ניתוח אוטומטי של פנוטיפים תוך תאיים של סלמונלה באמצעות ImageJ

סיכום

סלמונלה פולשת ומשתכפלת בתוך תאי אפיתל מעיים הן בוואקולות ספציפיות לסלמונלה והן בחינם בציטוזול (היפר-שכפול). פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה מתואר כאן כדי לכמת את הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה על ידי שני ניתוחי תמונה משלימים באמצעות ImageJ, המגיעים לרזולוציה של תא בודד וניקוד.

תקציר

סלמונלה היא פתוגן אנטרי המסוגל לפלוש לאפיתל המעי ולהשתכפל באנטרוציטים, הן בתוך vacuoles ספציפיים לסלמונלה והן חופשיים בציטוזול (שכפול יתר ציטוזולי). פנוטיפים שונים אלה של שכפול תוך-תאי מניעים למסלולים שונים של פתוגנזה, כלומר, שכפול יתר ציטוזולי גורם למוות של תאי דלקת ושחול לתוך לומן המעיים, בעוד שכפול vacuolar מוביל לחדירת טרנס-אפיתל והתפשטות מערכתית. נעשה מאמץ משמעותי ליצור כלי מיקרוסקופיה כדי לחקור את ההתנהגות של סלמונלה בתוך תאים פולשים, כגון פלסמיד כתב פלואורסצנטי pCHAR-Duo המאפשר הבחנה בין חיידקים vacuolar ו cytosolic על ידי ביטוי דיפרנציאלי של mCherry ו- GFP. עם זאת, פנוטיפים תוך תאיים הם לעתים קרובות ניקוד ידני, הליך זמן רב המגביל את הניתוח למספר קטן של דגימות ותאים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו שני ניתוחי תמונה משלימים ואוטומטיים באמצעות ImageJ, תוכנה לניתוח תמונות הזמינה באופן חופשי. בפרוטוקול התפוקה הגבוהה, תאי אפיתל היו נגועים בסלמונלה שנשאה pCHAR-Duo באמצעות צלחות של 96 בארות. ההדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. לאחר מכן, יושמו שתי שיטות לניתוח תמונה כדי למדוד את ההתנהגות התוך-תאית של סלמונלה ברמות פירוט שונות. השיטה הראשונה מודדת את העומס החיידקי התוך-תאי הכולל ואת מידת השכפול ההיפר-שכפול הציטוזולי. הוא מהיר ומאפשר ניקוד של מספר גבוה של תאים ודגימות, מה שהופך אותו למתאים למבחנים בעלי תפוקה גבוהה כגון ניסויי סינון. השיטה השנייה מבצעת אנליזה של תאים בודדים כדי לקבוע את אחוז התאים הנגועים, את העומס הממוצע של סלמונלה, ואת קצב השכפול ההיפר-שכפול הציטוזולי המספק פרטים גדולים יותר על התנהגות סלמונלה בתוך תאי אפיתל. הפרוטוקולים יכולים להתבצע על ידי סקריפטים של ImageJ שתוכננו במיוחד כדי להריץ באופן אוטומטי ניתוחי אצווה של השלבים העיקריים של אינטראקציה סלמונלה-אנטרוציטים.

מבוא

סלמונלה היא החומר החיידקי המדווח ביותר הגורם להתפרצויות של מחלות המועברות במזון באיחוד האירופי¹. הביטוי הפתולוגי העיקרי של זיהום סלמונלה הוא דלקת פרקים, שהיא תוצאה של התנהגות הפתוגן במעיים לאחר בליעה והתגובה הדלקתית המקומית כתוצאה מכך². עם זאת, סלמונלה יכולה גם להפיץ לאתרים מחוץ למעיים ולגרום לזיהום מערכתי, במיוחד אצל אנשים מדוכאי חיסון. סוג האינטראקציה בין סלמונלה לבין אפיתל המעי תנאים את התוצאה של הזיהום. ברגע שהיא מגיעה ללומן המעיים, סלמונלה פולשת לתאי אפיתל המעי ומשתכפלת אליהם. ברמה התוך-תאית, סלמונלה יכולה להציג שני פנוטיפים שונים של שכפול, שכפול יתר ציטוזולי והשכפול האיטי התוך-ואקוולרי בתוך ואקואולים המכילים סלמונלה (SCVs). שכפול יתר ציטוזולי גורם למוות דלקתי של תאי מארח ולשחול סלמונלה לתוך לומן המעי³; שכפול הוואקולאר מוביל לחדירת טרנס-אפיתל ולהתפשטות מערכתית⁴. לכן, היקף הפלישה והשכפול הציטוזולי לעומת השכפול הציטוזולי משפיע על מהלך ההדבקה.

הסוג סלמונלה הוא מגוון מאוד, כולל אלפי סרוטיפים עם טווחי פונדקאי שונים ויכולות לגרום למחלות. לדוגמה, S. טיפימוריום מוגדר כסרובר כללי, משום שהוא מדביק מספר פונדקאים שאינם קשורים, ומייצג את אחד הגורמים העיקריים לסלמונלוזיס אנושי. אחרת, ס. דרבי נחשב לסרובאר מותאם לחזירים, שכן הוא מבודד ברובו מהחזירים, אך הוא מדווח גם בחמשת הסרוברים האחראים לזיהום אנושי¹. עם זאת, הידע על התנהגות החיידקים בתוך תאי האפיתל מוגבל למעשה לחקר כמה זני ייחוס, כמו S. טיפימוריום SL1344, שאינם מייצגים את המגוון הטבעי העצום של פתוגניות סלמונלה . אפיון האינטראקציה של זנים שונים של סלמונלה עם תאי אפיתל יתרום להבנת הפתוגניות השונה שלהם. מסיבה זו, פותח פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה כדי לנתח את ההתנהגות התוך-תאית של מספר רב של זנים באופן מהיר ואוטומטי במידה רבה. בפרוטוקול זה, זיהום של תאי אפיתל בוצע בלוחות הדמיה של 96 בארות ורכישת התמונה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. פלסמיד pCHAR-Duo שימש לצפייה בפנוטיפים של פלישה ושכפול של סלמונלה בתוך תאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית⁵. פלסמיד זה נושא את הגן המקודד את כתב הפלואורסצנט האדום mCherry, המתבטא באופן מכונן על ידי כל תאי החיידקים המומרים, ואת הגן המקודד את כתב הפלואורסצנט הירוק GFP, שביטויו מופעל על ידי גלוקוז-6-פוספט הנמצא אך ורק בציטוזול של תאים אאוקריוטים ונעדר ב- SCVs. לכן, הפלסמיד מאפשר הבחנה בין חיידקים vacuolar ו cytosolic על ידי ביטוי דיפרנציאלי של mCherry ו GFP כתבים.

החיידקים הוואקולאריים והציטוזוליים בתמונות מיקרוסקופיה מכמתים בדרך כלל על ידי ניקוד^{ידני 6}, אך זוהי שיטה הגוזלת זמן רב המגבילה את הניתוח למספר קטן של דגימות. לכן, שני ניתוחי תמונה משלימים ואוטומטיים פותחו - ניתוח אזור ואנליזה של תא בודד - באמצעות ImageJ⁷, תוכנה לניתוח תמונות הזמינה באופן חופשי. ניתוח השטח מודד את עומס החיידקים התוך-תאיים הכולל ואת היקף ההיפר-שכפול הציטוזולי באמצעות נתונים של אזורים שנכבשו על ידי תאי אפיתל, סלמונלה אדומה וירוקה בכל תמונת מיקרוסקופיה נרכשת. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תמונות שנרכשו בהגדלה נמוכה; לכן, זה מאפשר להבקיע מספר גבוה של תאי אפיתל עם מעט תמונות, קיצור זמן הרכישה. אנליזת התא הבודד משתמשת בפילוח תאים כדי לקבוע את אחוז התאים הנגועים, את העומס הממוצע של הווקולאר ואת אחוז התאים הנגועים שעוברים שכפול יתר ציטוזולי ברזולוציה של תא בודד.

בפרוטוקול זה, כל השלבים של ניתוח התמונה מתוארים בפירוט כדי להתבצע באופן ידני, אך אותו ניתוח יכול להיות אוטומטי על ידי סקריפטי ImageJ שתוכננו במיוחד שלנו. סקריפטים אלה מאפשרים גם להריץ ניתוחי אצווה כדי לנתח באופן אוטומטי תמונות מרובות ובכך להאיץ את ביצוע השיטה.

פרוטוקול

1. זיהום של תאי אפיתל עם סלמונלה נושאת pCHAR-Duo כתב פלסמיד

הערה: מומלץ פיפטה רב-ערוצית.

1. ציפוי 96 לוחות הדמיה עם קירות שחורים ותחתית זכוכית שטוחה עם קולגן ממש לפני השימוש.
   1. יש לדלל חומצה אצטית קרחונית (17. 4 מ') במים סטריליים שעברו דה-מינרליזציה מתחת למכסה המנוע הכימי כדי לקבל תמיסת חומצה אצטית של 20 mM. בתנאים סטריליים, סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק בגודל נקבוביות 0.2 מיקרומטר. השאירו את התמיסה במדף של 0-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   2. יש לדלל מלאי קולגן של 3 מ"ג/מ"ל ל-50 מיקרוגרם/מ"ל בתמיסת חומצה אצטית מקוררת מראש של 20 מ"מ. יש לערבב על ידי היפוך 10 פעמים, ולאחר מכן לפזר 30 μL של תמיסת קולגן לכל באר (5 מיקרוגרם קולגן / ס"מ²), תוך שמירה על התמיסה במדף של 0-4 מעלות צלזיוס כדי למנוע ג'ל קולגן.
   3. ודא כי תחתיות הבאר מכוסות לחלוטין בקולגן, ולאחר מכן להשאיר את הצלחת תחת זרימה למינרית במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
   4. הסירו בעדינות את התמיסה ובצעו שלוש שטיפות עם 30 מיקרון של מי מלח עם אגירת פוספט (PBS). השתמש בפיפטה רב-ערוצית של 100 μL או 50 μL כדי למנוע ניתוק קולגן.
2. תרבית INT407 תאי אפיתל בצלחות הדמיה מצופות קולגן 20-24 שעות לפני ההדבקה.
   1. תרבית שגרתית של תאי INT407 בבקבוקים בגודל 25 ס"מ² במדיום חיוני מינימלי עם 10% של סרום בקר עוברי (FBS), להלן מדיום תרבית (CM), בתוספת פניצילין 100 U/mL וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל (עט/סטרפ).
   2. יש לשטוף פעמיים צלוחיות INT407 עם 5 מ"ל של PBS, ולאחר מכן לנתק את התאים עם 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA למשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂ 20-24 שעות לפני ההדבקה. ספרו את התאים והכינו מתלה של 3 x 10^{5 תאים} /מ"ל ב-CM.
   3. יש לפזר 100 μL של תרחיף/באר תאים בצלחות הדמיה מצופות קולגן כדי לקבל מפגש של 100%. דגירה ב-37°C באטמוספירה לחה של 5% CO₂ למשך שעה אחת כדי להקל על הידבקות התאים. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של CM ודגירה ב 37 °C באטמוספירה לחה 5% CO₂ במשך 20-24 שעות עד הזיהום (שלב 1.4).
      הערה: על מנת לדמות חיידקים תוך-תאיים, זני סלמונלה עוברים טרנספורמציה עם פלסמיד הכתב pCHAR-Duo שסופק בחביבות על ידי ד"ר אוליביה סטיל-מורטימר. הזנים שנבדקו כאן נבחרו כדי לייצג את מגוון הפנוטיפ המכוסה על ידי הפרוטוקול ולאמת את ניתוחי התמונה בסעיף 4. עיין בתוצאות המייצגות לקבלת פרטים נוספים על הזנים ששימשו במחקר זה.
3. הכינו תרביות פאזה נייחת של זני סלמונלה הנושאים את פלסמיד הכתב pCHAR-Duo.
   1. טעמו את ציר הגליצרול של סלמונלה עם קצה של פיפטה בנפח 10 μL וחסנו אותו ל-1 מ"ל של ציר לוריא ברטני (10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים ו-10 גרם נתרן כלורי לליטר) בתוספת אמפיצילין 100 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. לדגום את האינוקולום באופן סטטי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 שעות לפני ההדבקה כדי להגיע לשלב הנייח של הצמיחה, המתאים ~ 1 x 10⁹ יחידות יוצרות מושבה (CFU) / מ"ל⁸.
4. הדביקו תאי אפיתל INT407 בסלמונלה.
   הערה: זיהומים מבוצעים במשולשים.
   1. יש לשטוף בעדינות תאי INT407 עם 200 μL של PBS/well.
   2. הכן סלמונלה inoculum על ידי דילול חיידקים בן לילה תרבית ב- CM כדי להשיג את המספר הרצוי של CFUs לכל תא אפיתל, המוגדר כריבוי של זיהום (MOI). כאן נעשה שימוש ב- MOI 100.
   3. יש לחסן 200 μL/well, ולאחר מכן לכסות את הצלחת עם קרום איטום נושם לדגור ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה 5% CO₂ במשך שעה אחת. החיסון נחשב לזמן אפס של הזיהום.
   4. הסר את inoculum ולשטוף בעדינות עם 200 μL של PBS / טוב, ולאחר מכן להוסיף 200 μL של CM עם gentamicin 100 מיקרוגרם / מ"ל לכל באר. מכסים את הצלחת בקרום איטום נושם, ולאחר מכן דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂ למשך שעה אחת.
   5. הסר את ה-CM עם גנטמיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל ושטוף בעדינות עם 200 μL של PBS/well. הוסיפו 200 מיקרו-ליטר של CM עם גנטמיצין 10 מיקרוגרם/מ"ל לכל באר, כסו את הצלחת בקרום אטימה נושם, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂ למשך 8 שעות.

2. קיבוע דגימה והכתמת תאי אפיתל

הערה: שמור על הדגימות מוגנות מפני חשיפה ישירה לאור. כרכים מסומנים עבור בארות של צלחת 96 באר. מיטוב נפח נדרש עבור לוחות תרביות תאים שונים או תומכים.

1. בשעה 8 שעות לאחר ההדבקה, הסר CM ושטוף בעדינות שלוש פעמים עם 200 μL / באר של PBS. הסר PBS על ידי היפוך הצלחת על נייר סופג; הימנע משאיפה.
2. תקן את המונו-שכבות הנגועות עם 100 μL/well של פרפורמלדהיד (PFA) 4% ב-PBS למשך 20 דקות ב-RT. הסר PFA 4% ושטוף שלוש פעמים עם 200 μL/well של PBS. ניתן לאחסן את הצלחת למשך 16-24 שעות לכל היותר ב-4 מעלות צלזיוס. המשך לשלב הבא.
3. תאי אפיתל של כתמים.
   הערה: DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) כתם DNA (שלב 2.3.1) משמש לניתוח האזור כדי להכתים גרעינים בלבד, וכתם סינון תוכן גבוה (HCS) (שלב 2.3.2) משמש לניתוח של תא בודד כדי להכתים את כל תא האפיתל. ניתן להשתמש בכתמים סלולריים אחרים, אך נדרשת אופטימיזציה של רכישת התמונה וניתוחה.
   1. ניתוח שטח: יש להוציא 100 μL/באר של DAPI (תמיסה של 300 ננומטר ב-PBS) ולדגור 5 דקות ב-RT המוגן מפני אור.
   2. אנליזה של תא בודד: יש לחדור עם 100 μL/באר של טריטון 0.1x ב-PBS למשך 15 דקות ב-RT. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולהוציא 100 μL/well של כתם HCS מדולל 1:2000 ב-PBS. דגירה במשך 30 דקות ב- RT מוגן מפני אור.
4. הסר את תמיסת ההכתמה וכבס שלוש פעמים עם 200 μL / באר של PBS. הוסף 50 μL/well של PBS לרכישת תמונה אוטומטית.

3. רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי

הערה: כאן, הגדלה נמוכה (10x/0.3 NA, 1 μm/pixel המטרה) בשלב 3.1.1 עבור ניתוח השטח והגדלה גבוהה (40x/0.75 NA, 0.255 μm/pixel המטרה) בשלב 3.1.2 עבור ניתוח התא הבודד משמשים בפרוטוקול הרכישה. ניתן להשתמש בהגדלות אחרות, אך נדרשת אופטימיזציה של רכישת וניתוח תמונה. אם המיקרוסקופ הזמין מאפשר זאת, רכשו תמונות כ-Tile Regions (TRs), "פסיפס" של שדות רציפים הנקראים אריחים, כדי לתעד אזורי דגימה גדולים. הגדר את המיקוד האוטומטי במרכז TR במקום להגדיר אחד עבור כל אריח, כדי להפחית את החשיפה לדוגמה במהלך הליך המיקוד האוטומטי.

1. השתמש במיקוד אוטומטי של תוכנה בערוץ צביעת התאים (ערוץ כחול עבור כתם HCS וכתם גרעיני DAPI) כמיקום z. קבל תמונות בערוץ צביעת תאים (465 ננומטר, תאים או גרעינים) ובערוצי כתב pCHAR-Duo mCherry (610 ננומטר, סלמונלה תוך-תאית) ו- GFP (509 ננומטר, סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוזולית).
   1. ניתוח שטח: תמונה ≥10⁴ תאים/שכפול טכני (כלומר, מומלץ לפחות שלושה TRs של ארבעה אריחים/באר המתאימים לשכפול טכני) בהגדלה של פי 10.
      הערה: מישור z יחיד מספיק כדי לדמות הן תאים המכילים vacuolar והן תאים המכילים סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוסולית בהגדלה של פי 10.
   2. אנליזה של תא בודד: תמונה ≥1,000 תאים/שכפול טכני (כלומר, מומלץ לפחות שני TRs של 16 אריחים/באר המתאימים לשכפול טכני) בהגדלה של פי 40. נדרשים מישורי z מרובים כדי לדמות הן תאים המכילים vacuolar והן תאים המכילים סלמונלי היפר-שכפול ציטוזולי. הגדר את z-stack האופטימלי (3.85 μm z-stack עם מרווח של 0.55 מיקרומטר כדי לקבל שמונה מישורי z מצוין כדי לדמות תאי INT407 הנגועים בסלמונלה היפר-משוכפלת ציטוזולית ב 40x). כל מישור z מזוהה להלן כ-n/8, כאשר n בין 1 (המתאים למישור z התחתון) ל-8 (המתאים למישור z העליון).
2. הפלט של כל רכישה הוא קובץ בשם Acquisition.czi הכולל תמונות של כל השדות, הערוצים ומישורי z. אם TRs נרכשו, מזג את האריחים יחד כדי לקבל תמונה כוללת של כל TR באמצעות קובץ Acquisition.czi יחיד כקלט עבור שיטת התפירה.

4. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ

הערה: שלב 4.1 ושלב 4.2 תוכננו במיוחד עבור הניסוי והרכישה שתוארו לעיל. הגדרות ניסיוניות אחרות עשויות לדרוש אופטימיזציה של הניתוח. הניתוח של קובץ Acquisition.czi יחיד מתואר. עבור ניתוח האצווה, מצא את סקריפט ניתוח התא הבודד ואת סקריפט ניתוח האזור כקבצים משלימים (קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). תוויות המשמשות בסקריפטים ובפקודות ImageJ מודגשות בסעיפים שלהלן.

1. ניתוח שטח
   1. פתח את הקובץ Acquisition.czi ב- ImageJ, בשם AcquisitionTitle בסקריפט: קובץ > פתח > רכישהTitle.czi. ייפתח חלון המציג את כל הערוצים. הערוצים מסומנים כ- c:1-3/3 בהתאם להזמנת הרכישה. כאן, c:1/3 מתאים לכחול (DAPI), c:2/3 ל-mCherry (סלמונלה תוך-תאית), ו-c:3/3 ל-GFP (סלמונלה היפר-משתכפלת ציטוזולית).
   2. הפחת רעשים אקראיים כדי להכין תמונות למדידת שטח בשלבים 4.1.6 ו- 4.1.7.
      1. שכפל את החלון AcquisitionTitle באמצעות תמונה > שכפל > אישור כדי להשיג את החלון AcquisitionTitle1 .
      2. החל טשטוש גאוס על AcquisitionTitle1 באמצעות תהליך > מסנן > טשטוש גאוס. השאר את ערך הסיגמא המוגדר כברירת מחדל כ- 2, ולחץ על אישור. מחסנית תהליכים? ייפתח, לחץ על כן כדי לעבד את כל הערוצים.
      3. הפחת את הרכישה המסוננת בגאוסTitle1 מהקובץ המקורי AcquisitionTitle by Process > מחשבון תמונה: בחר AcquisitionTitle כתמונה1, בחר את הפעולה הפחת ברשימה הנפתחת ולאחר מכן בחר AcquisitionTitle1 כתמונה2. לחץ על OK. חלון מחסנית תהליכים? ייפתח. לחץ על כן כדי לעבד את כל שלוש התמונות (ערוצים) כדי לקבל את החלון ResultsOfAcquisitionTitle.
   3. פיצול ערוצים באמצעות 'תמונה' >'צבע' >'פיצול ערוצים'. כל תמונת ערוץ מוצגת כעת בחלון נפרד, שנקרא באופן אוטומטי על ידי ImageJ כ- C-ResultsOfAcquisitionTitle. כאן C1-ResultsOfAcquisitionTitle מתאים ל- DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle ל- mCherry (סלמונלה תוך תאית), ו- C3-ResultsOfAcquisitionTitle ל- GFP (סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוסולית).
   4. לעבד את התמונה C1-ResultsOfAcquisitionTitle כדי למדוד את השטח שנכבש על ידי גרעיני תאי אפיתל.
      1. נווט לתהליך > חלק כדי ליצור הומוגניזציה של הגרעין המופיע כחורים בתוך אזור הגרעינים.
      2. סף את התמונה C1-ResultsOfAcquisitionTitle כדי לא לכלול את הרקע באמצעות תמונה > התאם > סף: סמן את רקע כהה ובחר אדום ברשימה הנפתחת. הגדר את הסף האוטומטי של המשולש , ולאחר מכן השתמש במחוון העליון כדי להגדיר את ערך הסף המינימלי כאשר הגרעינים נראים אדומים, והרקע נראה שחור (סף = 100, מוחל בפרוטוקול זה).
         הערה: ערכי הסף האוטומטיים המתוארים בשלבים 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 ו- 4.2.4.3 מוצעים כמדריך למשתמש כדי להגדיר את הסף המתאים ביותר עבור גרעינים/תאי אפיתל וחיידקים באופן ידני, בהתאמה. הערך של הסף האוטומטי יידרס בסקריפט על ידי הסף הידני שהוגדר. הסף הידני המוגדר יוחל על כל ניתוח האצווה.
   5. בחר את אנשי המידההמעניינים באמצעות 'נתח > הגדר מדידה': בדוק את האפשרות 'הגבל לסף' כדי להגביל את המדידה לפיקסלים עם סף. בדוק שטח, המתאים לשטח הכולל שנכבש על ידי פיקסלים סף (כלומר, גרעינים ב- C1-ResultsOfAcquisitionTitle, סלמונלה תוך תאית ב- C2-ResultsOfAcquisitionTitle, סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוסולית ב- C3- ResultsOfAcquisitionTitle). סמן את תווית התצוגה כדי להקליט את כותרת הרכישה ואת הערוץ עבור כל תמונה בטבלת התוצאות.
   6. מדוד את השטח שנכבש על ידי הגרעינים באמצעות ניתוח > מידה. המדידות נרשמות בטבלת התוצאות שנפתחת באופן אוטומטי.
   7. תהליך C2-ResultsOfAcquisitionTitle ו- C3-ResultsOfAcquisitionTitle כדי למדוד את השטח שנכבש על ידי סלמונלה תוך-תאית כוללת וסלמונלה היפר-משוכפלת ציטוסולית, בהתאמה. בצע את השלבים 4.1.4-4.1.6 עם כמה שינויים: דלג על שלב ההחלקה בשלב 4.1.4.1 והשתמש בסף האוטומטי של Otsu במקום במשולש בשלב 4.1.4.2 כקו עזר להגדרת ערך הסף המינימלי (מחוון עליון) כאשר סלמונלה מופיעה אדומה והרקע נראה שחור (סף = 200 מוצע).
   8. שמור את טבלת התוצאות באמצעות 'קובץ' > ' שמירה בשם > כל הקבצים'.
   9. פתח את טבלת התוצאות בגיליון אלקטרוני כדי לחשב את יחסי השטח עבור כל קובץ AcquisitionTitle שנותח:
      1. חישוב יחס הזיהום: לחלק את השטח שנכבש על ידי סלמונלה תוך תאית כוללת (כאן ערוץ אדום, C2-) על ידי השטח שנכבש על ידי גרעיני תאי אפיתל (כאן DAPI, C1-).
      2. חשב את יחס ההיפר-שכפול: חלק את השטח שנכבש על ידי סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוסולית (ערוץ ירוק, C3-) על ידי השטח שנכבש על ידי סלמונלה תוך-תאית כוללת (ערוץ אדום, C2-).
2. אנליזה של תא בודד
   1. פתח את הקובץ Acquisition.czi ב- ImageJ, בשם AcquisitionTitle בסקריפט: תפריט קובץ > פתח > Acquisition.czi. ייפתח חלון המציג את התמונות של כל הערוצים וכל מישורי z.
   2. פצלו את הערוצים לפי תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים. הערוצים מוצגים כעת בחלונות מופרדים, שנקראים באופן אוטומטי על ידי ImageJ כ- C-AcquisitionTitle. כאן, חלון C1-AcquisitionTitle מתאים לתאי אפיתל (כחול), חלון C2-AcquisitionTitle לסלמונלה תוך-תאית (mCherry), וחלון C3-AcquisitionTitle לתעלת סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוזולית (GFP). כל חלון C-AcquisitionTitle כולל את כל מטוסי ה-z שנרכשו.
   3. לעבד את C1-רכישהTitle חלון, המתאים לתאי אפיתל, לתאי סגמנט.
      1. בחרו בתמונה במישור z שתשמש לפילוח תאים. בחר בחלון C1-AcquisitionTitle והשתמש בתמונה > שכפול: כתוב את מספר מישור ה- z שנבחר (כלומר, 1 כדי לבחור z 1/8), כתוב C1Zplane בתיבה כותרת, בטל את הסימון של Duplicate Stack ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לשכפל את תמונת מישור z שנבחרה בלבד. ייפתח חלון בשם C1Zplane המציג את תמונת ה-z-plane שנבחרה.
      2. עבד את תמונת C1Zplane המתקבלת כדי לשפר את ניגודיות התמונה. תהליך פתוח > שיפור ניגודיות: התאם את הפיקסלים הרוויים (כלומר, כאן נעשה שימוש ב- 1%) וסמן את נרמול. לאחר מכן, לחץ על אישור כדי להחיל את טכניקת שיפור הניגודיות כדי לקבל תמונת C1Zplane מנורמלת ניגודיות.
      3. לעבד את תמונת C1Zplane המנורמלת בניגוד כדי לפלח את תאי האפיתל. השתמשו ב-Process > Find Maxima כדי לפתוח את התפריט FindMaxima : ראשית, סמנו את בחירת נקודת התצוגה המקדימה כדי להגדיר עמידות לרעש כדי לייחס נקודת מקסימום אחת בלבד לכל תא אפיתל. סמן אל תכלול את Edge Maxima. בחר סוג פלט חלקיקים מקוטעים ולחץ על אישור כדי לקבל C1ZplaneSegmented, תמונה חדשה דמוית מסכה בינארית המציגה כל חלקיק מקוטע לכל נקודת מקסימה מסומנת.
         הערה: האלגוריתם Find Maxima ImageJ משמש לפלח תאים. נקודות מקסימה (שיאי עוצמת פיקסלים) מזוהות על פני התמונה, ועשויות להתאים לתאים. נקבע סף רעש (סובלנות רעש), והאזור הרציף סביב נקודות מקסימה מנותח כדי ליצור תמונה בינארית דמוית מסיכה המגדירה כל חלקיק מקוטע לכל נקודת מקסימום, ומכאן כל תא.
      4. עיבוד תמונה C1ZplaneSegmented ליצירת מסיכה של תאים מקוטעים. השתמשו באפשרות ' נתח' > 'נתח חלקיקים': בחרו באפשרות ' הצג מסיכות ' ו'אל תכלול בקצוות'. התאם את טווח השטח של חלקיקים מקוטעים כך שייכללו במסיכה, בהתאם לפרמטר Size , כדי לא לכלול עצמים המפולחים באופן שגוי, כגון אשכולות תאים ושברי תאים. כדי להבקיע את השטח של עצמים שקוטעו בטעות, השתמשו בכלי עקיבה אחר שרביט בסרגל הכלים: בחרו 'חלקיק' בעזרת השרביט, ולאחר מכן פתחו את 'נתח > מדידה ' כדי למדוד את השטח של עצמים שגויים. הגדר את מרווח הגודל (טווח מוצע 250-1700 פיקסלים²) ולחץ על אישור כדי להשיג את המסכה הבינארית MaskofC1ZplaneSegmented .
      5. כברירת מחדל, למסיכה הבינארית MaskOfC1ZplaneSegmented יש LOT הפוך. השתמש ב - LUT > הפוך LUT בסרגל הכלים.
      6. עבד את המסיכה הבינארית MaskOfC1ZplaneSegmented כדי לתקן סגמנטציה של תאים:
         1. תמונת C1Zplane מנורמלת ניגודיות סף שהתקבלה בשלב 4.2.3.2. השתמש/י בתמונה > ״ התאם את סף >״: סמן /י ״רקע כהה״. הגדר את הגדרת הסף האוטומטי המהווה ברירת מחדל . בחר באפשרות Red והתאם את ערך החיתוך המינימלי (פס עליון) עד שהתאים יופיעו אדומים לחלוטין, וישאירו רקע כהה (סף = 8,000 מוחל בפרוטוקול זה). לאחר מכן, לחץ על החל כדי להמיר את תמונת C1Zplane המנורמלת בניגודיות לתמונה בינארית עם תאים בלבן והרקע בשחור.
         2. סגמנטציה נכונה של תאים במסיכה בינארית MaskOfC1ZplaneSegmented. השתמש במחשבון תמונה > תהליך: בחר MaskOfC1ZplaneSegmented כתמונה1, בחר את הפעולה AND ברשימה הנפתחת ולאחר מכן בחר את C1Zplane המנורמל בניגודיות כתמונה2. לחץ על OK. תמונת הפלט נקראת באופן אוטומטי על-ידי ImageJ כתוצאות של מסיכה של C1Zplane מקוטע.
      7. תוצאות תהליך של מסיכה של C1Zplane מפולחת כדי לתייג כל תא בעל מקטע יחיד כאזור עניין (ROI). השתמש לנתח > לנתח חלקיקים. התאם את הגודל כמו בשלב 4.2.3.4 ולאחר מכן בחר באפשרות לא הצג דבר. סמן את הוסף למנהל כדי להוסיף את כל החלקיקים (תאים מקוטעים) לכלי ROI Manager. כמו כן, סמן את אל תכלול בקצוות. לחץ על OK. תפריט ROI Manager יציג רשימה של כל החלקיקים (תאים מקוטעים), המוגדרים כ-ROIs, המסומנים באופן ייחודי עם הקואורדינטות y ו-x שלהם בהתאמה.
      8. שמור נתוני ROI כ- ROI-תאים-רכישהTitle.zip דרך תפריט מנהל ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה על עוד > לשמור. ROI-תאים-רכישהTitle.zip ייפתח בשלב 4.2.4.6 עבור ניתוח תא בודד.
   4. לעבד את C2-רכישהTitle חלון (כאן ערוץ אדום), המתאים תוך-תאי Salmonellaeכדי למדוד את מספר התאים הנגועים ואת עומס הוואקולאר התוך-תאי.,
      1. הפחת את הערוץ הירוק (C3-) מהערוץ האדום (C2-) כדי להסיר פיקסלים מחוץ למיקוד של סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוזולית.
         1. השתמש בתהליך > במחשבון התמונות. בחר C2-Acquisitiontitle כתמונה1, בחר את הפעולה הפחת ברשימה הנפתחת ולאחר מכן בחר C3-Acquisitiontitle כתמונה2. בדוק צור חלון חדש ולחץ על אישור.
         2. להחיל חיסור על כל z-stack על ידי לחיצה על כן במחסנית התהליך? חלון. חלון הפלט נקרא ResultsOfC2AcquisitionTitle בסקריפט.
      2. תוצאות תהליךOfC2AcquisitionTitle כדי להפחית רעש אקראי.
         1. שכפל את החלון ResultsOfC2AcquisitionTitle על ידי לחיצה על תפריט תמונה > שכפול. בדוק את מחסנית כפולה ולחץ על אישור כדי להשיג את החלון ResultsOfC2AcquisitionTitle1 .
         2. החל טשטוש גאוס על החלון תוצאותOfC2AcquisitionTitle1 באמצעות תהליך > מסנן > טשטוש גאוס. השאר את ערך סיגמא כ- 2 או התאם אותו אישית (כלומר, כאן נעשה שימוש בסיגמא: 4). לחץ על אישור והחל טשטוש גאוס על כל z-stack על ידי לחיצה על כן בחלון מחסנית תהליך? .
         3. הפחת את התוצאות המסוננות של גאוסOfC2AcquisitionTitle1 לתוצאותOfC2AcquisitionTitle על ידי לחיצה על מחשבון תמונה > תהליך. בחר תוצאותOfC2AcquisitionTitle כתמונה1, בחר את הפעולה חיסור ברשימה הנפתחת ולאחר מכן בחר תוצאותOfC2AcquisitionTitle1 כתמונה2. לחץ על OK. החל חיסור על כל z-stack על ידי לחיצה על כן במחסנית התהליכים? כדי לקבל חלון שנקרא באופן אוטומטי על ידי ImageJ כתוצאות של C2-AcquisitionTitle.
      3. לעבד את התוצאות של C2-AcquisitionTitle כדי להפריד סלמונלה מהרקע. השתמשו ב'> תמונה' באפשרות ' התאם > סף': בדקו את 'רקע כהה ' והגדירו את הסף האוטומטי של Otsu . התאם את ערך החיתוך המינימלי (הפס העליון) עד שהסלמונלה תופיע אדומה לחלוטין, ותשאיר רקע כהה (סף = 100 מוחל בפרוטוקול זה). לחץ על החל וה- המר לחלון בינארי ייפתח: בדוק רקע שחור ולאחר מכן לחץ על אישור. מחסנית z המלאה מומרת כעת לתמונות בינאריות.
      4. בחר את מישור Z האמצעי, המתאים למישור המיקוד של סלמונלה vacuolar, בתוצאות של תוצאות החלון הבינארי C2-AcquisitionTitle משלב 4.2.4.3: Image > Stacks > Set Slice וכתוב את מספר מישור z המועדף (לדוגמה, כאן z: 4/8 משמש). לחץ על OK.
      5. הגדר את המדידות לרישום עבור כל ROI (תא). השתמש באפשרות 'נתח > הגדר מדידה': בדוק את האזור, המתאים לשטח הכולל של כל החזר על ההשקעה. בדוק את שבר האזור ואת הגבל לסף כדי לתעד רק את שבר האזור שנכבש על-ידי פיקסלים בעלי סף (סלמונלה תוך-תאית) עבור כל החזר השקעה. בדוק את תווית התצוגה כדי להוסיף תווית לכל החזר השקעה בודד עם כותרת התמונה, הערוץ, מישור z וקואורדינטות x-y בטבלת התוצאות.
      6. לעבד את מישור ה-z הנבחר של סלמונלה תוך-תאית לחברות תקליטים, אזור ו%שטח שנכבש על-ידי סלמונלה עבור כל תא בודד (ROI): פתח את קובץ ההחזר על ההשקעה-תאים-רכישהTitle.zip שנשמר בשלב 4.2.3.8, לפי קובץ > פתח ולחץ על מדוד בתפריט מנהל החזר ההשקעה. הפלט הוא טבלה המדווחת על המדידות שנבחרו.
      7. שמור את טבלת התוצאות באמצעות > 'שמור בשם ' בחלון התוצאות.
      8. פתח טבלת תוצאות בגיליון אלקטרוני: שטח התווית ו%השטח שנכבש על-ידי סלמונלה תוך-תאית מסומנים עבור כל החזר השקעה, המתאים לתא קווי מתאר המזוהה באופן ייחודי עם קואורדינטות x ו- y.
      9. מדוד את מספר התאים הנגועים המתאימים ל- ROIs המציגים %שטח > 0 תפוס על ידי פיקסלים סף, המתאים לסלמונלה (כלומר, כאן נחשב %שטח > 0.2% לזיהוי תאים נגועים). לאחר מכן, חשב את אחוז התאים הנגועים על סך התאים.
      10. מדוד את העומס הוואקולארי של סלמונלה/תא על ידי חישוב %השטח הממוצע שנכבש על ידי סלמונלה vacuolar עבור כל התאים הנגועים.
   5. עיבוד ערוץ ירוק (C3-AcquisitionTitle) כדי למדוד את מספר התאים המציגים סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוסולית. בצע את השלבים 4.2.4.2 עד 4.2.4.9, אך עם כמה שינויים.
      1. עבודה על מישורי z העליונים (כאן z:7/8), שכן תאים המראים סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוזולית בולטים מהמונולייר; לכן, הם מתמקדים במישור שונה בהשוואה לתאים ללא סלמונלה משתכפלת יתר על המידה.
      2. מדוד את מספר התאים המכילים סלמונלה היפר-משוכפלת ציטוזולית (ירוקה) על-ידי ניקוד תאים (ROIs) המראים %גבוה של שטח תפוס על-ידי סלמונלה (לדוגמה, %שטח >-20% נחשב לזיהוי תאים המכילים סלמונלה היפר-משתכפלת ציטוזולית). לאחר מכן, חשב את אחוז התאים המכילים היפר-שכפול ציטוזולי - סלמונלה על סך התאים הנגועים שקיבלו ציון בשלב 4.2.4.9.

תוצאות

זיהום של תאי אפיתל עם זני סלמונלה
פרוטוקול זה פותח כדי לנתח את הפלישה התאית ואת השכפול הציטוזולי (איור 1A) לעומת עומס vacuolar (איור 1B) של סלמונלה בתוך תאי אפיתל. הפרוטוקול אומת על ידי שימוש בשלושת זני הסלמונלה הבאים, S. טיפימוריום SL1344 זן ייחוס (S. תמ), ס. דרבי ER1175 wildtype (S. Derby wt) והמוטציה האיזוגנית של S. דרבי ER1175 ללא גן sipA (S. דרבי ΔsipA). זן S. Derby ER1175 בודד מחזירים ושייך לאוסף המעקב של IZSLER של סלמונלה מבודדת. הזנים נבחרו על מנת לייצג את מגוון הפנוטיפ המכוסה על ידי הפרוטוקול. בפרט, זנים אלה נבחרו מכיוון שהתנהגותם בתוך תאי אפיתל כבר הייתה ידועה כשונה במונחים של פלישה או שכפול⁹; לכן, הם היו בקרות חשובות כדי לבדוק אם הפרוטוקול מותר להבחין כמותית הבדלים בפנוטיפים סלמונלה תוך תאית. בפרט, S. ת"מ ו-ס'. דרבי wt נכללו כי הוכחנו בעבר כי S. ל-Tm יש יעילות פלישה ושכפול תוך-תאית גבוהה יותר מאשר ל-S. דרבי^{wt 9} בעוד S. Derby Δ sipA נוסף כזן פגום בהיפר-שכפול מכיוון שאפקט הווירולנציהSipA ממלא תפקיד מכריע בתחילתו של היפר-שכפול^10,11. זה דווח בעבר עבור S. Tm שכפול ציטוזולי מתחיל 4 שעות לאחר הפלישה, ואז האוכלוסייה הציטוזולית משתכפלת במהירות כדי למלא את תא האפיתל ב-8 שעות^11,12. באופן עקבי, זיהום באורך 8 שעות היה מתאים כדי לבחון ולכמת את פנוטיפ ההיפר-שכפול הציטוזולי גם ב-S. דרבי wt ו- S. Derby ΔsipA.

ניתוח שטח
ניתוח השטח בשלב 4.1 מספק מדידה של ההתיישבות הכוללת של תאי אפיתל על ידי סלמונלה (יחס זיהום), יחד עם מדידה של היפר-שכפול (יחס היפר-שכפול). בתהליך העבודה של ניתוח האזור המתואר באיור 2, הרעש האקראי מופחת, ואז הערוצים מפוצלים ומעובדים באופן עצמאי. נקבע סף לכל אחד מהערוצים כדי לא לכלול את הרקע במדידת השטח. לאחר מכן, השטח שנכבש על ידי פיקסלים סף נמדד עבור כל ערוץ. הפלט של ניתוח שטח הוא טבלה המדווחת, עבור כל קובץ רכישה, על הרחבת האזורים שנכבשו על ידי גרעיני תאי אפיתל (ערוץ כחול), סלמונלה מבטאת צ'רי תוך תאית (תעלה אדומה), וסלמונלה היפר-משוכפלת ציטוזולית המבטאת GFP (ערוץ ירוק) יחד עם mCherry. יחס ההדבקה מחושב על ידי חלוקת השטח שנכבש על ידי סלמונלה המבטאת mCherry על ידי השטח שנכבש על ידי גרעיני התא המארח. תוצאות הזנים שנבדקו הראו כי S. Tm מציג יחס זיהום גבוה משמעותית בהשוואה לשני S. זני דרבי, כצפוי (איור 3A). לכן, תוצאות אלה מדגימות את היעילות של ניתוח שטח באיתור הבדלים ביכולתם של זני סלמונלה ליישב תאי אפיתל. יחס שכפול יתר של סלמונלה נמדד על ידי חלוקת השטח שנכבש על ידי סלמונלה המבטאת GFP על ידי האזור שנכבש על ידי סלמונלה מבטאת mCherry תוך תאית. באופן עקבי עם התפקיד של SipA בקביעת שכפול יתר, יחס היפר-שכפול מופחת באופן משמעותי עבור S. זן דרבי ΔsipA נמדד בהשוואה ל-S. דרבי wt, (איור 3B). לא נצפה הבדל של שכפול יתר בין S. ת"מ ו-ס'. דרבי wt. באופן כללי, ניתוח שטח חשף למעשה רמות שונות של שכפול יתר בין הזנים שנבדקו.

אנליזה של תא בודד
האנליזה החד-תאית מאפשרת לכמת את פלישת הסלמונלה ואת העומס הוואקולארי לעומת שכפול ציטוזולי בתוך תאי אפיתל ברזולוציה של תא בודד. כפי שמתואר בשלב 4.2, עבור כל קובץ רכישה, ערוצים כחולים, אדומים וירוקים עובדו באופן עצמאי (איור 4). באופן ספציפי, הערוץ הכחול, המתאים לתאי אפיתל, עובד בשלב 4.2.3 כדי לקבל סגמנטציה של תאים. לאחר מכן, תאים מפולחים נוספו למנהל אזור העניין (ROI) כדי לקבל רשימה של ROIs, המתאימה לכל התאים המפולחים המסומנים באופן ייחודי עם קואורדינטות y-x. על מנת להסיר פיקסלים מחוץ למיקוד של GFP - המבטאים שכפל יתר על המידה סלמונלי, הפיקסלים של הערוץ הירוק הופחתו מאלו של הערוץ האדום. טבלת הפלט של ניתוח תאים בודדים מדווחת, עבור כל ROI, השטח והאחוז של שטח ההחזר על ההשקעה שנכבש על ידי סלמונלי המבטא את הכתב המכונן mCherry בלבד או את הכתב המגיב לציטוזול GFP. אחוז השטח של התא שנכבש על ידי mCherry בלבד המבטא סלמונלה עובד בשלב 4.2.4 כדי לחשב את אחוז התאים הנגועים ואת העומס הממוצע של vacuolar (איור 5A). ניתוח של עומס vacuolar הראה כי S. זני דרבי מייצרים עומס וואקולאר ממוצע נמוך משמעותית מ-S. Tm (איור 5B). לעומת זאת, רק ירידה קלה ולא משמעותית של אחוז התאים הנגועים נצפתה ב- S. זני דרבי בהשוואה ל-S. Tm (איור 5A). אחוז השטח של התא שנכבש על ידי סלמונלה המבטאת GFP עובד בשלב 4.2.5 כדי לקבל את קצב שכפול יתר. לא נצפה הבדל בין ס'. ת"מ ו-ס'. דרבי wt, בעוד S. Derby Δ sipA הציג ירידה משמעותית של שכפול יתר, העולה בקנה אחד עם התוצאה של ניתוח השטח (איור 5C) והתפקיד שלSipA בגרימת שכפול יתר.

איור 1: שכפול יתר ציטוזולי של סלמונלה ועומס vacuolar. מוצגות תמונות מייצגות של (A) שכפול יתר של סלמונלה ו-(B) עומס הוואקולאר שנרכש בהגדלה גבוהה (פי 40). לוח B מציג את מישורי המיקוד השונים של תאים המכילים סלמונלה המשכפלת יתר על המידה (z:7/8), בהשוואה לסלמונלה שאינה משתכפלת יתר על המידה (z:4/8). פסים בקנה מידה לבן הם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: זרימת עבודה של ניתוח האזור. זרימת העבודה של ניתוח האזור מוצגת לרכישה מייצגת בהגדלה נמוכה (פי 10) של תאי INT407 הנגועים במשך 8 שעות בסלמונלה הנושאת את פלסמיד pCHAR-Duo (MOI 100). ראשית, הרעש האקראי מצטמצם, ולאחר מכן הערוצים מפוצלים ל- C1, C2 ו- C3 ומעובדים באופן עצמאי. לכל ערוץ נקבע סף כדי לא לכלול את הרקע באזור המדידה. לאחר מכן, האזור שנכבש על ידי הפיקסלים הסף בלבד - המתאימים לגרעיני התאים ב- C1, כל הסלמונלה התוך-תאית ב- C2, וסלמונלה ציטוזולית ב- C3 - נמדד עבור כל ערוץ. התמונות שנותחו כאן הן תוצאות של ארבעה אריחים שנרכשו בהגדלה של פי 10 שהתמזגו זה בזה על ידי תפירה. פסים בקנה מידה לבן הם 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: תוצאות ניתוח האזור. תוצאות ניתוח השטח מוצגות. (A) יחס הזיהום מחושב על ידי חלוקת השטח שנכבש על ידי סלמונלה המבטאת mCherry (ערוץ C2), המייצג את כל החיידקים התוך-תאיים, על ידי האזור שנכבש על ידי גרעיני התא המארח (ערוץ C1). (B) יחס שכפול יתר נמדד על ידי חלוקת השטח שנכבש על ידי סלמונלה מבטאת GFP (ערוץ C3), המייצג חיידקים היפר-שכפולים ציטוזוליים בלבד, על ידי האזור שנכבש על ידי כל הסלמונלה המבטאת mCherry תוך תאית. כל נקודה מייצגת שכפול. הניתוח נערך על שלושה שכפולים ביולוגיים, שכל אחד מהם נבדק במשולש. הקווים השחורים מציינים את הערכים הממוצעים. המשמעות חושבה באמצעות מבחן t דו-זנב, וערכי p מדווחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: זרימת עבודה של ניתוח תא בודד. זרימת העבודה של ניתוח התא הבודד מוצגת עבור רכישה מייצגת בהגדלה גבוהה (40x) של תאי INT407 הנגועים במשך 8 שעות בסלמונלה הנושאת את פלסמיד pCHAR-Duo (MOI 100). ראשית, הערוצים מפוצלים ל- C1, C2 ו- C3 ומעובדים באופן עצמאי. ערוץ כחול (C1), המתאים לתאי אפיתל, מעובד כדי לקבל סגמנטציה של תאים, ולאחר מכן כל תא מקוטע מוגדר כאזור עניין (ROI) המסומן באופן ייחודי עם קואורדינטות y-x. הערוץ האדום (C2) מעובד על ידי חיסור הערוץ הירוק (C3) כדי להסיר סלמונלי היפר-שכפול ציטוזולי מחוץ למיקוד, משאיר את כל הסלמונלי vacuolar מבטאים mCherry בלבד, ואז רעש אקראי הופחת, והסף מוגדר כך שלא יכלול את הרקע מהמדידות. לבסוף, השטח שנכבש על ידי סלמונלה vacuolar עבור כל ROI נמדד. הערוץ הירוק (C3), המתאים לסלמונלה הכוללת המבטאת GFP ציטוזולית, מעובד באופן דומה. התמונות שנותחו כאן הן תוצאות של 16 אריחים שהתמזגו זה בזה על ידי תפירה. פסים בקנה מידה לבן הם 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: תוצאות של ניתוח חד-תאי. התוצאות של ניתוח התא הבודד מוצגות. (A) אחוז התאים הנגועים מתקבל על ידי חלוקת מספר התאים עם אחוז מהשטח המאוכלס על ידי mCherry בלבד המבטא סלמונלי> 0.2 במספר התאים הכולל. (B) העומס הממוצע של vacuolar הושג על ידי חישוב שטח האחוזים הממוצע שנכבש על ידי mCherry בלבד המבטא סלמונלה בתאים הנגועים. (C) קצב שכפול היתר חושב על ידי חלוקת מספר התאים עם אחוז מהשטח שנכבש על ידי סלמונלי המבטא GFP ≥20% במספר הכולל של תאים נגועים. מדווחים נתונים משלושה עד ארבעה שכפולים ביולוגיים שנבדקו במשולש. העמודות מציינות את שגיאת התקן של המדידה. המשמעות חושבה באמצעות מבחן t דו-זנב, וערכי p מדווחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: תסריט ניתוח שטח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: סקריפט ניתוח של תא יחיד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

האופן שבו סלמונלה מאכלסת תאי אפיתל במעיים, משפיע על תוצאת הזיהום. עם הפלישה, שכפול יתר ציטוזולי גורם לדלקת במעיים³, ואילו שכפול vacuolar יכול להוביל להתפשטות מערכתית⁴. זני סלמונלה יכולים להשתנות ביכולתם לפלוש ולשכפל בתוך תאי אפיתל מעיים⁹. ואכן, סלמונלה היא סוג מגוון ביותר הכולל יותר מ -2,500 סרוברים, אשר יש יכולות שונות לגרום למחלות. בנוסף, סלמונלה היא הגורם המדווח ביותר של התפרצויות מזון באיחוד האירופי, המציין התפשטות גדולה באוכלוסייה האנושית¹. לכן, הזמינות של שיטות אמינות בתפוקה גבוהה לכימות הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה היא בעלת חשיבות רבה להערכת ההבדלים באלימות בין מספר גדול של זני סלמונלה ובסופו של דבר לאפשר הערכת סיכונים מדויקת וספציפית לזן של פתוגן זה.

הפרוטוקול המתואר כאן מודד את ההתנהגות של סלמונלה בתוך תאי אפיתל בצורה מהירה ואוטומטית. הזיהום של תאי אפיתל מבוצע במיקרו-לוחות הדמיה של 96 בארות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי משמש לרכישת תמונה, מה שהופך את הפרוטוקול למתאים ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מנצל את פלסמיד pCHAR-Duo, המאפשר להבחין בין vacuolar לבין סלמונלה ציטוזולית באמצעות ביטוי דיפרנציאלי של שני כתבים פלואורסצנטיים⁵. הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה מנותחים לעתים קרובות על ידי ניקוד ידני, הליך גוזל זמן שאינו מתאים לניתוח של מספר רב של זנים ותרביות תאים לכל זן ונוטה לטעויות מפעיל ולשונות בין-מפעילה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו שני ניתוחי תמונה משלימים ואוטומטיים, ניתוח השטח וניתוח התא הבודד. ImageJ, תוכנה זמינה באופן חופשי, שימשה לפיתוח שני הניתוחים. על מנת להאיץ את ביצוע הפרוטוקול, סקריפטים של ImageJ לניתוח אצווה של קבצי רכישה מרובים ללא התערבות מפעיל מסופקים כקבצים משלימים.

ניתוח השטח נועד לכמת, בכמה שלבים, את ההתיישבות הכוללת של תאי אפיתל (יחס זיהום) ואת רמת ההיפר-שכפול (יחס היפר-שכפול) באמצעות מדידת האזורים שנכבשו במיוחד על ידי גרעיני תאי אפיתל ועל ידי סלמונלה המבטאים mCherry או mCherry יחד עם GFP. ניתוח השטח מיושם על תמונות שנרכשו בהגדלה נמוכה, כאשר גם סלמונלי vacuolar וגם Salmonellae היפר-שכפול נמצאים במוקד באותו מישור z, ומספר רב של תאי אפיתל מוצג לכל שדה מיקרוסקופי, מה שמקטין את הגודל והמספר של קבצי הרכישה. ניתוח השטח מאפשר אנליזה אוטומטית, מהירה וקלה חישובית של מספר רב של דגימות, מה שהופך אותו למתאים לבדיקות בתפוקה גבוהה כגון ניסויי סינון.

האנליזה החד-תאית נועדה לכמת פנוטיפים של סלמונלה בתוך תאי אפיתל ברזולוציה חד-תאית, המתקבלת באמצעות פילוח תאים ומדידה של האזור התאי ואחוז השטח שנכבש על ידי סלמונלה ואקולארית וציטוזולית. ההתיישבות הכוללת של תאי אפיתל המאופיינת באמצעות ניתוח השטח מחולקת כאן לשלושה פרמטרים כמותיים, אחוז התאים הנגועים, עומס הוואקולאר הממוצע וקצב השכפול ההיפר, המאפשרים להעריך ולכמת את תרומתו של כל פנוטיפ לקולוניזציה הכוללת, ולכן, להשלים את תוצאות ניתוח האזור. הפרטים הגדולים יותר שמציע הניתוח החד-תאי באים במחיר של רכישה וניתוח איטיים יותר של תמונות. למעשה, על מנת להשיג רזולוציה של תא בודד, רכישת התמונה מתבצעת בהגדלה גבוהה. משמעות הדבר היא כי יש צורך במישורי z מרובים כדי לבחון הן סלמונלה vacuolar והן סלמונלה ציטוסולית במיקוד וכי יש צורך ברכישת מספר רב של שדות לכל דגימה כדי להבקיע מספר גבוה של תאי אפיתל, ובכך להאריך את זמן הרכישה בהשוואה לניתוח שטח. יתר על כן, ניתוח של מספר קבצי רכישה גדולים הוא תובעני מבחינה חישובית, ולכן דורש תחנת עבודה מתאימה (תחנת עבודה 6 ליבות, 32 GB RAM שימש). לכן, ניתוח של תא בודד יכול לשמש כעצמאי בתנאי תפוקה מוגבלים או כשיטה ברמה שנייה המשולבת לניתוח האזור כדי להשיג הבנה מעמיקה יותר של פנוטיפים של סלמונלה בתוך תאי אפיתל.

שני הניתוחים המשלימים אומתו באמצעות S. תמ, ס. דרבי wt, ו- S. Derby ΔsipA, שנבחר משום שהתנהגותם בתוך תאי אפיתל כבר הייתה ידועה כשונה מבחינת פלישה או שכפול ^9,10. תוצאות האזור וניתוחים חד-תאיים מראים כי הפרוטוקול איפשר להבחין באופן כמותי בהבדלים בפנוטיפים של סלמונלה תוך תאית בהתאם למאפייני הזנים שנבדקו. יתר על כן, תוצאות אלה מראות כי ניתוח התא הבודד מאפשר לכמת את התרומה של כל פנוטיפ תוך תאי (פלישה, עומס vacuolar ושכפול ציטוזולי) להתיישבות הכוללת שהושגה באמצעות ניתוח האזור.

פרוטוקול זה יושם כאן כדי לחקור פתוגניות במבחנה של זנים שונים של סלמונלה, אך יכולים להיות לו יישומים אחרים כגון מחקר של מוטציות אקראיות לזיהוי גנים המעורבים בפלישה ו/או שכפול בתוך תאי אפיתל. בנוסף, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי לנתח את ההתנהגות של סלמונלה בתוך קווי תאים אחרים מאשר תאי INT407. זה יכול לשמש גם כנקודת מוצא לפיתוח שיטות דומות לחקר אינטראקציה בין תאים לפתוגנים של מיקרואורגניזמים תוך-תאיים אחרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרופלטת הדמיה 96 בארות	Eppendorf	30741030	תרבית תאים וזיהום
Ampicillin	Sigma-Aldrich	59349	תרבית חיידקים
Axio צופה מיקרוסקופ הפוך	ZEISS		מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי
Axiocam 305	מצלמת מיקרוסקופ	ZEISS
קרום	איטום נושםSigma-Aldrich	Z380059	בדיקת זיהום
Colibrì 5/7	ZEISS		Led מקור אור
קולגן I זנב עכברוש	Life Technologies	A1048301	ציפוי קולגן
DAPI	Invitrogen	D3571	צביעת תאים
סרום בקר עוברי	Gibco	10099-141	תרבית תאים וזיהום
ג'נטמיצין	Sigma-Aldrich	G12664	בדיקת זיהום
חומצה אצטית קרחונית	Carlo Erba		ציפוי קולגן
401391 HCS CellMask Blue	Invitrogen	H32720	צביעת תאים
ImageJ	המכונים הלאומיים לבריאות והמעבדה למכשור אופטי וחישובי (LOCI, אוניברסיטת ויסקונסין)		תוכנת עיבוד תמונה
מינימום חיוני Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	M5650-500ML	תרבית תאים וזיהום
Paraformaldehyde 4%	Invitrogen	FB002	קיבוע תאים
אשלגן כלורי	PanReac AppliChem	131494.1211	הכנת PBS
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Sigma-Aldrich	60220	הכנת PBS
נתרן כלוריד	PanReac AppliChem	131659.1214	תרבית חיידקים והכנת PBS
נתרן פוספט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	71640	הכנת PBS
בקבוק תרבית רקמות 25 ס"מ2 מכסה בורג אטם תקע	Euroclone	ET7025	תרבית תאים
Triton X-100	Biorad	1610407	צביעת תאים
טריפסין-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	תרבית תאים וזיהום
תרבית חיידקי	LP0042B אוקסואיד		טריפטון
תמצית שמרים	תרבית חיידקי	Biolife	4122202