דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

Abstract

ממברנות תאיות הן סביבות צפופות מאוד לתגובות ביומולקולריות ולאיתותים. עם זאת, רוב הניסויים במבחנה החוקרים אינטראקציה של חלבונים עם שומנים משתמשים בממברנות דו-שכבתיות עירומות. מערכות כאלה חסרות את המורכבות של צפיפות על ידי חלבונים וגליקנים המוטמעים בממברנה ואינן כוללות את השפעות הנפח הנלוות על פני השטח של קרום התא. כמו כן, משטח הזכוכית הטעון שלילית שעליו נוצרים דו-שכבתי השומנים מונע דיפוזיה חופשית של ביומולקולות טרנסממברנות. כאן אנו מציגים ממברנה פולימרית-שופתית המאופיינת היטב כחיקוי של ממברנות שומנים צפופות. פרוטוקול זה משתמש בשומנים מצומדים מפוליאתילן גליקול (PEG) כגישה כללית לשילוב קראודרים בשכבת השומנים הנתמכת (SLB). ראשית, מוצג הליך ניקוי של השקופיות והכיסויים המיקרוסקופיים לביצוע ניסויים במולקולה בודדת. לאחר מכן, נדונו שיטות לאפיון PEG-SLBs וביצוע ניסויים של מולקולות בודדות של קשירה, דיפוזיה והרכבה של ביומולקולות באמצעות מעקב אחר מולקולות בודדות ופוטו-הלבנה. לבסוף, פרוטוקול זה מדגים כיצד לנטר את מכלול הננו-נקבוביות של רעלן יוצר נקבוביות חיידקים ציטוליזין A (ClyA) על ממברנות שומנים צפופות באמצעות ניתוח פוטו-לבנה של מולקולה אחת. קודי MATLAB עם מערכי נתונים לדוגמה כלולים גם כדי לבצע חלק מהניתוחים הנפוצים כגון מעקב אחר חלקיקים, חילוץ התנהגות מפוזרת וספירת תת-יחידות.

Introduction

קרומי התאים הם מערכות צפופות ומורכבות מאוד¹. לצפיפות מולקולרית יכולה להיות השפעה ניכרת על דיפוזיה של ישויות הקשורות לממברנה כמו חלבונים ושומנים ^2,3,4. באופן דומה, תגובות דו-מולקולריות על ממברנות שומניות כמו דימריזציה של קולטנים או אוליגומריזציה של קומפלקסים של ממברנות מושפעות מצפיפות^{של 5,6,7.} האופי, התצורה והריכוז של ה-crowders יכולים לשלוט בקשירת הממברנה, בדיפוזיביות ובאינטראקציה בין חלבון לחלבון בכמה דרכים ^8,9. מאחר שקשה לשלוט בצפיפות הממברנות התאי ולפרש את השפעתן על ביומולקולות משובצות, חוקרים ניסו ליצור מערכות חוץ גופיות ^{חלופיות 10}.

גישה פופולרית עבור ממברנות צפופות מלאכותיות היא סימום הממברנות הדו-שכבתיות בפולימר (כגון פוליאתילן גליקול, PEG) - שומנים מושתלים^11,12. במהלך הדמיה של דינמיקה של חלבונים ושומנים על דו-שכבתיות שומנים נתמכות (SLBs), פולימרים אלה גם מגנים על הרכיבים המוטבעים בממברנה מפני המצע הטעון שלילית הבסיסי (כגון זכוכית) על ידי הרמה יעילה של הדו-שכבה הרחק מהתמיכה הבסיסית. על ידי שינוי הגודל והריכוז של הפולימר, ניתן לשלוט במידת הצפיפות המולקולרית, כמו גם בהפרדתו מהתמיכה המוצקה^{הבסיסית 13,14}. זהו ללא ספק יתרון על פני דו-מולקולות של שומנים הנתמכים על מצעים מוצקים ללא כריות פולימריות^15,16, שבהן ביומולקולות טרנס-ממברנה יכולות לאבד את פעילותן^17,18,19. חשוב מכך, הוא מאפשר לנו לשחזר את הסביבה הצפופה של קרום התא במבחנה, שהיא קריטית לתהליכי ממברנה רבים.

פולימרים המושתלים על פני השטח על ממברנות עוברים גם שינויים בתצורתם בהתאם לצפיפות ההשתלה^{שלהם 12}. בריכוזים נמוכים, הם נשארים בתצורה מפותלת אנטרופית, המכונה פטריה, מעל פני הממברנה. עם הריכוז הגובר, הם מתחילים לקיים אינטראקציה ונוטים להתפרק ולהתרחב, ולבסוף מניבים היווצרות צפופה דמוית מברשת על הממברנה²¹. מכיוון שהמעבר מפטרייה למשטר המברשת הוא הטרוגני מאוד ומתבטא בתנאים לא מאופיינים היטב של הפולימר, חשוב להשתמש בתנאים מאופיינים היטב לצפיפות על ממברנות מושתלות בפולימר. בהשוואה למחקר^{שנערך לאחרונה 20}, אנו מזהים ומדווחים על הרכבי ממברנות צפופים השומרים על ההובלה והפעילות הדיפוזית של ביומולקולות טרנסממברניות.

בפרוטוקול זה אנו דנים כיצד ליצור ממברנות שומנים PEGylated ומספקים המלצות לציפותי PEG המחקים צפיפות בשני משטרים שונים של תצורת פולימרים (כלומר, פטריות ומברשת). הפרוטוקול מתאר גם קשירה של מולקולה בודדת, מעקב אחר חלקיקים ואיסוף וניתוח נתוני פוטו-הלבנה עבור מולקולות המוטבעות בממברנות צפופות אלה. ראשית, אנו מתארים את שלבי הניקוי היסודי, את הרכבת תא ההדמיה ואת יצירת PEG-SLBs. שנית, אנו מספקים פרטים לניסויים של קשירת מולקולה בודדת, מעקב אחר חלקיקים ופוטו-הלבנה. שלישית, נדון ב-א) חילוץ זיקות הקשירה היחסיות, ב) אפיון הדיפוזיה המולקולרית, ו-ג) ספירת תת-יחידות במכלול חלבונים מסרטים של מולקולות בודדות על הממברנה.

בעוד שאפיינו את המערכת הזו בהדמיה של מולקולה בודדת, הפרוטוקול שימושי לכל הביופיזיקאים של הממברנות המעוניינים להבין את השפעת הצפיפות על תגובות ביומולקולריות על ממברנות שוממניות. בסך הכל, אנו מציגים צינור חזק לייצור דו-שכבתיות שומנים צפופות ונתמכות, יחד עם בדיקות שונות של מולקולות בודדות הנערכות עליהם ושגרות הניתוח המתאימות.

Protocol

1. ניקוי המגלשה וכיסוי לניסויים במולקולה בודדת

1. לפני הרכבת תא ההדמיה, נקו והכינו הן את הכיסויים והן את השקופיות. קדחו מספר זוגות חורים על שקופיות הזכוכית באמצעות מכונת קידוח עם מקדחות מצופות יהלום (קוטר 0.5-1 מ"מ). אם משתמשים ביריעות אקריליק, השתמשו בחותך לייזר כדי ליצור חורים מדויקים (0.5 מ"מ), כפי שמוצג באיור 1.
   הערה: כל זוג חורים ישמש ככניסה ושקע להחלפת זרימה עבור תא מיקרופלואידי בודד. קובץ CAD מייצג עבור חורים בשקופית אקרילית זמין בקובץ קידוד משלים 1. חורים שנקדחו במגלשות זכוכית בדרך כלל בסופו של דבר גדולים פי 1.5-2 מגודל המקדחה.
2. נקו את השקופיות והכיסויים בעזרת חומר ניקוי. שטפו אותם היטב במים שעברו דה-יוניזציה. הניחו את המגלשות והכיסויים בצנצנת נפרדת להכתמת שקופיות (קופלין) עם מים וסוניק בסוניק אמבטיה למשך 30 דקות. עבור כל שלבי הסוניקציה, השתמש בהגדרת הספק של 70 W.
3. מוציאים את המים וממלאים את צנצנת הקופלין המכילה את מגלשות הזכוכית והכיסויים באצטון עד אפס מקום (50-100 מ"ל, תלוי בנפח הצנצנת). במקרה של יריעות אקריליק, השתמש באותו נפח של תמיסת אצטון מעורבבת מראש של 50% (v/v) אחרת השקופיות יהפכו קפואות. נערו את צנצנת הקופלין כדי להבטיח שכל השקופיות והכיסויים יהיו שקועים לחלוטין בתמיסה ויסולקו בסוניק אמבטיה למשך 30 דקות.
4. מוציאים את האצטון ומשליכים אותו למיכל פסולת, יוצקים מתנול לצנצנות הקופלין (50%, v/v לשקופיות אקריליות) וסוניקט במשך 30 דקות. גם אצטון וגם מתנול משמשים להסרת חלקיקים אורגניים בשקופיות.
5. שטפו את המגלשות והכיסויים בכמויות גדולות של מים מסוג 1 והניחו אותם בצנצנת קופלין מזכוכית. יוצקים תמיסת 1 M KOH לתוך הצנצנת וסוניקט במשך שעה אחת. עבור שקופיות אקריליק, השתמש ב- 0.5 M של KOH.
6. השליכו את ה-KOH במיכל פסולת אנאורגני. שטפו את הצנצנת עם הרבה מים והניחו את צנצנות הקופלין בתוך קולט אדים לטיפול בפיראנה. אין לבצע טיפול פיראנה למגלשות אקריליות; המשך ישירות לשלב 1.9.
   אזהרה: הטיפול בפיראנה צריך להיעשות במכסה אדים עם כפפות מתאימות, משקפי בטיחות וסינר לטיפול בחומצות. תמיסת פיראנה היא חומר מחמצן חזק, והיא מסירה את כל שאריות החלקיקים האורגניים מהשקופיות והכיסויים.
7. להכנת תמיסת הפיראנה, מוזגים בעדינות נפח של 2/3 של חומצה גופרתית (98%, v/v) לתוך זכוכית וממלאים את השאר במי חמצן (30%, v/v). מערבבים את התמיסה בזהירות עם מוט זכוכית, יוצקים אותה לתוך צנצנת הקופלין, ומשאירים את צנצנת הקופלין במכסה האדים למשך שעה לפחות.
8. השליכו את תמיסת הפיראנה מצנצנת הקופלין במיכל להשלכה לפסולת חומצית שנשמרה בתוך מכסה האדים. שטפו את צנצנת הקופלין בכמות עצומה של מים מסוג 1.
9. יבשו את המגלשות והכיסויים בזרם עדין של גז חנקן והניחו אותם בצנצנת קופלין נקייה. המגלשות והכיסויים המיובשים מוכנים כעת לטיפול פלזמה. קח זוג שקופיות וכיסויים והנח אותם במכונת הפלזמה.
10. צור ואקום בתא. סובב את הידית לתדר הרדיו של 8-12 מגה-הרץ ליצירת פלזמה בתא. זוהר סגול בתוך התא יציין היווצרות פלזמה בחדר.
11. בצע את הטיפול פלזמה במשך 8-10 דקות. שחררו בעדינות את הוואקום לאחר כיבוי הפלזמה והמשיכו לשלב 2 להרכבת תא ההדמיה המיקרופלואידי.

2. הרכבה של תא microfluidic

הערה: תא ההדמיה נוצר על-ידי כריכה של סרט הדבקה דו-צדדי בין כיסוי שעבר ניקוי מראש לבין החלקה מהשלב הקודם כמתואר להלן.

1. הרכיבו את השקופיות והכיסויים לאחר טיפול הפלזמה, כפי שמוצג באיור 1. מניחים את שקופית הזכוכית על נייר טישו נקי. חותכים את הסרט הדו-צדדי לרצועות ברוחב ~2-3 מ"מ ומניחים אותן בכל צד של זוג חורים במגלשת הזכוכית. השתמש בקצה פיפט כדי לשטח את הקלטת או שזה יגרום לדליפה מערוץ אחד למשנהו.
   הערה: לחלופין, גזור את הקלטת עבור השקופית כולה באמצעות לייזר או חותך התווין אוטומטי (איור 1).
2. הניחו את הכיסוי המטופל בפלזמה על המגלשה המודבקת כדי לסגור את התא. השתמש בקצה פיפט כדי ללחוץ בעדינות את הכיסוי על האזורים המודבקים כדי להפוך את התעלה לאטומה למים.
3. אם אתם משתמשים בזכוכית מחליקה, אטמו את הקצוות באמצעות שרף אפוקסי. לבסוף, לכל תא הדמיה העשוי ממגלשה וכיסוי יש ממד של 10 מ"מ x 2 מ"מ x 0.1 מ"מ (אורך x רוחב x עומק). אחסנו את תאי ההדמיה המיקרופלואידיים המוכנים למשך 1-2 שבועות בתנאי ייבוש (רצוי בין 10-25 מעלות צלזיוס).
   הערה: עבור קלטות חיתוך לייזר המשמשות עם שקופיות אקריליות, אין צורך להשתמש באפוקסי מכיוון שקצוות הקלטת יוצרים אטימה הדוקה חסינת דליפה.

3. ביצוע bilayers נתמך על מצע זכוכית על ידי פיוז'ן שלפוחית

הערה: דו-שכבתי שומנים נתמכים צפופים נוצרים על דפנות תא ההדמיה על ידי איחוי שלפוחיות שומנים שהוכנו עם PEG-ליפידים מסוממים.

1. קח בקבוקון זכוכית נקי, רצוי לנקות מראש באמצעות תמיסת פיראנה. הוסף תמיסת כלורופורם של 1-פלמיטואיל-2-אולאויל-גליצרו-3-פוספוכולין (POPC) ו-1,2-דיאולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוטאנולמין-N-[אמינו(פוליאתילן גליקול)-2000] (DOPE-PEG2000) בחלק השומה הרצוי של ליפידים PEG2000 כך שהריכוז הסופי לאחר הוספת חיץ יהיה 3 mM ליפידים בשלב 3.4. הכן קומפוזיציות קרום אחרות של שומנים באופן דומה.
2. ייבשו את הכלורופורם מהבקבוקון באמצעות זרם עדין של חנקן עם מערבולת קטנה, כך שהשומנים המיובשים מצופים באופן אחיד על פני השטח של הבקבוקון. שים את הבקבוקון ב ואקום desiccator במשך 1 שעות. פעולה זו תסיר כל כלורופורם שיורי בבקבוקון הזכוכית. יש להוסיף 1 מ"ל של תמיסת מלח נטויה (PBS) ולדגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
3. הכינו שלפוחיות חד-שנתיות קטנות (רכבי שטח) כמתואר להלן.
   1. מערבלים בעדינות במשך 1-2 דקות לאחר דגירה במהלך הלילה עד שהתמיסה הופכת עכורה וחלבית.
   2. קח 100 μL של תמיסה זו בצינור צנטריפוגה קטן של 500 μL וסוניקט במשך כשעה אחת בסוניק אמבטיה (מוגדר בהגדרת הספק של 70 W). הפתרון יתבהר; אם לא, אז sonicate במשך 30 דקות נוספות. צעד זה ייצור רכבי שטח בקוטר 50-100 ננומטר.
      הערה: אם מתכוננים בפעם הראשונה, אפיינו את רכבי השטח באמצעות פיזור אור דינמי^22,23 (DLS) או שיטה מקבילה.
4. הוסיפו סידן כלורי (CaCl 2, 3 M) לשלפוחית הסוניקט_, כך שהריכוז הסופי שלו הוא 30 mM בתמיסת השומנים.
5. חותכים קצה micropipette להזרקת תמיסת הדגימה כך שהוא מתאים בחוזקה לתוך החור. מערבבים את תמיסת השומנים ומזריקים דרך אחד החורים בתא ההדמיה שנעשו בשלב 2. נגב את הפתרון העודף שיוצא מהתא מהשקע עם רקמה נקייה כדי למנוע זיהום של ערוצים סמוכים.
6. השאירו את ההרכבה הזו בתא לח למשך 90 דקות. הכן תא לחות על ידי הצבת רקמה רטובה בקצה צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. הניחו את המגלשה הצידה בתוך הצינור כאשר מכסי הצינורות סגורים. הבועיות יתמזגו וייצרו דו-שכבתי אחיד על משטח הזכוכית.
7. שטפו היטב את התא עם כמות עצומה של מאגר PBS (בערך פי 5 מנפח תא ההדמיה). מנע את הכניסה של בועות אוויר לתוך החדר בזמן כביסה כמו זה יכול ליצור פגמים בממברנה.

4. הגדרת מיקרוסקופ ומדידות הדמיה של חלקיקים בודדים

הערה: ניסויים במולקולה בודדת מתבצעים על מערך מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית^{מבוססת מטרה של 24,25,26} (TIRF) (איור 2). הדמיית TIRF מספקת יחס אות לרעש טוב יותר עבור הדמיה של מולקולה בודדת, אם כי ניתן להשתמש במיקרוסקופים אפי-פלואורסצנטיים גם בתנאים מסוימים (במיוחד כאשר ניתן להסיר את הביומולקולות הפלואורסצנטיות מהתמיסה בתפזורת על ידי שטיפה). ניתן להשתמש ב- TIRF מסוג פריזמה אך סוג המטרה עדיף על הקלות של הגדרת מיקרופלואידיקה²⁷. עבור TIRF מסוג אובייקטיבי, מומלץ להשתמש ביעד מפתח צמצם מספרי גבוה (הגדלה של 100x, הזמינה בדרך כלל באופן מסחרי כמטרת TIRF).

1. לפני ביצוע ניסוי כלשהו על ניידות והרכבה, יישר את מיקרוסקופ TIRF כדי להבטיח יחס אות לרעש אופטימלי עקב תאורה על ידי השדה האוונסנטי. במהלך היישור, שמור על עוצמת לייזר נמוכה, בין 100 μW ל- 1 mW.
   התראה: יש להשתמש במשקפי בטיחות לייזר במהלך יישור קרן הלייזר.
   1. כדי ליישר את המיקרוסקופ, הכינו דגימת חרוזים פלואורסצנטיים על ידי הוספתם לתעלה המיקרופלואידית בריכוזים נמוכים (ב~100 pM) כך שכתמי פלואורסצנט מחרוזים בודדים אינם חופפים בתמונות.
   2. ראשית, דמיינו את החרוזים במצב אפיפלואורסצנטי. בעוד שהתאורה נמצאת במצב אפיפלואורסצנטי, הזיזו את שלב תרגום המראה M5 (המראה שמחזירה את הלייזר לדיקרואיקון) כך שהקרן היוצאת מהמטרה מתכופפת עד שבסופו של דבר היא נמצאת בתצורת השתקפות פנימית כוללת.
   3. ודא אם הושגה תאורת TIR. כאשר שדה ה-TIR evanescent מאיר את דגימת החרוזים, בדקו שרק החרוזים על פני השטח נראים לעין ולא נצפו חרוזים שצפים בחופשיות הרחק מהמשטח.
2. בתחילת הניסוי, הגדר את עוצמת הלייזר במישור המוקד האחורי של המטרה ל-5-10 mW כדי למנוע הרס פוטו (photolabaching) של הפלואורופורים.
3. שמור את השקופית על שלב המיקרוסקופ והתמקד תחילה בקרום החשוף (ללא כל פלואורופורים). בדרך כלל, עקבות קטנים של זיהומים בקרום השומנים מספיקים כדי לעשות זאת. אופציונלי: שלבו מספר קטן של חרוזים פלואורסצנטיים או נקודות קוונטיות (תת-תחום פיקומולרי) במהלך שלב 3.1, כך שרק שניים עד חמישה חלקיקים פלואורסצנטיים נמצאים בשדה הראייה כדי להקל על זיהוי המיקוד הנכון.
4. הזרקת הדגימה (חלבוני ממברנה וכו') באמצעות מיקרופיפטה לתוך תא ההדמיה המצופה PEG-SLB שנעשה בשלב 3.7.
5. למדידת קינטיקה של קשירה של מולקולה בודדת, השתמשו במשאבת מזרק כדי להזרים את הביומולקולות המסומנות דרך חורי הכניסה לתוך התא המיקרופלואידי (איור 3). השתמש בקצב זרימה של 50-500 μL לדקה.
   1. התחל ברכישת סרטים לפני הוספת הפתרון לתא ההדמיה. רכשו >5,000 פריימים בקצב פריימים של 25-50 פריימים לשנייה בזרימה רציפה עד שלא תהיה עלייה נוספת במראה של כתמים חדשים על פני הממברנה (וידאו 1). לניתוח קינטיקה מחייבת, בצע את השלבים מ 6.1.
6. למעקב אחר חלקיקים בודדים, הוסיפו את הביומולקולות המסומנות בריכוזים נמוכים (בהשוואה לקבוע הקשירה) לתעלה באמצעות מיקרופיפטה. מטב את הריכוז לצפיפות של <0.1 חלקיקים/μm 2 כך שחלקיקים בודדים כמעט ולא חוצים נתיבים (וידאו 2). זה מבטיח את הנאמנות הגבוהה של מסלולים התאושש מערכי הנתונים. לדגור במידת הצורך (במקרה של קשירת ממברנה לקויה על ידי biomolecules, ~ 10 דקות) בסביבה לחות ולשטוף את החדר עם החיץ.
   הערה: יש צורך בשטיפה במקרה שהכריכה לקויה על הממברנה ורוב המולקולות הפלואורסצנטיות נשארות בתמיסה. אחרת, הדבר עלול להפריע להדמיה ולגרום ליחס אות לרעש ירוד.
7. לניתוח מסלול של חלקיק יחיד, רכשו 200-500 מסגרות ב-10-100 פריימים לשנייה. שמור על העדשה האובייקטיבית הממוקדת במישור הדו-שכבתי עם סחף שלב מינימלי במהלך מרווח הרכישה.

5. רכישת תמונה לספירת תת-יחידות במכלול חלבונים

הערה: רכישת תמונה להערכת סטויכיומטריה דורשת הלבנה מתמשכת של פלואורופורים וזיהוי מספר השלבים עד שלא פולטים יותר פלואורופורים.

1. למדידת תת-יחידות, הוסף את הריכוז הרלוונטי של ביומולקולות מסומנות (לדוגמה: ראה תוצאות; ClyA נוספה בריכוז של 25 ננומטר) לתא ההדמיה המיקרופלואידי ולדגירה (שטיפה במידת הצורך). דגירה של השקופית בתא אדים בטמפרטורה הרצויה למשך פרק הזמן הנדרש (לדוגמה: 37 מעלות צלזיוס ו-60 דקות להרכבת ClyA).
2. בצע רכישת תמונה עבור הלבנת תמונות של מולקולה בודדת כמתואר להלן.
   1. שטפו את תא ההדמיה עם חיץ לפני ההדמיה (במידת הצורך). הנח את השקופית על המיקרוסקופ והתאם את המיקוד כדי להמחיש את המולקולות המסומנות.
   2. הגדר את כוח הלייזר לרמה שבה הלבנת הפלואורופור מתרחשת בהדרגה (~ 1-5 דקות). באופן אידיאלי, עבור כל ביומולקולה שהורכבה, יש לשמור על קצב שלב ההלבנה >10-20 מסגרות הדמיה זו מזו. רכשו את התמונות עד שכל המולקולות יתחלפו לחלוטין (וידאו 3).
      הערה: כדי לקבוע את משך הזמן הכולל של מסלול ההלבנה הנדרש, התווה את העוצמה הממוצעת של כתמים בודדים עם מספר מסגרות ההדמיה וקבע את קבוע הזמן על ידי התאמת פונקציית דעיכה מעריכית. ניתן להגדיר את משך הזמן הכולל של הרכישה ל 5-10 פעמים קבוע הזמן.
3. בצע מדידת הרכבה תלוית זמן על ידי התחלת רכישת סרטים ברגע שהדגימה מוכנסת לתא ורכישת סרטי הלבנת תמונות חדשים במרווחי זמן קבועים לאחר קשירת הממברנה ממקטעים שונים של PEG-SLB.

6. ניתוח תמונות ונתונים

1. בצע קשירה ומעקב אחר חלקיקים בודדים כמתואר להלן.
   1. חלצו מסלולים של חלקיקים בודדים מהסרטים שנרכשו לעיל, כפי שמוצג באיור 4. לאיתור חלקיקים בודדים ומעקב אחריהם, השתמש בחבילת MATLAB, u-track²⁸, או ב- Trackmate²⁹, תוסף ב- ImageJ, המספק גם אלגוריתם חזק למעקב אחר חלקיקים בודדים. בצע את השלבים להגדרת ניתוח u-track כפי שמוצג בקובץ משלים 1.
      הערה: הפרמטרים הקריטיים למעקב אחר חלקיקים בודדים הם סטיית התקן של גודל החלקיקים (בפיקסלים) ואורך סגירת הפער. השתמש ב- 1 וב- 0, בהתאמה, עבור פרמטרים אלה כקריטריונים המחמירים ביותר למעקב.
   2. כדי לחשב את קבועי קצב הקשירה, העריכו תחילה את מספר החלקיקים הנקשרים לפני השטח של הממברנה לאורך זמן. השתמש בקובץ MATLAB binding_SPT (קובץ קידוד משלים 2) עם תיקיית הפלט u-track כדי לזהות ולהתוות את מספר החלקיקים המופיעים על הממברנה המתקבלת משלב 6.1. התאימו את הקינטיקה הנצפית למודלים קינטיים מתאימים (לדוגמה: התאמה מעריכית יחידה לקביעת קבוע הזמן, שההופכי שלו ניתן להקצות לקבוע קצב נראה)³⁰ כדי לחלץ את קבועי הקצב (ראו תוצאות, איור 5).
   3. התזוזה הממוצעת בריבוע (MSD) של החלקיקים המתפזרים (כגון מעקב דנ"א ב-PEG-SLBs, איור 6) מצביעה על אופי הדיפוזיה. השתמש בחבילת MATLAB MSD_ISD (קובץ קידוד משלים 2) עם תיקיית הפלט u-track כדי לקבל את עלילת MSD כפונקציה של זמן השהיה (איור 6B).
   4. כדי לזהות מינים הטרוגניים מתפזרים, חשבו התפלגויות מיידיות של תזוזה בריבוע (ISD) כפי שמוצג באיור 6C. ISD2, המוגדר כ- (X t+τ - X t)2 + (Y_t+τ− Y _t)2, כאשר זמן השהיה, _τ = ², מועדף מכיוון שהוא מפחית רעש. סנן מסלולים קצרים עם פחות משלוש מסגרות כדי להפחית את הרעש.
   5. השתמש ISD_analyzer (קובץ קידוד משלים 2) ב- MATLAB עם פלט מסלול u כדי להתוות את ספקי האינטרנט של החלקיקים במעקב (איור 6C).
2. בצע ניתוח פוטו-הלבנת מולקולה בודדת כמתואר להלן.
   1. כדי להעריך את הסטויכיומטריה של קומפלקסי הממברנה, בצע ניתוח פוטו-הלבנה על העוצמות התלויות בזמן של קומפלקסים פלואורסצנטיים (וידאו 3). לשם כך, החל אלגוריתם תיקון סחף (drift_correct_images, קובץ קידוד משלים 2) המבוסס על ההתאמה האוטומטית של מסגרות סרט כדי לחלץ את סחף התרגום. זאת בהנחה שהמבנים המורכבים הם במידה רבה חסרי תנועה במהלך רכישת תמונה. הפעל את חבילת MATLAB Extract_traces_1C (קובץ קידוד משלים 2) כדי לזהות עקבות זמן של עוצמת חלקיקים מהסרטים.
   2. השתמש בקוד MATLAB Stepcount_immobile (קובץ קידוד משלים 2) כדי לבצע את זיהוי השלבים עבור עקבות זמן העוצמה. במקרה שהחלקיקים אינם חסרי תנועה, השתמש בחבילת u-track כדי לחלץ את מיקומם של חלקיקים נעים. ניתן למפות קבוצה זו של קואורדינטות xy לסרטים הגולמיים כדי לחלץ את ערכי העוצמה של החלקיק הנע כשהוא מתפזר לרוחב על הממברנה. השתמש בחבילת MATLAB utrack_Int (קובץ קידוד משלים 2) עם הפלט מניתוח u-track עבור אפשרות זו.
   3. בצע תיקון לתיוג לא שלם של הביומולקולות עם תגי פלואורופור כדי להעריך את הסטויכיומטריה המורכבת הנכונה של חלבונים. קבע את יעילות הסימון באמצעות ספקטרופוטומטר UV-VIS על ידי מדידת ספיגת הצבע והחלבון כדי להעריך את הריכוז. חשב את יעילות הסימון כיחס הטוחן של הצבע לחלבון.
      הערה: חלק מהצבעים נספגים גם באורכי גל הקרובים ל-280 ננומטר, ולכן יש לקחת בחשבון את תרומת הספיגה הזו של הצבע במהלך חישוב הריכוז.
   4. בצע תיקון בינומי כדי לקחת בחשבון את יעילות התיוג הלא שלמה של הפלואורופור באופן הבא באמצעות קוד MATLAB Step_correction (קובץ קידוד משלים 2) עם הנתונים המתקבלים מספירת השלבים בשלב 6.2.2. לדוגמה, עבור רעלן יוצר נקבוביות כמו ציטוליזין A, היוצר מבנה דמוי טבעת דודקאמרית, החל תיקון בינומי באמצעות הנוסחה הבאה:
      נ_ק
      כאשר = יעילות התיוג, n = מספר שלבי ההלבנה בתמונה, ו- s = ספירות בפועל. השתמש בשגרת MATLAB Stepcount_immobile כדי לשחזר את המינים האוליגומריים המתוקנים. המירו את התדירות של אוליגומרים (_{s i}) לשברי מסה (איור 7C; קובץ קידוד משלים 2).
      הערה: קבוצה של קבצים שנותחו על-ידי המעקב כלולים בקובץ קידוד משלים 3. ניתן להפעיל את קודי MATLAB בקובץ קידוד משלים 2 עם ערכות נתונים אלה.

Results

ניטור הקשירה של חלבון ClyA על ממברנות PEGylated
לאחר שלב 4.5, הקינטיקה המחייבת נאמדת על ידי התוויית מספר החלקיקים הנקשרים לפני השטח של הממברנה לאורך זמן (וידאו 1). כאשר חלבון ClyA נקשר לממברנה עם 5 מול% PEG2000 שומנים, צפיפות החלקיקים גדלה ומגיעה לרוויה (איור 5). דעיכה מעריכית המתאימה לחלקיקים הכבולים (מעגלי ציאן) נותנת את קבוע הזמן (τ_b) עבור קשירת הממברנה (יש לציין שנקודות הזמן הראשוניות [עיגולים אדומים] אינן מתאימות במקרה זה).

Discussion

כאן אנו מדגימים ניסויים של מולקולות בודדות על דו-מולקולות נתמכות של שומנים (SLBs) שמפגינים סביבה צפופה עבור ביומולקולות משובצות ממברנה. הסביבה הצפופה יוצרת אפקט נפח מוחרג, המוביל לשיפור התגובות הביומולקולריות 1,2,39,40. עבור מערכת PEG-lipid, שבה הפולימר תופס בעיקר את הנפח מחוץ לדו-שכבתי, השפעה זו בולטת במיוחד עבור מינים מולקולריים עם תחומי ecto גדולים. לכן, בהשוואה לצבעים ליפופיליים, ניתן להפחי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 מ"ל מזרקים	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5 מ"ל מזרק פלסטיק טוברקולין
אצטון	Finar Chemicals	10020LL025
יריעת			בעובי 2 מ"מ
	BigiMall		2 מ"מ, סוניקטור אמבטיה שקוף
	ברנסון	CPX-1800
סידן כלוריד
כלורופורם	סיגמא	528730	HPLC כיתה
כולסטרול	Avanti	700100
קופלין צנצנת	דוראן וויטון קימבל	S6016	8 צנצנת שקופיות עם כיסוי זכוכית
כיסויים	VWR	631-1574	24 מ"מ X 50 מ"מ
Cy3-DNA גדיל	IDT		GCTGCTATTGCGTCCGTTTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
צבע ציאנין (Cy3)	Cytiva מדעי החיים	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))גדיל
מחבר DNA 1	סיגמא אולדריץ'		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC גדיל
מחבר DNA T 2	סיגמא אולדריץ'		CGGACGCAATAGCAGCTCAG TCGGTCACAT
DNA טוקופרול גדיל	ביומרים		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום)
סרט דו צדדי	מקדחי LF93010LE
(מצופה יהלום)			0.5 - 1 מ"מ
מכונת קידוח	Dremel	220	תחנת עבודה
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
חרוזי פלואורסצנציה	Invitrogen	F10720
זכוכית שקופיות	כחול כוכב		PIC-1
	Sigma	854190
מי חמצן	Lobachemie	00182	תמיסה 30%,
לבולן	תרמו-פישר מדעי		לייזר דטרגנט
532 ננומטר	ספיר		קוהרנטי
	מערכות לייזר אוניברסליות	ILS12.75
ליסמין רודמין DOPE	Avanti	810150	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (מלח אמוניום)
מתנול	Finar Chemicals	30932LL025
מיקרוסקופ	אולימפוס	IX81
פוספט מאגר מלח (PBS)			1X
מנקה פלזמה	האריק פלזמה בע"מ	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
משאבת מזרק ניתנת לתכנות	Era Pump Systems	NE1010	משאבת מזרק בלחץ גבוה
PTFE כובעים Sigma		27141
צינורות PTFE	קול-פארמר	WW-06417-21	Masterflex, 0.022 אינץ' מזהה x 0.042 אינץ'
OD חומצה גופרתית	SD כימיקלים		98%, AR כיתה
TIRF אובייקטיבי	אולימפוס	UPLAPO100XOHR
ואקום מייבש	טרסונס
מערבולת מיקסר	טרסונס