מאמר שיטה

מיקרוסקופיה תוך-חיונית לחקר אינטראקציות טסיות-לויקוציטים-אנדותל בכבד העכבר

930 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64239

⸱

6 באוקטובר 2022

 ,  , 
1Center for Translational Research on Inflammatory Diseases, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המספק תובנה לגבי היחסים הזמניים והמרחביים של תהליכים מהירים ו/או עוקבים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להערכת אינטראקציות חלבון-חלבון ואינטראקציות טסיות-נויטרופילים-אנדותל בסינוסואידים בכבד במודל עכברי של אלח דם ניסיוני (אנדוטוקסימיה).

תקציר

דלקת ופקקת הם תהליכים מורכבים המתרחשים בעיקר במיקרו-סירקולציה. למרות שהיסטולוגיה סטנדרטית עשויה לספק תובנה לגבי המסלול הסופי הן לדלקת והן לפקקת, היא אינה מסוגלת להראות את השינויים הזמניים המתרחשים לאורך מהלך הזמן של תהליכים אלה. מיקרוסקופיה תוך-חיונית (IVM) היא שימוש בהדמיה של בעלי חיים כדי לקבל תובנה זמנית על תהליכים פיזיולוגיים in vivo. שיטה זו חזקה במיוחד בעת הערכת אינטראקציות תאיות וחלבונים במחזור הדם עקב האירועים המהירים והרציפים הנחוצים לעתים קרובות להתרחשות אינטראקציות אלה. בעוד ש-IVM היא מתודולוגיית הדמיה חזקה ביותר המסוגלת לצפות בתהליכים מורכבים in vivo, ישנם מספר גורמים מתודולוגיים שחשוב לקחת בחשבון בעת תכנון מחקר IVM. מאמר זה מתאר את תהליך ביצוע הדמיה תוך-חיונית של הכבד, תוך זיהוי שיקולים חשובים ומלכודות פוטנציאליות שעלולות להתעורר. לפיכך, מאמר זה מתאר את השימוש ב-IVM לחקר אינטראקציות טסיות-לויקוציטים-אנדותל בסינוסואידים בכבד כדי לחקור את התרומות היחסיות של כל אחד מהם במודלים שונים של פגיעה חריפה בכבד.

מבוא

דלקת ופקקת הם תהליכים מורכבים המתרחשים בעיקר במיקרו-סירקולציה. פרוטוקול זה מתאר את ההכנה הניתוחית המאפשרת הדמיה של כלי הדם בכבד in vivo. למרות שהיסטולוגיה סטנדרטית עשויה לספק תובנה לגבי מסלולי הקצה הן לדלקת והן לפקקת, היא אינה יכולה להראות את השינויים הזמניים המתרחשים לאורך התהליך. יתר על כן, שיטה זו חזקה במיוחד בעת הערכת האינטראקציות התאיות והחלבונים החולפות המתרחשות במחזור המיקרו-וסקולרי בשל יכולתה ללכוד, באמצעות מיקרוסקופיה וידאו, את האינטראקציות המהירות והרציפות המתרחשות לעתים קרובות בתוך מערכות ביולוגיות. מאמר זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה תוך-חיונית כדי לחקור אינטראקציות טסיות-לויקוציטים-אנדותל בסינוסואידים בכבד כדי לחקור את התרומה היחסית של כל אחד מהם במודלים שונים של פגיעה חריפה בכבד.

בעוד שלשיטת ההכנה וההדמיה הכירורגית הזו יש פוטנציאל להיות מותאם לשורה של מודלים דלקתיים ופתולוגיים, מתוארים כאן שני מודלים של דלקת בכלי הדם: מודל אנדוטוקסימיה של אלח דם בעכברים ופגיעה בכבד הנגרמת על ידי אצטמינופן (APAP). הזרקת אנדוטוקסין (ליפופוליסכריד; LPS) כדי לגרום למודל ניסיוני של אלח דם בעכברים החל כבר בשנות ה-30 של המאה ה-20 עם בידודו וחקירתו לאחר מכן כמולקולת מפתח בהתקדמות אלח דם1. בעוד שמודל זה מוגבל בכך ש-LPS הוא רק מרכיב יחיד של חיידקים גראם-שליליים, זוהי שיטה מקובלת ומנוצלת שהיא יחסית פשוטה ומהירה לביצוע. יתר על כן, הוא משכפל במהירות ובדייקנות את הביטויים הפיזיולוגיים של אלח דם1. בהתחשב בתפקיד שספיגת אנדוטוקסין במעי ממלאת בהתפתחות מחלות כבד ודלקת2, זהו מודל מעולה לחקר אינטראקציות טסיות דם-לויקוציטים-אנדותל בכבד העכבר.

בנוסף למודל LPS של אלח דם, מנת יתר של APAP מספקת מודל מצוין לחקר אינטראקציות פתולוגיות בין תאים בכבד. מנת יתר של APAP עלולה להוביל לאי ספיקת כבד חריפה, המאופיינת בטרומבוציטופניה והצטברות טסיות דם בכבד, וכתוצאה מכך לחסום את התאוששות הכבד בתיווך לויקוציטים3. בעוד שניתן להתאים את ההכנה הכירורגית ומתודולוגיית ההדמיה למודל זה למספר שאלות ביולוגיות ולחקר תהליכים פתולוגיים שונים, הן מודל LPS של אלח דם והן פגיעה בכבד הנגרמת על ידי APAP הם מודלים מצוינים לחקר אינטראקציות טסיות דם-לויקוציטים-אנדותל in vivo.

ל-IVM יש כמה יתרונות מובנים על פני טכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות. בעוד ששיטות היסטולוגיות סטנדרטיות מאפשרות מחקר של דגימות רקמה שלמות או חתוכות והערכה של חלבונים וארכיטקטורת רקמות, מתודולוגיות אלו מגיעות עם מגבלות. על פי התכנון, תהליכים אלה דורשים עיבוד רקמות, שיש לו פוטנציאל לעוות או להסוות את מה שנמצא במערכת החיה. יש לתקן רקמות במהלך ההכנה ההיסטולוגית, ולהציג את הפוטנציאל לחפצי קיבוע או אוטופלואורסצנציה משופרת. קיבוע יכול גם להוביל לשינויים תוך-תאיים ברקמה, והפוטנציאל לקיבוע לא תקין עלול להוביל לפירוק רקמות. יתר על כן, לשיטות היסטולוגיות אין פוטנציאל לחקור ישירות את ההיבטים הזמניים של אינטראקציות חלבון או תאים ויש להן פוטנציאל להחמיץ אינטראקציות ארעיות או נדירות.

לעומת זאת, מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית מאפשרת להימנע מרבים מהסיבוכים והמגבלות הטמונים בהיסטולוגיה סטנדרטית. IVM מונע קיבוע ובכך מהחפצים או ההידרדרות של הרקמות שיכולים להתרחש במהלך ההכנה ההיסטולוגית. על פי התכנון, הוא מאפשר גם הדמיה של רקמות בתוך המערכת הביולוגית החיה, וככזה, אין צורך בבידוד וחיתוך רקמות. יתר על כן, הוא מאפשר הדמיה ומחקר של תהליכים חולפים או נדירים, שיכולים להיות קשים או בלתי אפשריים ללכוד באמצעות היסטולוגיה. ניתן להשתמש בשיטת IVM זו גם כדי ללכוד ולזהות תהליכים עוקבים (למשל, אינטראקציות יזומות טסיות או לויקוציטים וכתוצאה מכך אגרגטים של טסיות דם-לויקוציטים הקשורים לאנדותל כלי הדם). לבסוף, ניתן להתאים שיטה זו לשורה של מערכות הדמיה. בהתאם לצרכי המחקר ולמערך הנתונים הרצוי, לאחר הכנה כירורגית, ניתן למקם את הכבד המוחצן כמעט על כל מערכת הדמיה רצויה. יישמנו בהצלחה פרוטוקול זה להדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבה, מיקרוסקופ דיסק מסתובב, מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר באמצעות סורק ראש תהודה, כמו גם מיקרוסקופיה דו-פוטונית. עם זאת, אין סיבה להאמין שיש להגביל שיטה זו למערכות המיקרוסקופיה שהוזכרו לעיל.

מאמר שיטות זה מתאר פרוטוקול ל-IVM, ששימש בעבר לחקר אינטראקציות טסיות-לויקוציטים-אנדותל בכבד העכבר. פרוטוקול זה שימש להשוואת הידבקות טסיות דם-אנדותל טמפורליות של טסיות דם, בין אם מסומנות בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים או מהונדסות גנטית לפלואורסצנטיותאנדוגניות 4. פרוטוקול זה שימש להערכת אינטראקציות חולפות של טסיות דם-לויקוציטים-אנדותל בסינוסואידים בכבד במודל אנדוטוקסמי של דלקת בכבד ולמיקום משותף של P-סלקטין וחלבון רקומביננטי. בנוסף, פרוטוקול זה איפשר לקבוע אם ההבדלים שנראו בצפיפות הנויטרופילים באמצעות היסטולוגיה סטנדרטית היו תוצאה של הבדלים במהירויות תאי הדם האדומים (כתחליף לקצב הזרימה הנפחי)5. לבסוף, שיטה זו שימשה להערכת גיוס טסיות על ידי תאי קופפר בסינוסיואידים בכבד במודל חריף של פגיעה בכבד הנגרמת על ידי APAP6. גוף עבודה זה לא היה אפשרי בשיטות היסטולוגיות סטנדרטיות. כאמור, ניתן להתאים פרוטוקול זה למגוון מערכות הדמיה, ועם הכנה כירורגית נכונה, בחירת נוגדנים פלואורסצנטיים והגדרות הדמיה, פרוטוקול זה אמין ביותר וניתן לשחזור לחקר פתולוגיה של הכבד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור לרפואה וועדת המחקר והפיתוח של המרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים על שם מייקל א. דבייקי. כל הניסויים הם סופניים, כאשר המתת חסד מבוצעת בסוף תחת מישור כירורגי של הרדמה. עיין בטבלת החומרים לפרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת נוגדנים וצבעים

  1. בחירת נוגדנים וצבע
    הערה: מספר הצבעים בו זמנית שנצפו יהיה תלוי בהגדרת המיקרוסקופ הספציפית. במערכת המשמשת כאן, ניתן לדמיין ארבעה אורכי גל שונים בו זמנית.
    1. הדמיית כלים:
      1. בהתבסס על תכנון הניסוי, סמן את כלי הדם בנוגדנים ספציפיים לאנדותל (למשל, CD31) ו/או מולקולה המפוזרת באופן אחיד בפלזמה (למשל, דקסטרן או אלבומין).
        הערה: מאמר זה מתאר את השימוש בדקסטרן טקסס עם תווית אדומה (150 kDa; 250 מיקרוגרם/עכבר). היתרון של חלבון בעל משקל מולקולרי גדול זה הוא ביכולתו להישאר בתוך כלי הדם במהלך דלקת חריפה. יש לנקוט בזהירות בעת שימוש בתיוג נוגדנים כדי להימנע מנוגדנים בעלי פוטנציאל להפריע לתפקוד האנדותל.
    2. הדמיית טסיות דם:
      1. כדי לזהות טסיות דם, השתמש בעכברים מהונדסים גנטית (למשל, R26R-EYFPf/f/PF4-Cre) או בנוגדנים ספציפיים לטסיות (למשל, anti-GPIbβ) להפריה חוץ גופית. למידע מעמיק לגבי השימוש בתיוג פלואורסצנטי של טסיות דם, עיין בפרסום קודם4.
        הערה: כאן משתמשים בנוגדנים נגד GPIbβ המסומנים ב-DyLight488 (X488; 6 מיקרוגרם/עכבר). יש לנקוט בזהירות בעת שימוש בתווית נוגדנים כדי למנוע הפרעה לתפקוד הטסיות או להידבקות.
    3. הדמיית לויקוציטים:
      1. בדומה להדמיית טסיות דם, דמיין את הלויקוציטים המעניינים עם עכברים מהונדסים גנטית (למשל, LysM-EGFP עבור גרנולוציטים) או נוגדנים ספציפיים ללויקוציטים (למשל, Ly6G עבור נויטרופילים של עכברים). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בנוגדנים אנטי-Ly6G עם תווית Brilliant Violet 421 (BV421) (3 מיקרוגרם לעכבר). בניסויים אקוטיים (<6 שעות), סמנו נויטרופילים עם 3 מיקרוגרם של אנטי-Ly6G (שיבוט 1A8) לכל חיה.
        הערה: בעת שימוש בנוגדנים anti-Ly6G (שיבוט 1A8), יש לציין כי נוגדן זה שימש לדלדול נויטרופילים (0.05-1 מ"ג נוגדן/עכבר)7-9 לאחר 24 שעות לפחות ו/או עם זריקות חוזרות. כמו כן, דווח כי נוגדנים נגד Ly6G (1A8) משפיעים על הידבקות נויטרופילים וגלגול במתח גזירה גבוה (אך לא נמוך) במצבים מסוימים, אך לא בכולם, 9,10. לכן, יש לבחור בקפידה את מינון הנוגדנים לכל מקרה.
    4. חלבונים נוספים:
      1. בהתאם למספר הלייזרים וערכות המסננים/גלאים הזמינים במערכת הדמיה מסוימת, הוסף אורכי גל נוספים כדי לזהות יותר אובייקטים בו זמנית תוך הקפדה על מניעת חפיפה ספקטרלית.
        הערה: פרוטוקול זה מתאר הדמיה של אובייקט רביעי, P-selectin (שיבוט Psel.KO2.3), באמצעות נוגדן אנטי-P-selectin עם תווית PerCP-eFluor 710 (4 מיקרוגרם/עכבר). למרות שרוב התיאורים והתמונות במאמר זה מיועדים לפגיעה חריפה בכבד הנגרמת על ידי LPS, מודלים אחרים של פציעות עשויים להיות מעניינים ועשויים לדרוש תוויות חלופיות. ראה את הדיון לתיאור הנוגדנים המשמשים לפגיעה הנגרמת על ידי APAP6.
  2. הסרת חומרים משמרים ועיקור
    הערה: למרות שישנם נוגדנים וצבעים זמינים מסחרית מוכנים להזרקה לבעלי חיים, לרובם יהיו נשאים או חומרים משמרים (למשל, נתרן אזיד) שעלולים להזיק לבעלי חיים או להוסיף משתנים מבלבלים. יש לבצע דיאליזה של נוגדנים וצבעים המכילים נשאים או חומרים משמרים כנגד תמיסת מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco ללא סידן או מגנזיום (DPBS-/-; או חוצצים פיזיולוגיים אחרים).
    1. יוצקים 500 מ"ל DPBS-/- (נפח פי 1,000~ של הנוגדן/צבע לדיאליזה) לכוס עם מוט ערבוב מגנטי. חבר קלטת של 7,000 MWCO למצוף צף והנח אותה במאגר הדיאליזה למשך 5 דקות לפחות כדי לבצע חימום מוקדם של הממברנה. הסר את הקסטה וכתם את קצוות הפלסטיק יבשים עם רקמה נטולת מוך. הימנע מלגעת בקרום הדיאליזה.
    2. הזריק את הנוגדן/צבע לקלטת דרך אחת מארבע היציאות באמצעות מחט 18-20 G. הנח את הקסטה עם הנוגדן/צבע לתוך מאגר הדיאליזה. מניחים את הכוס על מערבל מגנטי ומבצעים דיאליזה למשך שעה לפחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החלף את מאגר הדיאליזה.
    3. חזור על הדיאליזה והחלפת מאגר הדיאליזה בשלב 1.2.2 למשך לפחות פעמיים נוספות (לפחות שלוש החלפות).
    4. הסר את הקסטה וכתם את קצוות הפלסטיק יבשים עם רקמה נטולת מוך. הימנע מלגעת בקרום הדיאליזה. שאפו את הנוגדן/צבע מהקסטה דרך יציאה שאינה בשימוש באמצעות מחט 18-20 G.
    5. במכסה המנוע לתרבית רקמות, יש לעקר את התכשירים באמצעות פילטר 0.2 מיקרומטר לפני השימוש בבעלי חיים. אחסן חלקים שאינם בשימוש בצינורות סטריליים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. פקדים
    1. בעוד שהבקרות המדויקות הדרושות לכל ניסוי ישתנו בהתאם לתכנון המחקר, הקפד לכלול קבוצות דמה מתאימות, קבוצות שטופלו ברכב ולא טופלו ברכב, כמו גם בקרות איזוטיפ על מנת לא לכלול תיוג לא ספציפי והשפעות ביולוגיות בעת ניתוח תוצאות המחקר.

2. הזרקת אנדוטוקסין תוך פריטונאלי

הערה: כדי להעריך אינטראקציות טסיות-נויטרופילים-אנדותל בסינוסואידים בכבד במודל ניסיוני של אלח דם בעכברים, ניתן להשתמש בהזרקת אנדוטוקסין.

  1. שקלו את העכברים כדי לקבוע את כמות האנדוטוקסין להזרקה (5 מ"ג/ק"ג; Escherichia coli serotype O111:B4; תכולת אנדוטוקסין: 1 x 10,6 EU/mg).
    הערה: העוצמה וההשפעה של אנדוטוקסין תלויות במינים ובזנים ועשויות להשתנות מאצווהלאצווה 11. לכן, כדי למקסם את עקביות התוצאות, יש לערוך ניסויים עם אותה כמות של אנדוטוקסין12.
  2. שאב אנדוטוקסין מדולל במי מלח רגילים (0.9% נתרן כלורי) למזרק עם מחט 27 גרם מחוברת. ביד הלא דומיננטית, החזק את העכבר בשרוול באמצעות האגודל והאצבע המורה. בעזרת היד השנייה, הניחו מתיחה על הזנב כדי לחשוף את הבטן והניחו את הזנב בין הספרה החמישית לכף היד הלא דומיננטית.
  3. נקו את הבטן עם 70% אתנול. הכנס את המחט לבטן השמאלית התחתונה (או הימנית) והזריק את האנדוטוקסין.
    הערה: יש לנקוט בזהירות כדי להימנע מהחדרת המחט עמוק מדי מכיוון שקיים סיכון לפגיעה באיברים שעלולה לבלבל את הניסויים (למשל, פגיעה במעיים, במעי, בכליות וכו').
  4. בצע את שלבים 2.1-2.3 בבעלי חיים באמצעות מי מלח רגילים (או רכב).
    הערה: ניתן לבצע פגיעה בכבד הנגרמת על ידי APAP באמצעות מתודולוגיה דומה לאמור לעיל, באמצעות APAP במקום אנדוטוקסין6. ראה את הדיון לפרטים הקשורים למודל פגיעת הכבד הנגרמת על ידי APAP.

3. אינדוקציה ותחזוקה של הרדמה של בעלי החיים והמתת חסד

  1. הנח את בעלי החיים תחת מישור כירורגי של הרדמה. שמור על ההרדמה באמצעות איזופלורן בשאיפה דרך אף או צינור טרכאוסטומי. העריכו והתאימו את רמת ההרדמה על ידי ניטור תנועה לאחר צביטה בבוהן.
  2. בצע המתת חסד בסוף כל הניסויים על ידי הוצאה תחת מישור כירורגי של הרדמה ואחריו פנאומוטורקסים דו-צדדיים.

4. צנתור של וריד הצוואר וקנה הנשימה

  1. בצע טרכאוטומיה כדי להקל על הנשימה והצבת צנתרים וסקולריים להזרקת נוגדנים/צבעים מסומנים.
    הערה: מיקרוסקופ דיסקציה כירורגית או זכוכית מגדלת מועילים בצנתור.
  2. לגלח את הפרווה מהצוואר והבטן; הסר שיער עודף. הנח את החיה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס, באמצעות בדיקה רקטלית לניטור טמפרטורת הליבה. שפשפו את הצוואר עם בטדין ואחריו 70% אתנול.
  3. בצע חתך אנכי בקו האמצע בצוואר וחשוף את קנה הנשימה באמצעות דיסקציה קהה.
    1. טרכאוסטומיה
      1. הכן צינור טרכאוסטומיה PE90 עם מחט קהה 21 גרם מוכנסת (איור 1A).
        הערה: הוספת שיפוע ~45° לקצה צינור הטרכאוסטומיה עשויה לסייע בהחדרתו לקנה הנשימה. לחלופין, ניתן להחליף צנתר תוך-ורידי היקפי 18-20 גרם בצינורות PE90.
      2. לאחר שהעור והפאשיה נחתכים, החזירו את בלוטות הרוק הרחק מהמרכז.
      3. בעזרת דיסקציה קהה, הפרד את שריר הסטרנו-בלוטת התריס כדי לתת גישה טובה יותר לקנה הנשימה.
        הערה: הקפד להימנע מכלי האספקה ועורקי הצוואר הסמוכים לקנה הנשימה.
      4. בצע חתך אופקי קטן (~1-2 מ"מ) בין טבעות קנה הנשימה בצד הגחון/הקדמי של קנה הנשימה (איור 1B).
        הערה: השימוש במספריים של Vannas יקל על דיסקציה נכונה. ודא שרק הפנים הקדמיות של קנה הנשימה חתוכות; חתך מלא של קנה הנשימה יקשה על קנולציה של קנה הנשימה ומסתכן בפגיעה במבני כלי דם סמוכים.
      5. העבירו צינור טרכאוסטומי לתוך החור. ודא שקצה הצינור אינו מוכנס מעבר לקרינה.
      6. אבטחו את צינור הטרכאוסטומיה בתוך קנה הנשימה על ידי קשירת תפר משי #4-0 סביב קנה הנשימה והצינור, תוך שימוש בטבעות קנה הנשימה כתמיכה (איור 1C).
    2. קנולציה צווארית חיצונית
      1. הכן קטטר צוואר (איור 2) באמצעות צינורות PE50 (OD 0.97 מ"מ, ID 0.58 מ"מ) עם צינורות PE10 (OD 0.61 מ"מ, ID 0.28 מ"מ) מוכנסים לקצה אחד (איור 2 משובץ) ומחט קהה 22 G או 23 G מוכנסת לקצה השני. השתמש בדבק כדי להבטיח שהצינור לא יחליק או ידלוף. חבר מזרק מלא במי מלח רגילים סטריליים כדי לשטוף את הקטטר.
      2. חשוף את וריד הצוואר החיצוני (EJV) לאחר השתקפות בלוטת הרוק. באמצעות דיסקציה קהה, שחררו את ה-EJV מרקמת החיבור שמסביב (איור 3A).
      3. באמצעות תפרי משי #4-0, קשרו את קצה הגולגולת של ה-EJV הדמוי והניחו לולאה רופפת סביב הקצה הזנבי של ה-EJV (איור 3B). מהדקים את הקצוות של כל תפר יחד עם המוסטטים ומרחיקים בעדינות את שני ההמוסטטים זה מזה כדי לעזור לחשוף את ה-EJV.
        הערה: האזור האופטימלי לקנולציה הוא בין ענפי וריד הצוואר הקדמי בגולגולת לווריד הצוואר הפנימי בזנב. כדי להקל על מיקום התפרים, קפלו חתיכה (~15 ס"מ) של תפר לשניים והעבירו את הקצה הכפוף מתחת ל-EJV עם זוג מלקחיים אחד תוך הרמת ה-EJV עם זוג מלקחיים נפרד כדי למנוע גלגול של הכלי. לאחר מכן, חותכים את התפר ליצירת שני אורכים נפרדים.
      4. בעזרת מספריים של Vannas, בצע חתך קטן (~1 מ"מ) במשטח הקדמי של ה- EJV. הכנס מחט קהה כפופה של 30 גרם (מוגברת עם סיכה דקה של 0.15 מ"מ שהוגשה בצורה בוטה ומוכנסת לקצה המחט) לתוך ה-EJV דרך החתך והרם אותה בעדינות כדי להקל על מעבר הצנתר המכיל מי מלח רגילים לתוך ה-EJV.
        הערה: ודא שלקטטר ולרכזת אין בועות אוויר לפני החדרה ושטיפה לעכבר. תסחיף אוויר עלול להיות קטלני לבעל החיים.
      5. ברגע שהקטטר נמצא בתוך ה-EJV, שחרר את לולאת הזנב מספיק כדי לאפשר מעבר של הקטטר עמוק יותר לתוך הווריד. בדוק את מיקום הצנתר על ידי שאיבת דם ושטיפת הקטטר כדי לבדוק אם יש דליפות (איור 3C).
      6. באמצעות לולאת הזנב, אבטח את הצנתר בתוך ה-EJV. באמצעות תפר הגולגולת, הצמידו את הקטטר לקצה הגולגולת של ה-EJV כדי למזער את הדקנוציה בשוגג (איור 3D).
      7. סגור את חתך עור הצוואר עם תפר משי #4-0.

5. החצנה של הכבד

  1. נקו את הבטן בעזרת קרצוף בטדין ואחריו 70% אתנול.
  2. בצע חתך אנכי של ~1 ס"מ בעור הבטן העליונה החל מבסיס עצם החזה. בעזרת דיסקציה קהה, הפרד את העור משרירי הבטן. צרבו את כלי ההזנה הגדולים של העור והשרירים כדי למזער דימום במהלך השלבים הבאים (איור 4A).
  3. בצע חתך אופקי של ~1-2 ס"מ של העור ואחריו שריר הבטן, וחצה את החתך האנכי בשלב 5.2 בערך בחלק העליון של הכבד הנראה לעין; השתמשו בכלי צריבה כדי לסייע בהמוסטזיס של העור (איור 4B).
    הערה: גודל החתך בבטן הוא קריטי להדמיה אופטימלית של הכבד. אם הפתח קטן מדי, קיים סיכון לאיסכמיה בכבד עקב מתיחת יתר או פגיעה בעורק הכבד ו/או בווריד הפורטלי. אם הפתח גדול מדי, אז גם איברים אחרים, כמו המעיים, עלולים להיות מוחצנים ולהפריע להדמיה.
  4. חותכים עיגול בגודל של כ -1 ס"מ במרכז גזה בגודל 2 אינץ 'x 2 ומרטיבים אותו במי מלח רגילים חמים. מקם את הגזה כך שהפתח יהיה מרוכז מעל החתך. משכו בעדינות את שולי החתך זה מזה והפעילו לחץ קל כלפי מעלה על הבטן כדי להוציא את הכבד כך שהכבד יונח בקלות על גבי הגזה הלחה (איור 4C).
  5. הנח את העכבר על מגש ההדמיה במצב שכיבה, כשהכבד מרוכז מעל הכיסוי (איור 4D).
    הערה: בחיית ביקורת, הכבד אמור להיראות חום. מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר עם סורק ראש תהודה דו-כיווני משמש להפריה חוץ גופית בפרוטוקול זה. לכן, מדפסת תלת מימד שימשה ליצירת מגש IVM מותאם אישית (איור 5). קבצי ה-.stl שנוצרו להדפסת תלת מימד מסופקים (קובץ משלים 1); ייתכן שיהיה צורך בהתאמות כדי להתאים לצרכים של אנשים.
  6. העבירו את החיה למיקרוסקופ ההפוך.

6. הדמיית מיקרוסקופיה תוך-חיונית בכבד

הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר עם סורק ראש תהודה דו-כיווני למיקרוסקופיה תוך-חיונית. כדי לייצב את תדר ראש התהודה, הפעל את המערכת למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה. למערכות שונות עשויות להיות יכולות שונות. הדיון בהם הוא מחוץ לתחום מאמר זה. צור קשר עם נציגי הציוד לקבלת הפרטים הטכניים של מערכות ספציפיות.

  1. כדי לשמור על מישור הרדמה כירורגי, חבר את החיה למערכת אספקת האיזופלורן.
    הערה: בהתאם לפרוטוקול הניסוי, ייתכן שיהיה צורך בהנשמה מכנית (לעומת אוורור ספונטני).
  2. הניחו כרית חימום קורנת מעל החיה, בעזרת הגשושית הרקטלית כדי לשמור על טמפרטורת ליבה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: בפרוטוקול זה, פיסת קצף מלבנית המתאימה סביב מגש ה- IVM משמשת כמבודד וכמרווח שעליו ניתן להניח את כרית החימום הקורנת (איור 4D).
  3. הגדר את צריח המטרה להגדלה הרצויה, תוך מריחת שמן טבילה לפי הצורך. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש באובייקט שמן סיליקון 60x/NA1.30 עם זום אופטי פי 1.
  4. לאחר זיהוי מישור המוקד, זהה ≥10 שדות ראייה אקראיים, הימנע מהאזורים הסמוכים לקצוות הכבד.
    הערה: מכיוון שהכבד מפגין אוטופלואורסצנטיות בתעלת הפלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC), השתמש באפיפלואורסצנציה כדי לזהות במהירות את מישור המוקד הכללי.
    1. בהתאם למערכת, זהה את קצוות הכבד הנראה באמצעות אפיפלואורסצנציה בערוץ FITC ורשום את קואורדינטות השלב (x,y).
    2. השתמש בגבולות (x,y) של הכבד ובמחולל מספרים אקראיים כדי לזהות קואורדינטות אקראיות (x,y). לשדה ראייה מקובל, חפש (א) נוכחות של כלי שיט המפוזרים בכל שדה הראייה; (ב) ≥80% מכלי השיט באותו מישור מוקד; ו-(ג) ≥1 שדה ראייה הרחק מקצוות כבד כלשהם (דוגמה באיור 6). אם המוקד של ניתוח התמונה הוא באינטראקציות טסיות-לויקוציטים-אנדותל בסינוסואידים בכבד, אל תכלול שדות עם כלים שקוטרם ≥15 מיקרומטר (סינוסואידים עכבריים הם בדרך כלל בקוטר של ≤10 מיקרומטר).

7. ניתוח תמונות

הערה: ImageJ/FIJI שימש לעיבוד כל התמונות במאמר זה. פיג'י (fiji.sc) היא גרסת קוד פתוח של Image J (imagej.nih.gov) שיש לה פונקציונליות רבה יותר באמצעות שימוש בתוספים ופקודות מאקרו נוספות13.

  1. פתח את הקבצים הרב-ערוציים עם קיטועי זמן ב-ImageJ/FIJI.
    הערה: בהתאם לפלטפורמה, ייתכן שיידרשו תוכניות/תוספים נוספים. ל-ImageJ/FIJI יש מייבא פורמטים ביולוגיים שיכול לפתוח מספר סוגים שונים של קבצים, כגון קבצי .oir של אולימפוס. כאן, הקבצים הומרו ל-.tif מכיוון שמדובר בפורמט נפוץ יותר.
  2. ודא שהסולם הנכון מוגדר; חפש את יחס הפיקסל/מיקרומטר ואת מרווח הזמן במטא נתונים/מאפיינים.
  3. השתמש במסננים שונים כדי להסיר רעשי רקע (למשל, מסנן חציוני ברדיוס של 2 פיקסלים המשמש בפרוטוקול זה). ודא שהעיבוד דומה בין כל התמונות כדי למזער את השונות לאחר העיבוד. כאשר משווים את הספירה והאורכים בניסויים אלה, במקום עוצמת הקרינה הממוצעת, מסננים כדי לשפר את הבהירות ואת הזיהוי והמדידה של אינטראקציות תא-תא.
    הערה: השימוש והגודל של המסננים יהיו תלויים בגודל המטרה/ים המעניינים וביחס האות לרעש בתמונות.
  4. מכיוון שיש הטרוגניות בין שדות הראייה בצפיפות כלי הדם, מדוד את שטח כלי הדם הכולל בכל שדה באמצעות מברשת הבחירה (איור 7).
    1. לחצו לחיצה ימנית על כלי הבחירה הסגלגלה ובחרו בכלי מברשת הבחירה .
    2. התאימו את גודל המברשת בלחיצה כפולה על סמל הכלי מברשת הבחירה .
    3. עקבו אחר הכלים כדי להדגיש/לבחור אותם. למחיקת חלקים מהבחירה, השתמש בלחיצה שמאלית [alt] והוסף חלקים באמצעות [shift] ולחיצה שמאלית.
    4. לחץ על [M] כדי למדוד את האזור שנבחר.
      הערה: אם קנה המידה של התמונה הוגדר כהלכה, הפלט צריך להיות במיקרומטר2, אשר מומר למ"מ2.
  5. ספרו את מספר הטסיות והלויקוציטים בשדה. קחו בחשבון תאים כתאים דבוקים אם הם נעו < גוף תא אחד במשך 30 שניות. חשב את מספר התאים (טסיות ו/או לויקוציטים) למ"מ2.
  6. כדי להעריך את זרימת הדם היחסית בתוך כל כלי, מדוד את המהירות הממוצעת של כדוריות הדם האדומות (RBC) כתחליף באמצעות התוסף MTrackJ ב-ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)14, כפי שתואר קודם לכן5. זהה RBCs כפגמי מילוי עגולים או בצורת דיסק בתעלת הדקסטרן. שמור את הרצועות לשמירת רשומות, ניתוח אסינכרוני ואימות.
    הערה: דוגמה לכך מוצגת באיור 8 ובסרטון משלים S1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכת ההשפעה של תחום מוט וימנטין בהידבקות לויקוציטים לאנדותל דלקתי
לויקוציטים P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) הקשורים לאנדותל וטסיות P-סלקטין מתרחשים בשלב החריף של דלקת פגיעה בכבד הנגרמת על ידי אלח דם. עם זאת, הוכח כי תחום המוט האנושי הרקומביננטי של וימנטין (rhRod) נקשר ל-P-סלקטין וחוסם הידבקות לויקוציטים הן לאנדותל והן לטסיות הדם. פרוטוקול זה שימש במודל עכבר של אלח דם כדי לדמיין את ההשפעה בזמן אמת של rhRod על הידבקות לויקוציטים תלויה ב-PSGL-1 בכבד. נמצא כי rhRod מתמקם יחד עם P-סלקטין בסינוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מטרת מאמר שיטות זה היא לתאר את הצעדים הדרושים כדי ללכוד באופן אמין תמונות וסרטונים תוך-חיוניים ברזולוציה גבוהה של כבד העכבר בתנאים הומאוסטטיים ולאחר מתן אנדוטוקסין או APAP. בעוד שפרוטוקול זה איפשר ייצור עקבי של נתונים על אינטראקציות טסיות דם-לויקוציטים-אנדותל בכבד, ישנם מספר שלבים קריטיים הנדרשים להצלחה, כמו גם מלכודות פוטנציאליות שחשוב להימנע מהן בעת שימוש בפרדיגמת הדמיה זו. הצלחה בשימוש בפרוטוקול זה דורשת תכנון יסודי ומקיף במהלך בחירת הנוגדנים כדי למנוע הפרעה לתפקוד התא/חלבון, טכניקה כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד. התוכן אינו מייצג את העמדות של המחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב או של ממשלת ארצות הברית.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) ו-NIH/NHLBI HL139425 (JC). התמיכה במחקר מומנה גם על ידי NIH/NHLBI HL116524.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>אספקה כירורגית
2 אינץ' x 2 אינץ' ספוגים לא ארוגיםMcKesson Med. Surg92242000לבידוד כבד
#4-0 תפר קלוע משי עם מחטSOFSILKN/A4-0 מצופה משי רך קלוע שחור, לא נספג: מחט חיתוך C-1
#4-0 תפר קלוע משי ללא מחטEthiconN / A4-0 משי קלוע שחור, לא נספג
21 גרם מחט קהה (0.5 אינץ')SAI Infusion TechnologiesB21-50זה משמש לחיבור לקצה צינור הטרכאוסטומיה כדי לאפשר חיבור למכונת ההנשמה. מקור חלופי הוא מחט
קהה של Instech 23 G (0.5 אינץ')SAI Infusion TechnologiesB23-50זה משמש לצנתר כלי הדם כדי לאפשר חיבור למזרק. מקור חלופי הוא מספריים
מנתחים של Instech (קצה מחודד)Kent ScientificINS600393-Gמספריים מיקרו ניתוח; להבי קרביד; ישר; נקודות חדות; אורך להב 24 מ"מ; 4 1/2 אינץ' אורך כולל
מספריים מיקרו McPherson-Vannas (Vannas)Kent ScientificINS600124אלה שימושיים ליצירת הפתחים בקנה הנשימה ובכלי
פוליאתילן 10InstechBTPE-10זה משמש לייצור החלק התוך-וסקולרי של הצנתר. מקור חלופי הוא
צינורות פוליאתילןInstechBTPE-50זה משמש לייצור החלק החוץ-וסקולרי של הצנתר.  מקור חלופי הוא
צינורות פוליאתילןInstechBTPE-90זה משמש לייצור צינור הטרכאוסטומי. מקור חלופי הוא BD Intramedic
USP סטרילי תמיסת מלח רגילהCoviden8881570121Hospira 0.0% הזרקת נתרן כלורי
USPMicroscopy Supplies
Isoflurane מערכת הנשמה ומכונת הנשמהKent ScientificSomnosuiteCombination מאוורר מכרסמים ומערכת
אספקת הרדמה נדיפהמרווח קצף לחימום כרית במהלך מיקרוסקופיהN/AN/Aיש לחתוך מרווח זה מקצף באיכות גבוהה, צריך להתאים סביב מגש מיקרוסקופ הכבד ומידות הגובה הספציפיות תלויות במערכת המיקרוסקופ
מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר עם סורק ראש תהודהאולימפוסFV3000למרות שאנו מתארים את השימוש באולימפוס FV3000 באמצעות סורק ראש תהודה, פרוטוקול זה עובד עם רוב מערכות ההדמיה
מגש מיקרוסקופ כבדN/AN/Aמגש מיקרוסקופ הכבד תוכנן למיקרוסקופ הפוך
<חזק>נוגדנים & ריאגנטים קשורים
סגול מבריק 421/נוגדן Ly6G נגד עכברBioLegend1276283 ומיקרו; גרם/עכבר. כדי לסמן נויטרופילים
BV421/F4/80 נוגדןBioLegend1231320.75 מ"ג/ק"ג. כדי לתייג תאי קופפר
תמיסת מלח חוצצת פוספט של דולבקו ללא סידן או מגנזיוםGibco/ThermoFisher Scientific14190144משמש כדיאליזה להסרת נתרן אזיד מנוגדנים
DyLight649/anti-GPIbβ נוגדןemfret AnalyticsX6493 µ גרם/עכבר. כדי לתייג טסיות דם
DyLight488/anti-mouse GPIbβ נוגדניםemfret AnalyticsX4886 µ גרם/עכבר. לסמן טסיות
דם אנדוטוקסין מEscherichia coli serotype O111:B4Sigma-AldrichL30245 מ"ג/ק"ג; עוצמת האנדוטוקסין עשויה להשתנות מאצווה לאצווה. לכן, יש להשתמש באותה מנה לסדרת ניסויים כדי למזער את השונות עקב מנת אנדוטוקסין
PerCP-eFluor 710/נוגדן P-selectin נגד עכברInvitrogen46-0626-824 µ גרם/עכבר. כדי לתייג קלטת P-selectin
Slide-a-Lyzer 7,000 MWCOThermo Scientific66370המשמשת לדיאליזה של נוגדנים להסרת נתרן אזיד
טקסס דקסטרןT1287150 kDa; 250 ומיקרו; g / עכבר
TRITC / אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA2289500 ומיקרו; גרם/עכבר. יש לדלל לריכוז מלאי של 50 מ"ג/מ"ל (5%) במי מלח רגילים. משמש לתיוג כלי הדם. הוא עלול לדלוף לחלל הבין-תאי ביתר קלות מאשר דקסטרן במשקל מולקולרי גבוה במהלך דלקת
צינורות BD Intramedic 50 BD Intramedic 90 , סיגמא-אולדריץ' ~

מקורות

  1. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, Suppl 1 19-23 (2005).
  2. Nolan, J. P. The role of intestinal endotoxin in liver injury: A long and evolving history. Hepatology. 52 (5), 1829-1835 (2010).
  3. Miyakawa, K., et al. Platelets and protease-activated receptor-4 contribute to acetaminophen-induced liver injury in mice. Blood. 126 (15), 1835-1843 (2015).
  4. Da, Q., Derry, P. J., Lam, F. W., Rumbaut, R. E. Fluorescent labeling of endogenous platelets for intravital microscopy: Effects on platelet function. Microcirculation. 25 (6), 12457(2018).
  5. Lam, F. W., et al. The vimentin rod domain blocks P-selectin-P-selectin glycoprotein ligand 1 interactions to attenuate leukocyte adhesion to inflamed endothelium. PLoS One. 15 (10), 0240164(2020).
  6. Shan, Z., et al. Chitinase 3-like-1 contributes to acetaminophen-induced liver injury by promoting hepatic platelet recruitment. eLife. 10, 68571(2021).
  7. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (1), 64-70 (2008).
  8. Pollenus, E., et al. Limitations of neutrophil depletion by anti-Ly6G antibodies in two heterogenic immunological models. Immunology Letters. 212, 30-36 (2019).
  9. Wang, J. X., et al. Ly6G ligation blocks recruitment of neutrophils via a β2-integrin-dependent mechanism. Blood. 120 (7), 1489-1498 (2012).
  10. Cunin, P., et al. Differential attenuation of β2 integrin-dependent and -independent neutrophil migration by Ly6G ligation. Blood Advances. 3 (3), 256-267 (2019).
  11. Weary, M. E., Donohue, G., Pearson, F. C., Story, K. Relative potencies of four reference endotoxin standards as measured by the Limulus amoebocyte lysate and USP rabbit pyrogen tests. Applied and Environmental Microbiology. 40 (6), 1148-1151 (1980).
  12. Kiers, D., et al. Comparison of different lots of endotoxin and evaluation of in vivo potency over time in the experimental human endotoxemia model. Innate Immunity. 25 (1), 34-45 (2019).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  15. Sierro, F., et al. A liver capsular network of monocyte-derived macrophages restricts hepatic dissemination of intraperitoneal bacteria by neutrophil recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  16. Guidotti, L. G., et al. Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8+ T cells. Cell. 161 (3), 486-500 (2015).
  17. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Frontiers in Immunology. 10, 2988(2020).
  18. Reif, R., et al. In vivo imaging of systemic transport and elimination of xenobiotics and endogenous molecules in mice. Archives of Toxicology. 91 (3), 1335-1352 (2017).
  19. Sloboda, D. D., Brooks, S. V. Treatment with selectin blocking antibodies after lengthening contractions of mouse muscle blunts neutrophil accumulation but does not reduce damage. Physiological Reports. 4 (1), 12667(2016).
  20. Lam, F. W., Da, Q., Guillory, B., Cruz, M. A. Recombinant human vimentin binds to P-selectin and blocks neutrophil capture and rolling on platelets and endothelium. Journal of Immunology. 200 (5), 1718-1726 (2018).
  21. Mossanen, J. C., Tacke, F. Acetaminophen-induced acute liver injury in mice. Laboratory Animals. 49, 30-36 (2015).
  22. Guerrero Munoz, F., Fearon, Z. Sex related differences in acetaminophen toxicity in the mouse. Journal of Toxicology. Clinical Toxicology. 22 (2), 149-156 (1984).
  23. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. European Journal of Histochemistry. 65 (4), 3337(2021).
  24. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
  25. Jost, A. P., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים