב-20°C-. תנאי תיקון אלה מאפשרים חדירה טובה יותר של נוגדנים, אך ישפיעו לרעה על המורפולוגיה של הרקמות (הכרומוזומים ייראו מנופחים ונפוחים יותר).

התזמון חשוב מאוד לשלבי הנתיחה והתיקון המתוארים בשלב 2. מכיוון שנפח תמיסת הדיסקציה קטן כל כך, אידוי יכול להשפיע על ריכוז התיקון הסופי, מה שיגרום לכתם נוגדנים משתנה. מטפל מנוסה ב- C. elegans יכול להכין שקופית תוך פחות מ-2 דקות מההתחלה (שלב 2.3) כדי לתקן (שלב 2.4). המכשול הטכני העיקרי הוא היכולת לקטוף בעלי חיים לתוך טיפת פתרון הנתיחה ולנתח אותם במהירות. זה יכול להיות קל יותר ללמוד כיצד לנתח בכמויות גדולות יותר. חניכים חדשים מתחילים בבחירת בעלי חיים לתמיסת נתיחה של 50-200 מיקרון בצלחת צביעה של עוברי זכוכית (איור 2D); המשטח הרחב יותר מספק יותר מרחב תמרון בעת זיהוי מיקום מחט אידיאלי להבלטות גונד טובות, בעוד שנפח הנוזל הגדול יותר הופך את האידוי לפחות בעיה. ברגע שנוח להם עם תנועות הנתיח, החניכים מתחילים לנתח באמצעות 50 μL בלבד בצלחת, ואז עוברים לנתח ב-20 μL בשקופית. לאחר ניתוח שקופיות, המתאמנים יכולים להתחיל להפחית במהירות את כמות התמיסה עד שהם מהירים מספיק בעבודה ב-4 μL כדי להפוך את האידוי לזניח.

אם תזמון הדיסקציה נותר בעיה, החניכים יכולים לנתח ב-8 μL מתמיסת הדיסקציה במהלך שלב 2.3. לאחר מכן, במהלך שלב 2.4, הם יכולים להוסיף 8 μL של תמיסת התיקון, פיפטינג עדין לערבב ביסודיות (מעקב מקרוב כדי להבטיח כי הפגרים לא יופרעו או pipetted משם), והסרת 8 μL מן התמיסה מעורבת. גישה חלופית זו תביא לאותו נפח סופי של 8 μL ולאותו ריכוז תיקון סופי; נפח זה חשוב כדי להבטיח שהפגרים יבואו במגע הן עם משטח הכיסוי והן עם משטח ההחלקה במהלך סדק ההקפאה בשלב 2.5. אם התזמון של הכנת כל שקופית נשאר בעיה גם בנפחי דיסקציה גדולים יותר, שיטת השעיה לפרוטוקול אימונופלואורסצנציה של germline מתוארת על ידי Gervaise ו- Arur²⁶.

המגבלה העיקרית של שימוש באימונופלואורסצנציה כדי לדמיין חלבונים באתרם היא הזמינות של נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבון מסוים בעל עניין. עם זאת, אם הונדסה גרסה מתויגת של החלבון, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי להמחיש את תג החלבון. נוגדנים המכוונים לתגיות נפוצות, כמו FLAG, HA או GFP, זמינים בדרך כלל. תגים פלואורסצנטיים כמו GFP יכולים לעתים קרובות להיות מרווים על ידי שלבי קיבוע, ולכן מומלץ להשתמש בנוגדן ראשוני המכוון ל- GFP, במקום להסתמך על האות הפלואורסצנטי המקורי עצמו. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא שהוא לוכד את הנבט במסגרת זמן אחת (אם כי כל שלבי האוגנזה יהיו מיוצגים בתוך הנבט). לכן, טכניקה זו יכולה לפספס שינויים דינמיים שעלולים להתרחש כאשר ביצית מתקדמת דרך oogenesis. עם זאת, התזמון של גמטוגנזה נחקר היטב ב - C. elegans; במבוגר צעיר מסוג בר, לביצית לוקח בערך 60 שעות להתקדם מהקצה הדיסטלי של הנבט (האזור המיטוטי) לדיאקינזיס³³. לכן, מרדף דופק או התערבות ספציפית כמו הקרנה ואחריו קורס זמן יאפשרו תצפית על השפעות בשלבים שונים של מיוזה.

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של C. elegans gonad ואחריה DAPI וכתמי נוגדנים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ניתוח ותיקון (שלב 2) לוקח 60-90 דקות, תלוי במספר השקופיות שנוצרו. צביעת נוגדנים (שלב 3) היא לרוב ללא ידיים ויכולה לנוע בין 7 שעות לכל הפחות ל-1.5 ימים, תלוי בזמני הדגירה של הנוגדנים. הרכבה (שלבים 4.1-4.7) אורכת כ-15 דקות. גישה כללית זו להדמיית כרומוזומי נבט והגונד יכולה לשמש למחקרים ציטולוגיים של כל חלבון אם קיים נוגדן או מגיב תג פלואורסצנטי. בצורתו הפשוטה ביותר, ניתן להשתמש בצביעת DAPI של גרעיני דיאקינזיס כדי לסנן גורמים המשפיעים על רקומבינציה מיוטית. בשילוב עם ניתוחים אורגניזמים של מספר הצאצאים, שכיחות הזכרים (פנוטיפ He) וקטלניות עוברית, גישה ציטולוגית זו מספקת קונטרפונקט חד-תאי לניתוחים מבוססי אוכלוסייה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב IgG בדיקות	מולקולריות	711-545-152
בלוק חימום/קירור אלומיניום	Millipore Sigma	Z743497
Bacto Peptone	Gibco	DF0118 17 0
בורוסיליקט זכוכית פסטר פיפט, חד פעמי, 5.75 אינץ'	Fisherbrand	13 678 20B	משמש להכנת קטיף תולעים
BSA, סרום בקר אלבומין	VWR	97061 420
C. elegans סוג בר (אבות)	Caenorhabditis מרכז גנטיקה	N2 (אבות)
C. elegans kle-2 (ok1151) מוטאנטים	Caenorhabditis המרכז לגנטיקה	VC768	הגנוטיפ המלא של זן זה הוא: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III). יש לו kle-2 מאוזן עם כרומוזום מאזן המסומן ב-GFP פרנגאלי. בחר בעלי חיים לא ירוקים כדי לזהות מוטציות הומוזיגוטיות kle-2.
C. elegans spo-11 (me44) mutants	Caenorhabditis Genetics	Center TY4342	הגנוטיפ המלא של זן זה הוא: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). יש לו spo-11 מאוזן עם כרומוזום מאזן המסומן ב-GFP פרנגלי. בחר בעלי חיים לא ירוקים כדי לזהות מוטציות הומוזיגוטיות spo-11.
סידן כלוריד נטול מים	VWR	97062 590
כולסטרול	סיגמא אולדריץ'	501848300
DAPI	Life Technologies	D1306
EDTA, דיסודיום דיהידראט מלח	Apex Bioresearch	Products 20 147
צלחת עובר, זכוכית, חלל 30 מ"מ	שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית	100492-980	משמש לתרגול ניתוח; זכוכית מועדפת מכיוון שבעלי חיים מנותחים יכולים להיצמד לפלסטיק
Escherichia coli<	em>Caenorhabditis Genetics	Center OP50
מיכל אחסון מזון, פלסטיק		מיכלי	פלסטיק שונים עם (1) תחתית שטוחה יחסית, כדי לאפשר למגלשות לנוח ברמה; (2) מכסים אטומים לאוויר, אך עדיין ניתנים להסרה בקלות מבלי להפריע לתכולת המיכל, ו-(3) באורך של כ-9 אינץ' על רוחב 6 אינץ' עדיפים
צנצנת קופלין זכוכית	DWK מדעי החיים  Wheaton	08-813E
מחסום הידרופובי PAP עט	ImmEdge	NC9545623
Kimwipes Kimtech	Science	06 666A
Levamisole Hydrochloride	Sigma Aldrich	L0380000
מגנזיום סולפט נטול מים	Fisher Chemical	M65 500
מחטים, לשימוש חד פעמי, 25 גרם	BD PrecisionGlide	14 821 13D	כחול, 1 אינץ'
NGM אגר,	מוצרי מחקר ביולוגי	20 249NGM
Parafilm	Bemis	16 101
Paraformaldehyde (16% w/v) תמיסה מימית	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	50 980 487
PBS, מי מלח חוצץ פוספט (תמיסה 10x)	פישר ביו-ריאגנטים	BP399500
צלחות פטרי, 60 מ"מ	Tritech Research	NC9321999	ללא אוורור וקצה חד
(90% פלטינה, 10% אירידיום)	Tritech Research	PT 9010	משמש להכנת קיסמי תולעים
אשלגן כלורי	פישר	BP366-500
אשלגן פוספט Dibasic	VWR BDH כימיקלים	BDH9266 500 גרם
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	VWR BDH כימיקלים	BDH9268 500 גרם
משקפי כיסוי פרימיום 18 מ"מ x 18 מ"מ	Fisherbrand	12-548-AP	0.13– סכיני גילוח בעובי 0.17 מ"מ
, קצה יחיד	VWR	55411 055
SlowFade Gold Antifade Molecular Probes		S36937	חלופות: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) או ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). אם משתמשים ב-ProLong Diamond, אין צורך בלק לאיטום, אך יש להתרפא במשך 24 שעות לפני ההדמיה.
נתרן אזיד	פישר BioReagents	BP922I 500
נתרן כלורי	פישר כימי	S271 500
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים	סיגמא אולדריץ'	7558 79 4
נתרן פוספט דו-בסיסי Heptahydrate	Sigma Aldrich	S9390
קופסת קלקר	שונים	n/a	מידות פנים משוערות: אורך 12 אינץ', רוחב 9 אינץ', עומק 8 אינץ'
שקופיות סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ	פישרברנד	22 037 246
טריטון X-100	פישר ביו-ריאגנטים	BP151 500
טריפטון	Apex מוצרי מחקר ביולוגי	20 251
טווין 20	פישר כימיקל	BP337 500
תמצית שמרים	קודקוד מוצרי מחקר ביולוגי	20 254