כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
ממברנות תאיות הן סביבות צפופות מאוד לתגובות ביומולקולריות ולאיתותים. עם זאת, רוב הניסויים במבחנה החוקרים אינטראקציה של חלבונים עם שומנים משתמשים בממברנות דו-שכבתיות עירומות. מערכות כאלה חסרות את המורכבות של צפיפות על ידי חלבונים וגליקנים המוטמעים בממברנה ואינן כוללות את השפעות הנפח הנלוות על פני השטח של קרום התא. כמו כן, משטח הזכוכית הטעון שלילית שעליו נוצרים דו-שכבתי השומנים מונע דיפוזיה חופשית של ביומולקולות טרנסממברנות. כאן אנו מציגים ממברנה פולימרית-שופתית המאופיינת היטב כחיקוי של ממברנות שומנים צפופות. פרוטוקול זה משתמש בשומנים מצומדים מפוליאתילן גליקול (PEG) כגישה כללית לשילוב קראודרים בשכבת השומנים הנתמכת (SLB). ראשית, מוצג הליך ניקוי של השקופיות והכיסויים המיקרוסקופיים לביצוע ניסויים במולקולה בודדת. לאחר מכן, נדונו שיטות לאפיון PEG-SLBs וביצוע ניסויים של מולקולות בודדות של קשירה, דיפוזיה והרכבה של ביומולקולות באמצעות מעקב אחר מולקולות בודדות ופוטו-הלבנה. לבסוף, פרוטוקול זה מדגים כיצד לנטר את מכלול הננו-נקבוביות של רעלן יוצר נקבוביות חיידקים ציטוליזין A (ClyA) על ממברנות שומנים צפופות באמצעות ניתוח פוטו-לבנה של מולקולה אחת. קודי MATLAB עם מערכי נתונים לדוגמה כלולים גם כדי לבצע חלק מהניתוחים הנפוצים כגון מעקב אחר חלקיקים, חילוץ התנהגות מפוזרת וספירת תת-יחידות.
מבוא
קרומי התאים הם מערכות צפופות ומורכבות מאוד1. לצפיפות מולקולרית יכולה להיות השפעה ניכרת על דיפוזיה של ישויות הקשורות לממברנה כמו חלבונים ושומנים 2,3,4. באופן דומה, תגובות דו-מולקולריות על ממברנות שומניות כמו דימריזציה של קולטנים או אוליגומריזציה של קומפלקסים של ממברנות מושפעות מצפיפותשל 5,6,7. האופי, התצורה והריכוז של ה-crowders יכולים לשלוט בקשירת הממברנה, בדיפוזיביות ובאינטראקציה בין חלבון לחלבון בכמה דרכים 8,9
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ניקוי המגלשה וכיסוי לניסויים במולקולה בודדת
- לפני הרכבת תא ההדמיה, נקו והכינו הן את הכיסויים והן את השקופיות. קדחו מספר זוגות חורים על שקופיות הזכוכית באמצעות מכונת קידוח עם מקדחות מצופות יהלום (קוטר 0.5-1 מ"מ). אם משתמשים ביריעות אקריליק, השתמשו בחותך לייזר כדי ליצור חורים מדויקים (0.5 מ"מ), כפי שמוצג באיור 1.
הערה: כל זוג חורים ישמש ככניסה ושקע להחלפת זרימה עבור תא מיקרופלואידי בודד. קובץ CAD מייצג עבור חורים בשקופית אקרילית זמין בקובץ קידוד משלים 1. חורים שנקדחו במגלשות זכוכית בדרך כלל בסופו של דבר גדולים פי 1.5-2 מגודל המקדחה. - נקו את השקופיות והכיסויים בעזרת חומר ניקוי. שטפו א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניטור הקשירה של חלבון ClyA על ממברנות PEGylated
לאחר שלב 4.5, הקינטיקה המחייבת נאמדת על ידי התוויית מספר החלקיקים הנקשרים לפני השטח של הממברנה לאורך זמן (וידאו 1). כאשר חלבון ClyA נקשר לממברנה עם 5 מול% PEG2000 שומנים, צפיפות החלקיקים גדלה ומגיעה לרוויה (איור 5). דעיכה מעריכית המתאימה לחלקיקים הכבולים (מעגלי ציאן) נותנת את קבוע הזמן (τb) עבור קשירת הממברנה (יש לציין שנקודות הזמן הראשוניות [עיגולים אדומים] אינן מתאימות במקרה זה).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מדגימים ניסויים של מולקולות בודדות על דו-מולקולות נתמכות של שומנים (SLBs) שמפגינים סביבה צפופה עבור ביומולקולות משובצות ממברנה. הסביבה הצפופה יוצרת אפקט נפח מוחרג, המוביל לשיפור התגובות הביומולקולריות 1,2,39,40. עבור מערכת PEG-lipid, שבה הפולימר תופס בעיקר את הנפח מחוץ לדו-שכבתי, השפעה זו בולטת במיוחד עבור מינים מולקולריים עם תחומי ecto גדולים. לכן, בהשוואה לצבעים ליפופיליים, ניתן להפחי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים לפרופ' בנימין שולר על שיתוף הביטוי פלסמיד לחלבון ClyA. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע של הגבול האנושי (RGP0047-2020).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2.5 מ"ל מזרקים | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 מ"ל מזרק פלסטיק טוברקולין | |
| אצטון | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
| יריעת | בעובי 2 מ"מ | ||
| BigiMall | 2 מ"מ, סוניקטור אמבטיה שקוף | ||
| ברנסון | CPX-1800 | ||
| סידן כלוריד | |||
| כלורופורם | סיגמא | 528730 | HPLC כיתה |
| כולסטרול | Avanti | 700100 | |
| קופלין צנצנת | דוראן וויטון קימבל | S6016 | 8 צנצנת שקופיות עם כיסוי זכוכית |
| כיסויים | VWR | 631-1574 | 24 מ"מ X 50 מ"מ |
| Cy3-DNA גדיל | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 | |
| צבע ציאנין (Cy3) | Cytiva מדעי החיים | PA23001 | |
| DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))גדיל |
| מחבר DNA 1 | סיגמא אולדריץ' | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC גדיל | |
| מחבר DNA T 2 | סיגמא אולדריץ' | CGGACGCAATAGCAGCTCAG TCGGTCACAT | |
| DNA טוקופרול גדיל | ביומרים | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
| DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום) |
| סרט דו צדדי | מקדחי LF93010LE | ||
| (מצופה יהלום) | 0.5 - 1 מ"מ | ||
| מכונת קידוח | Dremel | 220 | תחנת עבודה |
| EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
| חרוזי פלואורסצנציה | Invitrogen | F10720 | |
| זכוכית שקופיות | כחול כוכב | PIC-1 | |
| Sigma | 854190 | ||
| מי חמצן | Lobachemie | 00182 | תמיסה 30%, |
| לבולן | תרמו-פישר מדעי | לייזר דטרגנט | |
| 532 ננומטר | ספיר | קוהרנטי | |
| מערכות לייזר אוניברסליות | ILS12.75 | ||
| ליסמין רודמין DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (מלח אמוניום) |
| מתנול | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס | IX81 | |
| פוספט מאגר מלח (PBS) | 1X | ||
| מנקה פלזמה | האריק פלזמה בע"מ | PDC-002 | |
| POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
| משאבת מזרק ניתנת לתכנות | Era Pump Systems | NE1010 | משאבת מזרק בלחץ גבוה |
| PTFE כובעים Sigma | 27141 | ||
| צינורות PTFE | קול-פארמר | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022 אינץ' מזהה x 0.042 אינץ' |
| OD חומצה גופרתית | SD כימיקלים | 98%, AR כיתה | |
| TIRF אובייקטיבי | אולימפוס | UPLAPO100XOHR | |
| ואקום מייבש | טרסונס | ||
| מערבולת מיקסר | טרסונס |
מקורות
- Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
