Escherichia coli גורם אלח דם בילודים אשר בולעים את החיידקים סביב זמן הלידה. התהליך הכרוך ביכולתו של E. coli לנוע מהמערכת האנטרית לזרם הדם אינו מובן היטב. מודל זה במבחנה מעריך את יכולתם של זני E. coli לנוע דרך תאי אפיתל המעי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה של טרנסציטוזה מעיים של חיידקי חיידקי חיידקי Escherichia coli ילודים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תינוקות בולעים זני E. coli אימהיים המאכלסים את מערכת העיכול שלהם סביב זמן הלידה. זני E. coli בעלי יכולת טרנסלוקציה על פני המעיים פולשים לזרם הדם של היילוד, וגורמים לחיידקים מסכני חיים. המתודולוגיה המוצגת כאן משתמשת בתאי אפיתל מעיים מקוטבים הגדלים על תוספות חצי-חדירות כדי להעריך את הטרנסציטוזה של חיידק E. coli מבודד במבחנה. שיטה זו משתמשת בקו תאי המעי T84 שהוקם שיש לו את היכולת לגדול למפגש וליצור צמתים הדוקים ודמוזומים. לאחר ההגעה למפגש, מונו-שכבות T84 בוגרות מפתחות התנגדות טרנס-אפיתליאלית (TEER), אותה ניתן לכמת באמצעות מד מתח. ערכי TEER נמצאים בקורלציה הפוכה עם החדירות העל-תאית של רכיבים חוץ-תאיים, כולל חיידקים, על-פני שכבת המעיים. המעבר הטרנס-תאי של חיידקים (טרנסציטוזה), לעומת זאת, אינו משנה בהכרח את מדידות ה- TEER. במודל זה, מעבר חיידקים על פני מונולאייר המעי מכמת עד 6 שעות לאחר ההדבקה, ומדידות חוזרות ונשנות של TEER נעשות כדי לנטר את החדירות הפרה-תאית. בנוסף, שיטה זו מקלה על השימוש בטכניקות כגון immunostaining כדי לחקור את השינויים המבניים בצמתים הדוקים וחלבוני הידבקות אחרים מתא לתא במהלך טרנסציטוזה חיידקית על פני אפיתל מקוטב. השימוש במודל זה תורם לאפיון המנגנונים שבאמצעותם E. coli transcytose ילודים על פני אפיתל המעי לייצר חיידקים.
מבוא
Escherichia coli הוא הגורם השכיח ביותר של אלח דם מוקדם בתינוקות 1,2,3. שיעור התמותה של חיידק E. coli ילודים יכול להגיע ל -40%, ודלקת קרום המוח היא סיבוך אפשרי הקשור לנכויות נוירו-התפתחותיות חמורות2. בליעה של זני E. coli אימהיים על ידי התינוק יכולה לייצר חיידק ילודים; תהליך זה שוכפל במודלים של בעלי חיים 2,4. לאחר בליעתם, חיידקים פתוגניים עוברים מלומן המעי היילודים על פני מחסום המעי ונכנסים לזרם הדם, מה שגורם לספטיצמיה. זני E. coli פולשניים המייצרים חיידקים שונ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: בצע את כל המניפולציות של תאי T84, חיידקים, צלחות וריאגנטים בארון בטיחות Biosafety רמה 2 (BSL-2) כדי למנוע זיהום. השתמש באזורים נפרדים ובאינקובטורים לכל העבודה הכוללת תאי T84 סטריליים, תאי T84 נגועים ו- E. coli. מבודדי E. coli הקליניים שנבדקו בשיטות המתוארות כאן התקבלו בהתאם להנחיות מועצת הביקורת המוסדית במוסד שלנו 1,16.
1. הכנת תוספות טרנסציטוזה עם תאי T84 (כשבוע-שבועיים לפני הניסוי)
- גידול אוסף תרביות מסוג אמריקאי (ATCC) תאי T84 במדיום תרבית רקמה (TCM + אנטיביוטיקה) המורכב מתערובת החומרים המזינים F-12 של דולבקו: תערובת החומרים המזינ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1: T84 TEER לאורך זמן. ככל ששכבת התא T84 מתבגרת על התוספת, ההתנגדות החשמלית של המונולאייר גדלה. ב-TEER של לפחות 1,000 Ω·ס"מ2, שכבת התא מפותחת מספיק כדי להקטין את הובלת החיידקים העל-תאיים ולאפשר מדידה של מעבר חיידקים טרנס-תאיים בעיקר. קווי השגיאה מציינים את סטיית התקן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטה זו נגזרת מטכניקות המשמשות בגסטרואנטרולוגיה ומחלות זיהומיות20. מודלים במבחנה של מחסום אפיתל המעי שימשו כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם התוכן הזוהר אינטראקציה עם מרכיב רלוונטי זה של חסינות מולדת 6,8. האינטראקציות בין המארח לפתוגן של E. coli ילודים פולשניים אופיינו בנפרד גם באמצעות ניתוח גנטי, מחקרים על עמידות מיקרוביאלית וטכניקות אימונולוגיות 1,5,16,21.<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סטודנטים של שרה מוריסון שהונפק על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מיזורי-קנזס סיטי ל- A.I.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10,000 U / מ"ל תערובת פניצילין/סטרפטומיצין | פישר סיינטיפיק | 15-140-122 | |
| 15 מ"ל צינורות חרוטיים סטריליים | MidSci | C15B | |
| 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | Avant | AVSS2000 | |
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילן סטריליים | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| ארונות בטיחות ביולוגית | Labconco | 30441010028343 | שלושה כאלה משמשים בשיטה: אחד לעבודת רקמות סטריליות, אחד לעבודת רקמות נגועות ואחד לעבודה חיידקית. |
| צנטריפוגה | Sorvall | Legend RT | |
| לולאות חיסון חד פעמיות | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| וולט/אוהם מטר | מכשירי דיוק עולמיים | EVOM2 | |
| סרום בקר עוברי | פישר 10437028 | ||
| מדעיתערובת התזונה F-12 של האם | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator Shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | שלושה כאלה משמשים בשיטה: אחד לתרבית רקמות סטריליות, אחד לתרבית רקמות נגועות ואחד לדגירת חיידקים. |
| מרק ליזוגני | Difco | 244610 | |
| מרק ליזוגני אגר | IBI Scientific | IB49101 | |
| ניקון ליקוי חמה TS2R מיקרוסקופ | ניקון | ||
| ספקטרופוטומטר | יוניקו | 1100RS | |
| T84 תאי מעיים | אוסף תרביות רקמות אמריקאיות | CCL248 | |
| מוסיף תרבית רקמה, עם קרום פוליאתילן טרפתלט, 3 ומיקרו; נקבוביות m, 24 בארות | פורמט Falcon | 353096 | |
| צלחת תרבית רקמות, 24 בארות | Falcon | 353504 | |
| Trypan כתם כחול | Fisher Scientific | T10282 |
מקורות
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
