מאמר שיטה

אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן

DOI:

10.3791/64242

⸱

30 ביוני 2022

 ,  ,  ,  , 
1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq היא שיטת ריצוף DNA המשתמשת בטרנספוזאז מוטנטי היפראקטיבי, Tn5, כדי למפות שינויים בנגישות הכרומטין המתווכים על ידי גורמי שעתוק. ATAC-seq מאפשר לגלות את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס שינויים פנוטיפיים בתאים סרטניים. פרוטוקול זה מתווה הליכי אופטימיזציה עבור ATAC-seq בסוגי תאי אפיתל, כולל תאים סרטניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) בודקת נגישות של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) באמצעות טרנספוזאז Tn5 היפראקטיבי. Tn5 חותך ומתיר מתאמי לריצוף בתפוקה גבוהה באזורי כרומטין נגישים. בתאים אאוקריוטים, הדנ"א הגנומי נארז בכרומטין, קומפלקס של דנ"א, היסטונים וחלבונים אחרים, המשמש כמחסום פיזי למנגנון השעתוק. בתגובה לאותות חיצוניים, גורמי שעתוק מגייסים קומפלקסים לעיצוב מחדש של כרומטין כדי לאפשר גישה למנגנוני השעתוק להפעלת גנים. לכן, זיהוי אזורי כרומטין פתוחים שימושי בעת ניטור פעילויות משפר ומקדם גנים במהלך אירועים ביולוגיים כגון התקדמות הסרטן. מכיוון שפרוטוקול זה קל לשימוש ויש לו דרישת קלט תאים נמוכה, ATAC-seq אומץ באופן נרחב כדי להגדיר אזורי כרומטין פתוחים בסוגי תאים שונים, כולל תאים סרטניים. לרכישת נתונים מוצלחת, יש לקחת בחשבון מספר פרמטרים בעת הכנת ספריות ATAC-seq. ביניהם, הבחירה של חיץ תזה תאים, טיטרציה של אנזים Tn5, ואת נפח ההתחלה של תאים חיוניים להכנת ספריית ATAC-seq בתאים סרטניים. אופטימיזציה חיונית ליצירת נתונים באיכות גבוהה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של שיטות האופטימיזציה של ATAC-seq עבור סוגי תאי אפיתל.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגישות כרומטין היא דרישת מפתח לוויסות ביטוי גנים בקנה מידה גנומירחב 1. שינויים בנגישות הכרומטין קשורים לעתים קרובות למספר מצבי מחלה, כולל סרטן 2,3,4. במהלך השנים פותחו טכניקות רבות המאפשרות לחוקרים לחקור את נוף הכרומטין על ידי מיפוי אזורים של נגישות כרומטין. חלקם כוללים את DNase-seq (ריצוף אתרים רגישים ל-DNase I)5, FAIRE-seq (בידוד בסיוע פורמלדהיד של אלמנטים רגולטוריים)6, MAPit (פרוטוקול נגישות מתיל-טרנספראז לתבניות בודדות)7, והמוקד של מאמר זה, ATAC-seq (בדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז)8. DNase-seq ממפה אזורים נגישים על ידי שימוש בתכונה מרכזית של DNase, כלומר עיכול מועדף של דנ"א עירום ללא היסטונים וחלבונים אחרים כגון גורמי שעתוק5. FAIRE-seq, בדומה ל-ChIP-seq, משתמש בהצלבת פורמלדהיד ובסוניקציה, למעט העובדה שאין צורך במיצוי חיסוני, והאזורים נטולי הנוקלאוזומים מבודדים על ידי מיצוי פנול-כלורופורם6. שיטת MAPit משתמשת במתיל-טרנספראז GC כדי לחקור את מבנה הכרומטין ברזולוציה של מולקולה בודדת7. ATAC-seq מסתמך על הטרנספוזאז ההיפראקטיבי, Tn58. הטרנספוזאז Tn5 נקשר באופן מועדף לאזורי כרומטין פתוחים ומכניס מתאמי ריצוף לאזורים נגישים. Tn5 פועל באמצעות מנגנון "גזור והדבק" בתיווך DNA, לפיו הטרנספוזאז הטעון מראש במתאמים נקשר לאתרי כרומטין פתוחים, חותך דנ"א ומקפיץ את המתאמים8. אזורים מאוגדים Tn5 משוחזרים על ידי הגברת PCR באמצעות פריימרים המתאימים למתאמים אלה. FAIRE-seq ו- DNase-seq דורשים כמות גדולה של חומר מוצא (~ 100,000 תאים עד 225,000 תאים) ושלב הכנה נפרד של הספרייה לפני ריצוף9. מצד שני, פרוטוקול ATAC-seq הוא פשוט יחסית ודורש מספר קטן של תאים (<50,000 תאים)10. שלא כמו טכניקות FAIRE-seq ו- DNase-seq, הכנת ספריית הריצוף של ATAC-seq קלה יחסית, מכיוון שדגימת ה- DNA המבודדת כבר מתויגת עם מתאמי הריצוף על ידי Tn5. לכן, יש צורך רק בשלב ההגברה של ה-PCR עם פריימרים מתאימים כדי להשלים את הכנת הספרייה, ואין צורך לבצע את שלבי העיבוד הקודמים כגון תיקון קצה וקשירת מתאם, ובכך לחסוך זמן11. שנית, ATAC-seq מונע את הצורך בהמרה, שיבוט והגברה של ביסולפיטים עם פריימרים ספציפיים לאזור הנדרשים עבור MAPit7. בשל יתרונות אלה, ATAC-seq הפך לשיטה פופולרית מאוד להגדרת אזורי כרומטין פתוחים. למרות ששיטת ATAC-seq פשוטה, שלבים מרובים דורשים אופטימיזציה כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה וניתנים לשחזור. כתב יד זה דן בהליכי אופטימיזציה להכנת ספריית ATAC-seq סטנדרטית, במיוחד תוך הדגשת שלושה פרמטרים: (1) הרכב חיץ תזה, (2) ריכוז טרנספוזאז Tn5, ו-(3) מספר תא. בנוסף, מאמר זה מספק נתונים לדוגמה מתנאי האופטימיזציה תוך שימוש הן בתאי אפיתל סרטניים והן בתאי אפיתל שאינם סרטניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנות לפני תחילת הניסוי

  1. הכינו מלאי מאגר תזה.
    הערה: מאגר הבידוד הגרעיני האופטימלי יכול להיות שונה עבור כל סוג תא. אנו ממליצים לבדוק הן את המאגר ההיפוטוני ששימש בניירהמקורי 8 והן את מאגרCSK 12,13 עבור כל סוג תא באמצעות צביעה כחולה טריפאן.
    1. כדי להכין חיץ היפוטוני (חיץ Greenleaf), יש לערבב 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, ו-0.1% NP-40.
    2. כדי להכין מאגר CSK, יש לערבב 10 mM PIPES pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM סוכרוז, 3 mM MgCl2, ו 0.1% Triton X-100.
  2. ודא שתנאי תרבית התאים הם אופטימליים; לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שאין רמות גבוהות של אפופטוזיס.
  3. הפעל את הצנטריפוגה כדי לאפשר לה להגיע ל -4 מעלות צלזיוס.

2. קציר תאים

  1. שאפו מדיה מתרבית תאים במפגש של <80%. תאים גדלים בדרך כלל בצלחת של 35 מ"מ או 60 מ"מ, בהתבסס על מספר התאים הדרושים, טיפולים וכו '.
  2. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל או 3 מ"ל של PBS.
  3. מוסיפים 0.5 מ"ל או 1 מ"ל של טריפסין ודוגרים במשך 2-3 דקות (בהתאם לסוגי התאים). בזהירות להשתמש פיפטה 1 מ"ל לערבב היטב.
  4. מוסיפים 1 מ"ל או 2 מ"ל של מדיה לצלחת ומערבבים היטב. העברה לצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה של התאים בצינור 15 מ"ל במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
    הערה: מומלץ להשתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי למזער את אובדן התא.
  5. לשאוף את התקשורת ולהשעות את התאים ב 1 מ"ל או 2 מ"ל של בינוני.
    הערה: חיוני להכין תמיסה הומוגנית חד-תאית. עבור רקמות, ניתן להשתמש בהומוגנייזר של Dounce כדי ליצור הומוגניזציה של רקמות ולמזער גושים גדולים של תאים או אגרגטים. רקמות מסוימות דורשות סינון (למשל, מסננות תאים) ו/או מיון תאי FACS כדי לבודד תאים בני קיימא ולקבל פתרון של תא בודד.
  6. ספירת התאים באמצעות מונה תאים.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש במונה תאים אוטומטי (טבלת חומרים).
  7. צנטריפוגה של נפח התא הנדרש (למשל, נפח המכיל 1 x 106 תאים בהתבסס על ספירת תאים) ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  8. יש להשעות את כדור התא המכיל 1 x 106 תאים ב-1 מ"ל של PBS קר.
    הערה: אם מספרי התאים קטנים מ- 1 x 10 6 תאים, הקטן את נפח ה- PBS הקר כדי להכין את תמיסת התא באותו ריכוז (1 x 106 תאים / מ"ל).

3. תזה תאית

  1. העבר 25 μL (= 2.5 x 104 תאים ) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.7 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך בזהירות את supernatant
    הערה: מומלץ להשתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי למזער את אובדן התא. השאירו כ-3 מיקרוגרם של סופר-נטנט כדי להבטיח שהתאים לא יושלכו.
  2. הוסף 25 μL של חיץ ליזה והשהה את התאים על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. דגירה על קרח במשך 5 דקות
  3. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך בזהירות את supernatant.
    הערה: מומלץ להשתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי למזער את אובדן התא. השאירו כ-3 מיקרוגרם של סופר-נטנט כדי להבטיח שהתאים לא יושלכו.

4. תיוג Tn5

  1. מיד להחיות את הכדור ב 25 μL של תערובת תגובה Tn5. תערובת התגובה של Tn5 היא כדלקמן: 12.5 μL של 2x מאגר DNA תיוג (מאגר TD), 1.25-5 μL של טרנספוזאז Tn5, ו 11.25-7.5 μL של מים ללא נוקלאז.
    הערה: הריכוז הסטנדרטי של Tn5 הוא 2.5 μL עבור 2.5 x 104 תאים .
  2. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: ערבבו את התמיסה כל 10 דקות.

5. טיהור DNA

הערה: טיהור נדרש לפני הגברה. טיהור הדנ"א נעשה באמצעות ערכת הטיהור MinElute PCR (טבלת חומרים).

  1. יש להוסיף 5 μL של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2).
  2. הוסיפו מיד 125 μL של Buffer PB וערבבו היטב.
  3. עקוב אחר פרוטוקול ערכת הטיהור PCR החל משלב 2.
    1. מניחים את עמוד הספין בצינור איסוף של 2 מ"ל.
    2. החל את הדגימה על עמודת הסיבוב והצנטריפוגה למשך דקה אחת ב- 17,900 x g ב- RT.
    3. השליכו את הזרימה והנחו את עמודת הסיבוב בחזרה באותו צינור איסוף.
    4. הוסף 750 μL של Buffer PE לעמוד הספין ולצנטריפוגה למשך דקה אחת ב- 17,900 x g ב- RT.
    5. השליכו את הזרימה והנחו את עמודת הסיבוב בחזרה באותו צינור איסוף.
    6. צנטריפוגה עמוד ספין במשך 5 דקות כדי לייבש את הממברנה לחלוטין.
    7. השליכו את הזרימה והנחו את עמודת הספין בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.7 מ"ל.
    8. שדרגו את מקטעי הדנ"א עם 10 μL של Buffer EB.
    9. תן לעמודה לעמוד במשך דקה אחת ב- RT.
    10. צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-17,900 x גרם ב-RT כדי לחדד את הדנ"א.

6. הגברת PCR

הערה: הגברת PCR של DNAs שעברו חילוף (תיוג) נחוצה לריצוף. מתאמי ערכת Nextera (טבלת חומרים) שימשו בדוגמה זו. הפריימרים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1.

  1. הגדר את תגובת ה-PCR הבאה בצינורות PCR של 200 μL (50 μL עבור כל דגימה). תערובת תגובת ה- PCR היא כדלקמן: 10 μL של DNA eluted (שלב 5.), 2.5 μL של 25 mM מתאם 1, 2.5 μL של 25 mM מתאם 2, 25 μL של 2x PCR תערובת מאסטר, ו 10 μL של מים ללא נוקלאז
  2. ביצוע תוכנית הגברה PCR חלק 1 (טבלה 2).
    הערה: עבור הגברה ראשונית, אותם תנאים משמשים עבור כל הדגימות באמצעות מחזור תרמי סטנדרטי.
  3. qPCR בזמן אמת (סה"כ 14.5 μL לדגימה)
    1. באמצעות 5 μL של המוצר מהגברת PCR חלק 1 (שלב 6.2.), הגדר את התגובה הבאה, הפעם כולל זהב SYBR וזיהוי במכונת PCR בזמן אמת.
    2. הכן את תערובת תגובת ה- PCR באופן הבא: 5 μL של מוצר PCR משלב 6.2., 0.75 μL של זהב SYBR (1000x מדולל), 5 μL של 2x PCR תערובת מאסטר, ו 3.75 μL של מים ללא נוקלאזות.
      הערה: מספרי המחזור המדויקים להגברת ספרייה לפני הגעה לרוויה עבור כל דגימה נקבעים על-ידי qPCR (טבלה 3) כדי להפחית את הטיית ה-GC והגודל ב-PCR10. SYBR Gold היה מדולל במים נטולי נוקלאז. כדי לייצר את התמיסה המדוללת, 1 μL של זהב SYBR (ריכוז מלאי 10,000x) נוספה 999 μL של מים ללא נוקלאזות. זמן הריצה של RT-qPCR המוזכר בטבלה 3 הוא כ-60 דקות.
  4. קבע את המספר הנדרש של מחזורי PCR נוספים באמצעות פרמטרי ההפעלה משלב 6.3.
    1. מספר מחזורים = 1/4 עוצמת פלואורסצנטיות מרבית (רוויה) (בדרך כלל 3 או 4 מחזורי PCR)
  5. תוכנית הגברה PCR חלק 2 (נפח = 45 μL; טבלה 4): לאחר שתקבע את מספר המחזור, הגדר PCR עם מחזורים נוספים המחושבים בשלב 6.4.1. לדוגמה, אם מספר המחזור המחושב הוא 3, הגדר 3 מחזורים בתוכנית שלהלן. סך המחזורים יהיה 8 (5 בשלב 6.2., ועוד 3 מחזורים נוספים בשלב 6.5.)

7. טיהור חרוזים

הערה: כאן, נעשה שימוש בחרוזי AMPure XP (טבלת חומרים).

  1. למוצרי ה-PCR שהוגברו בשלב הקודם, הוסיפו 150 מיקרון ליטר של חרוזים ב-RT.
    הערה: ניתן להשתמש בחרוזי AMPure תוצרת בית14 בתהליך זה.
  2. דגירה במשך 15 דקות ב- RT.
  3. הניחו את הצינורות על מעמד מגנטי למשך 5 דקות.
  4. הסר בזהירות את הסופרנטנט.
  5. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 80% אתנול.
    הערה: 80% אתנול צריך להיות מוכן טרי.
  6. חזור על שלב 7.4.
  7. הסר את האתנול לחלוטין.
  8. ייבשו את הדגימות באוויר למשך 10 דקות ב-RT.
  9. יש לחדש עם 50 μL של חיץ אלוציה (10 mM Tris-HCL pH 8.0).
  10. חזור על טיהור החרוזים (שלבים 7.1.-7.9.) כדי למזער עוד יותר את זיהום הפריימר.

8. ריכוז DNA ובדיקת איכות

  1. מדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ערכת כימות חומצות גרעין (טבלת חומרים).
  2. בדוק את מקטעי הדנ"א המוגברים על ידי אלקטרופורזה בג'ל באמצעות SYBR Gold (0.5x TBE, 1.5% ג'ל אגרוז) או מערכת אלקטרופורזה אוטומטית (למשל, TapeStation, bioanalyzer).

9. רצף

  1. בצע ריצוף בתפוקה גבוהה באמצעות דגימות הדנ"א המוגברות12,13.
    הערה: דגימות דנ"א מוגברות מוכנות לריצוף בתפוקה גבוהה. כדי לשמור על מידע על מקטעי דנ"א נוקלאוזומליים, מומלץ לבצע ריצוף קצה מזווג על פני ריצוף חד-צדדי. שני הקצוות של מקטעי הדנ"א מציינים היכן נקשר הטרנספוזאז. למיפוי אזורי כרומטין פתוחים, 30 מיליון קריאות/דגימות מספיקות בדרך כלל.

10. ניתוח נתונים

  1. סינון נתונים המבוסס על איכות השיחה הבסיסית: הגדר את ציון האיכות הבסיסי הממוצע המינימלי ל-20 (דיוק של 99%).
  2. חיתוך מתאם: הסר את רצפי המתאמים באמצעות כלי מתאים.
    הערה: כלי עטיפת Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) שימש להסרת רצפי מתאמים. עבור ספריות ATAC-seq שהוכנו על ידי Illumina Tn5, הרצף הבא משמש כרצף מתאם: CTGTCTTATACACATCT. אורך הרצף המינימלי לזיהוי זיהום מתאם מוגדר ל- 5.
  3. מיפוי גנום: מפה את הקריאות לגנום המתאים עם Bowtie באמצעות הפרמטרים הבאים "-I 0 -X 2000 -m 1"15. להלן דוגמה למיפוי איכות מתאי סרטן שד בסיסיים מסוג MDA-MB-231:
    קורא עם לפחות יישור מדווח אחד: 52.79%
    קריאות שלא התיישרו: 13.10%
    קריאות עם יישורים שהודחקו עקב -m: 34.11%
  4. מניעת כפילויות: סמן את כפילויות ה-PCR על-ידי כלי פיקארד16.
  5. יצירת קובץ כיסוי גנומי להדמיית נתונים: המר את הקריאות הזוגיות ללא כפילויות למקטעי קריאה חד-צדדיים. מסלולי כיסוי גנום מתקבלים באמצעות genomeCoverageBed מ- bedtools17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להשיג נתוני ATAC-seq מוצלחים ואיכותיים, חשוב לייעל את תנאי הניסוי. ניתן להפריד את הכנת ספריית ATAC-seq לחמשת השלבים העיקריים (איור 1), כלומר תזה של תאים, תיוג (פיצול והכנסת מתאם על ידי Tn5), טיהור DNA גנומי, הגברה של PCR וניתוח נתונים. כתהליך ראשוני, יש למטב תחילה את מאגר התזה (בידוד גרעיני) עבור כל סוג תא. החיץ ההיפוטוני שתואר במאמר ATAC-seqהמקורי 8 או חיץCSK 12,13 שימש לליטוף תאי סרטן השד. ניתן להשתמש בכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq נמצא בשימוש נרחב למיפוי אזורי כרומטין פתוחים ופעילים. התקדמות התאים הסרטניים מונעת לעתים קרובות על ידי שינויים גנטיים ותכנות מחדש אפיגנטי, וכתוצאה מכך משתנה נגישות הכרומטין וביטוי הגנים. דוגמה לתכנות מחדש זה נראית במהלך המעבר האפיתל למזנכימלי (EMT) והתהליך ההפוך שלו, מעבר מזנכימלי לאפיתליאלי (MET), הידועים כתהליכי תכנות מחדש תאיים מרכזיים במהלך גרורות גידול30. דוגמה נוספת היא רכישת עמידות לתרופות נגד טיפולים הורמונליים נצפית לעתים קרובות בגידולי שד לומינליים31. ATA...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כספיים רלוונטיים או מהותיים המתייחסים למחקר המתואר במאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למתקן הליבה הגנומית של UND על הסיוע הטכני יוצא הדופן.

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [P20GM104360 עד M.T., P20 GM104360 עד A.D.] וקרנות סטארט-אפ שסופקו על ידי בית הספר לרפואה ומדעי הבריאות של אוניברסיטת צפון דקוטה, המחלקה למדעים ביו-רפואיים [ל- M.T.].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לארה"ב מדעי1615-5500טבעי
10 ומיקרו; טיפים L XL TipOneUSA Scientific1120-3810מסוננים ושימור נמוך
100 ומיקרו; טיפים L XL TipOne RPTארה"ב סיינטיפיק1182-1830מסוננים ושימור נמוך
100 ומיקרו; טיפים L XL TipOneUSA Scientific1120-1840מסונן ושימור נמוך.
צינורות צנטריפוגה חרוטיים משופעים בדרגה 15 מ"לקורנינג352096
20 ומיקרו; טיפים L TipOne RPTארה"ב סיינטיפיק1183-1810מסוננים ושימור נמוך
200 ומיקרו; טיפים L TipOne RPTארה"ב סיינטיפיק1180-8810מסוננים ובעלי שימור נמוך
50 מ"לפישרברנד06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010 Genetic Analysis Grade
כל קווי התאים המשמשים במחקר זה מתקבלים מ- ATCCATCC
Allegra X-30R צנטריפוגהבקמן קולטר364658SX2415
AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63881ערכת טיהור חרוזים
CellDrop מונה תאיםDeNovixCellDrop FLמונה תאים
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, נטול מים, ≥ 99% (טיטרציה)
EGTAMilliporeSigmaE3889
אתנול 100%ThermoFisher ScientificAC615100020נטול מים; פישר סיינטיפיק - Decon Labs מוצרי עיקור
סרום בקר עוברי - מו"פ נבדק TET D SystemsS10350טריפל 0.1 ומיקרו; m מסונן
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז; [+] ל-גלוטמין; [-] נתרן פירובט
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25%), פנול אדום
גליצרולIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute ערכת טיהור PCRQiagen28004ערכת טיהור DNA
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥ 98% (חומצי), כדורים (נטולי מים)
NEBNext נאמנות גבוהה 2x PCR Master Mixניו אינגלנד BiolabsM0541
Nextera ערכת הכנת דגימות DNAIlluminaFC-121-10302x TD ו-Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896לביולוגיה מולקולרית
מערכת זיהוי PCRBioRad1855484מערכת CFX384 בזמן אמת. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance מוסמך, מתאים לתרבית תאים
Qubit dsDNA HS ערכת בדיקהThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; ערכת כימות חומצות גרעין
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
נתרןאצטט תוצרתבית-pH5.2
סוכרוזIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR ירוק Supermix, 1.25 מ"לBioRad1708882
T100 ThermalCycler BioRad1861096
TempAssure 0.2 מ"ל PCR 8 צינורות רצועותUSA Scientific1402-4700ללא גמישות, טבעי, פוליפרופילן
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700חריץ יחיד. פוליפרופילן טבעי
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequesing Primer KitIlluminaPE-121-1003Trypan
Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, נוזל צמיג
מיםMilliporeSigmaW3500מסונן סטרילית, BioReagent, מתאים לתרבית תאים
צינורות צנטריפוגה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732(2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1(2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687(2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516(2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36(2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25(2009).
  16. Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059(2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072(2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672(2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786(2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tn5PCR

מאמרים קשורים