Method Article

מיפוי צפיפות ה-DNA המוחלטת בגרעיני התא באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה בודדת

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המודדת צפיפות DNA מוחלטת בתוך גרעיני תאים דבקים באמצעות טסלציה של וורונוי של נתוני מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת, נפח ידוע, גודל גנום ושלב מחזור התא.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתוך גרעין התא, גנים שקטים ממוקמים בדרך כלל באזורי כרומטין בעלי צפיפות גבוהה הנקראים הטרוכרומטין, בעוד שגנים פעילים יכולים להימצא בעיקר בממשק בין כרומטין לחלל הבין-כרומטין הנקרא אוכרומטין. נכון לעכשיו, האפיון של eu- והטרוכרומטין מבוסס בעיקר על שינויים אפיגנטיים של חלבוני היסטון לאורך רצף ה-DNA, בעוד שמעט ידוע על צפיפות DNA מוחלטת על פני גרעין התא והשלכותיהם התפקודיות. מודלים של הגרעין המבוססים אך ורק על נתונים ביוכימיים והנחות לגבי טבעו של כרומטין כפולימר עדיין שונים באופן מהותי מנתוני הדמיה שנוצרו על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. זה מצביע על כך שעדיין חסר מידע חשוב רלוונטי מבחינה מבנית. אנו מאמינים כי אילוצים מרחביים עשויים להיות מעורבים בוויסות גנים ולכן פיתחנו שיטה המאפשרת מדידה של צפיפות DNA מוחלטת בגרעיני תאי יונקים על ידי הפיכת נתוני לוקליזציה ברזולוציה גבוהה למפות צפיפות אמיתיות לקנה מידה על ידי טסלציה של וורונוי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז ימיה הראשונים של הביולוגיה של התא, גרעין התא - מקום מושבו של המידע הגנטי - ריתק ביולוגים. לאחר יישום שיטות צביעה ציטולוגיות שפותחו בעצמו, אמיל הייץ גילה בשנת 1928 אזורים מוכתמים באופן שונה ואינטנסיבי בתוך גרעין התא1. הוא כינה את האזורים הצפופים והצפופים יותר "הטרוכרומטין", בעוד שהוא קרא לאזורים המוכתמים פחות חזק ופחות צפופים "אוכרומטין". עם הזמן התברר כי גנים פעילים ממוקמים בעיקר באוכרומטין, בעוד שאזורים צפופים יותר נמצאו עשירים באלמנטים חוזרים וגנים שקטים. המונחים הטרוכרומטין ואאוכרומטין שרדו עד ימינו, אם כי הגדרתם השתנתה מתכונות מבניות למולקולריות (ראה להלן). כיום אנו יודעים שגרעין התא מחולק לשני שלבים עיקריים. נוזל אחד (תא האינטרכרומטין), המאכלס את הגופים הגרעיניים, תא השחבור והנוקלאופלזמה, והשני המוצק, דמוי הידרוג'ל - תחום הכרומטין, הכולל את שטחי הכרומוזום והגרעינים2. בממשק לחלל האינטרכרומטין, הכרומטין פחות צפוף, וכאן מתרחשים בעיקר התהליכים הפעילים גנטית כמו שעתוק, שכפול ותיקון 3,4,5, בעוד שבסמוך ללמינה, סביב הגרעינים וליד הצנטרומרים, הכרומטין מראה רמות דחיסה גבוהות ובאופן כללי הוא די לא פעיל מבחינה שעתוק6.

ברמה המולקולרית, הכרומטין בנוי מ-DNA עטוף סביב נוקלאוזומים (אוקטמר של חלבוני היסטון ליבה). להיסטונים יש תחומי זנב לא מסודרים באופן מהותי הניתנים לשינוי לאחר תרגום על ידי הוספת מספר קבוצות כימיות (מתיל-, אצטיל, זרחן-, ביוטין), חומצות אמינו (ארגינין), או אפילו חלבונים (SUMO, יוביקוויטין)7. שינויים אלה יכולים להיקרא ולמשוך חלבונים אחרים (למשל, משחזר כרומטין, HP1, חלבוני תיקון, RNA) ובכך להגדיר את המצב הפיזיולוגי של רצף ה-DNA (מתירני/מגביל מבחינת שעתוק), מבלי לשנות ישירות את הרצף שלו (לכן "אפי"גנטי)7. סוג ומספר השינויים סביב רצף ספציפי יכולים להיות שונים מאוד בין סוגי התאים, הם הפיכים ויכולים להשתנות במהלך ההתפתחות, ההזדקנות והמחלה 8,9,10. ישנם שינויים של זנבות היסטון הנפוצים יותר באזורים מתועתקים מאוד ושינויים השולטים באזורים בגנום שיש להם פעילות שעתוק מועטה או ללא פעילות שעתוק.

לדוגמה, אזורים מתועתקים מאוד העשירים בשינויים ב-H3K4 או שזנבות ההיסטון שלהם אצטיליים מתוארים בדרך כלל כאוכרומטין, בעוד שאזורים עשירים בשינויים דכאניים בהיסטון (H3K9me3, H3K27me3 או H4K20me3) מכונים הטרוכרומטין, המחולק עוד יותר להטרוכרומטין מכונן (לא פעיל מבחינה תעתיקית בכל התאים) (למשל, H4K20me3) והטרוכרומטין פקולטטיבי (כרומטין מושתק בהתאם לסוג התא, למשל, H3K27me3)6. למרות ששיטות ביוכימיות וביולוגיות מולקולריות מתאימות מאוד למדידת שינויים כימיים ברמת הרצף, זה הרבה יותר מאתגר להשתמש בהן כדי להצהיר הצהרות על תכונות מרחביות בקנה מידה בינוני באמצעות שיטות אלה.

לדוגמה, נעשו ניסיונות באמצעות מידע קרבה מניסויי Hi-C, המזהים וממפים קרבה של DNA בין אזורי רצף, כדי לשחזר מודלים מרחביים של גנום11. עם זאת, השוואה ישירה עם תמונות אור ומיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה מראה שזה אפשרי רק במידה מוגבלת (איור 1). למרות ששיטות כמו Hi-C12, יכולות לזהות טריטוריות כרומוזומים בתאים בין-פאזיים בצורה נכונה כישויות נפרדות, מודלים אלה הם "קצרי רואי" למדי, מכיוון שקרבת רצף ה-DNA לבדה עיוורת כדי לשקף יחסים מרחביים בין חלקים רחוקים יותר של הגנום ולכן אינם מתאימים במיוחד לשחזור גנום תלת מימדי תקין. לכן, הבדלי צפיפות גם אינם יכולים לבוא לידי ביטוי כראוי על ידי מידע על תדר המגע. זה מוביל לייצוגים "ספגטיים" של הגנום בגרעין (ראו איור 1B), שנראים כאילו הם מתרחשים בכדור של לולאות דמויות צמר שנגישות באופן חופשי.

כדי לסלול את הדרך לתמונה אינטגרטיבית ומציאותית יותר של הגרעין המשלבת מידע ביוכימי עם נתונים ביופיזיקליים ומבניים, יש לפתח שיטות המאפשרות הפקת נתונים על היבטים שונים של ארגון גרעיני. עד לאחרונה היה קשה גם לקבוע צפיפות DNA מוחלטת בגרעיני התאים מנתוני הדמיה. הסיבות לכך היו הרזולוציה המוגבלת של מיקרוסקופי אור קונבנציונליים, בעיות במיקרוסקופ אלקטרונים לצביעה ספציפית של DNA, ונפחי התצפית הקטנים במיקרוסקופ אלקטרונים.

הרזולוציה של מיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונבנציונליים מוגבלת על ידי עקיפה של אור. התמונה של מקור אור נקודתי מפוזרת עקב מגבלת העקיפה וניתן לתאר אותה על ידי פונקציית התפשטות נקודתית (PSF). על פי ה-PSF, הדימוי של פלואורופור, שניתן להתייחס אליו בקירוב טוב כמקור אור נקודתי, תופס נפח בגודל מסוים סביב מקור המקור שלו (פלואורופור)13. כאשר פלואורופורים רבים, הממוקמים הרבה יותר קרוב זה לזה מאשר הממדים של התמונות המוגבלות בעקיפה שלהם, נרגשים בו זמנית, התפלגות עוצמת התמונה מונחת על גבי זה, ולא ניתן לפתור את מיקומם של הפלואורופורים הבודדים. פליטת אור רציפה וסטוכסטית מפלואורופורים (מהבהבת) מאפשרת בידוד אופטי של מולקולות בודדות ובכך למצוא את מיקומן המדויק על ידי קביעת מרכזי הכבידה של עוצמת האותות שלהן.

זה יכול לשמש לשחזור מידע מבני של דגימות על ידי הצטברות נתוני לוקליזציה של פלואורופור מתמונות מוקלטות רבות. שיטה זו מכונה בדרך כלל מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת (SMLM) (למידע נוסף ראה14). ככל שפלואורופור פולט יותר פוטונים במהלך ה'זמן' שלו, כך ניתן לקבוע בצורה מדויקת יותר את עוצמת מרכזי הכבידה. עדשות אסטיגמטיות בנתיב האלומה הופכות אותות של פלואורופורים מעל או מתחת למישור המוקד האופטי לאליפסות, שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע את מיקומן לאורך הציר האופטי. הצירים הארוכים של האליפסות שמקורם באותות פלואורסצנטיים מתחת למישור המוקד מסתובבים ב-90 מעלות בהשוואה לצירי האליפסות שמקורם בפלואורופורים מעל מישור המוקד. יתר על כן, יחס הצירים של אליפסות אלו מאפשר לקבוע את מיקום המולקולה לאורך הציר האופטי ביחס למישור המוקד בטווח של ±300 ננומטר15.

איכות התמונות ברזולוציה גבוהה שנוצרו על ידי שחזור אירועי מצמוץ סטוכסטיים תלויה מאוד בצפיפות התיוג ובמספר אירועי המצמוץ. האחרונים תלויים ביציבות הפוטו של הפלואורופורים ובמספר האירועים המהבהבים לפני שהם נכשלים בסופו של דבר (מספר מחזורי הפעלה/כיבוי). השיטה המתוארת כאן להשגת תמונות ברזולוציה גבוהה של התפלגות DNA תוך-גרעינית נקראת fBALM (מיקרוסקופ לוקליזציה מופעל בסיוע כריכה של מבנה DNA). הוא מבוסס על פלואורופורים שמתערבבים באופן חולף לחומצות גרעין ורק לאחר שהם נקשרים ל-DNA16,17. בשל השאריות הטעונות של עמוד השדרה הזרחני שלו, ה-DNA הוא פולימר בעל מטען שלילי גבוה. ייצוב גדילי ה-DNA המשלימים בתאים חיים דורש נטרול על ידי חלבונים טעונים חיובית (למשל, היסטונים) ויונים. על ידי הורדת ה-pH, היציבות של הזיווג המשלים של הבסיסים מצטמצמת כדי לאפשר לצבעים המשולבים להתפזר פנימה והחוצה16,17.

בהתאם לצבע הפלואורסצנטי המשתלב, ניתן להגיע למצב זה בטווח pH מסוים. צבעים פלואורסצנטיים כגון YoYo-1 ו-SYTOX Orange זוהרים רק כאשר הם קשורים ל-DNA ומכיוון שצבעים משולבים (בניגוד לצבעים הקושרים את החריץ הקטן של ה-DNA כגון Hoechst ו-4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]) נקשרים בדרך כלל באופן בלתי תלוי ברצף, הם מתאימים היטב למיפוי התפלגות ה-DNA בתוך גרעיני התא על ידי מיקרוסקופ לוקליזציה.

טסלציה של וורונוי היא שיטה מתמטית המאפשרת חלוקת משנה של החלל למחיצות שונות על סמך מיקום הנקודות. ב-2D-Space, גודל האריחים המתקבלים משקף את ההופכי של הצפיפות של נקודות18. מכיוון שמיקרוסקופ לוקליזציה משחזר תמונות כקבוצה של נקודות המייצגות את מיקומם של פלואורופורים, טסלציה של וורונוי יכולה לסייע בקביעת צפיפות אותות הלוקליזציה (איור 2). לפיכך, שימוש בצבע ספציפי ל-DNA כפלואורופור מאפשר למדוד את צפיפות ה-DNA.

ידע אפריורי של תכולת ה-DNA (מספר זוגות הבסיסים) והממד המרחבי של הגרעין מאפשר להפוך את צפיפות ה-DNA היחסית לצפיפות DNA מוחלטת. הפרוטוקול הבא מציג את מיפוי צפיפות ה-DNA המוחלטת בתאים דבקים באמצעות SMLM ברזולוציה גבוהה מאוד ומדגים כי צפיפויות אלו נתונות לשינויים גדולים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: איור 3 מספק סקירה כללית של זרימת העבודה המתוארת בסעיף זה. עיין בטבלת החומרים לפרטים הקשורים לריאגנטים, החומרים, הציוד והתוכנה המשמשים בפרוטוקול זה. ניתן לצפות ולהוריד את הקוד ששימש לפרסום זה כאן: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. תרבית תאים

  1. לטפח תאי C3H10T1/2, HFB ו-HeLa ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה בתוספת 5% CO2. כאשר התאים קרובים למפגש, תת-תרבית את התאים על ידי פיצולם ביחס של 1:3 (C3H10T1/2, HFB) ו-1:10 (HeLa), בהתאמה.
  2. יום אחד לפני ביצוע המדידות, זרעו את התאים מתרביות שגדלו באופן אקספוננציאלי על צלחת רשת של 35 מ"מ. ודא שצלחות התצפית מספקות איכות אופטית מעולה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית (תחתית זכוכית בעובי של 170 מיקרומטר, #1.5) ובעלות רשת לאיתור תאים באופן חד משמעי. ודא גם שהתאים נמצאים בתרחיף של תא בודד ושכל שטח פני השטח של הצלחת מכוסה בצורה הומוגנית בתאים.
    הערה: מומלץ להשתמש בכלים עם רשת מוטבעת כדי למצוא שוב את התאים המדויקים שהוקצו לשלב מחזור תא מסוים.
  3. אם נדרש על ידי הניסוי, הוסף 100 ננומטר טריכוסטטין A (TSA) למדיום תרבית התאים ודגר את התאים בתנאים שתוארו קודם לכן בשלב 1.1.

2. הכנת מדגם

  1. ביום המדידה, שטפו את התאים פעם אחת עם 1x DPBS לפני קיבועם למשך 30 דקות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x DPBS.
    הערה: לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור, ודא כי מכינים בכל פעם תמיסת PFA טרייה והקפידו במיוחד שריכוז ה-PFA יהיה מדויק.
  2. לאחר הסרת הקיבוע, שטפו את התאים שוב פעמיים עם 1x DPBS לפני שחלחלו אותם למשך 20 דקות ב-1x DPBS המכיל 0.4% טריטון X-100.
  3. הסר את מאגר החדירות בעזרת פיפטה ובצע שלב שטיפה נוסף עם 1x DPBS לפני הטיפול בתאים בקוקטייל RNase (דילול 1:1,000 ב-1x DPBS). מניחים את התאים באינקובטור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח.
  4. הכן את תמיסת הצביעה על ידי דילול תמיסת המלאי SYTOX Orange התומכת ב-fBALM (5 מ"מ ב-1x DPBS בדילול של 1:10,000).
  5. הסר את מאגר ה-RNase באמצעות פיפטה והחל שלב כביסה נוסף עם 1x DPBS לפני הוספת תמיסת הצביעה. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר בתא לח למשך 5 דקות.
  6. הסר את תמיסת הצביעה הכתומה של SYTOX מהתאים בעזרת פיפטה, שטוף עם 1x DPBS ואחסן את התאים ב-1x DPBS, מוגן מפני אור עז.

3. קביעת מחזור תא ציטומטרי

הערה: עבור שלב זה, נעשה כאן שימוש במיקרוסקופ הקרנה הפוך בעל תוכן גבוה, אך ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי בעל שדה רחב הפוך. עוצמת הגרעין כולו היא מדד לתכולת הדנ"א שלו; לפיכך, הקפד לפתוח לחלוטין את חור הסיכה אם אתה משתמש במערכת קונפוקלית. עדשות אוויר אובייקטיביות עם צמצם מספרי נמוך (NA) עדיפות על עדשות אובייקטיביות טבולות בשמן.

  1. הניחו את הצלחת עם התאים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד בבמה ממונעת ותוכנה המאפשרת שחזור של אזורים גדולים על הדגימה על ידי תפירת תמונות שהוקלטו אוטומטית יחד.
  2. בחר עדשה אובייקטיבית המאפשרת הקלטה של מספיק תאים לכל שדה ראייה (לפחות 900 גרעינים בודדים בסך הכל [לפרטים, ראה Roukos et al.19]) כך שניתן יהיה לבצע את רכישת התמונה לקביעת מחזור התא תוך זמן סביר. השתמש בעדשה שאינה מציגה הבדלים גדולים בעוצמה בין המרכז לגבולות. אם עדשה כזו אינה זמינה, החל תיקון שדה שטוח על התמונות (ראה שלב 7). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה רחב המצויד בעדשת אוויר 20x NA 0.4 עם עומק מיקוד = 8 מיקרומטר.
  3. במהלך רכישת התמונה, כסו את האזור המרכזי של המנה באמצעות מסננים מתאימים לפלואורופור המשומש. צלם תמונות שדה בהיר במצב אור משודר.
    הערה: תמונות שדה בהיר חשובות למיקום מחדש של תאים ברשת בשלב 4.6.
  4. מכניסים את המנה עם התאים למקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס עד לשלב 4.4.
  5. שחזר את האזור הסרוק מהתמונות הבודדות על ידי אריחים של התמונות הבודדות המוקלטות.
  6. העבר את נתוני התמונה של כתם ה-DNA הפלואורסצנטי למחשב המריץ את תוכנת הקוד הפתוח CellProfiler4.2.120.
  7. אם יש צורך בתיקון שדה שטוח של תמונות הקרינה, צור תמונת ייחוס של המיקרוסקופ המשומש מהתמונות המוקלטות. פתח את קו הצינור Illumination Correction.cpproj (כלול כקובץ משלים 1); שימו לב שהצינור מופיע כרצף על המסך בו ניתן ללחוץ על שלבים שונים. גרור ושחרר את התמונות לשדה המיועד בתמונות השלב הראשון של הצינור.
    הערה: הקפד לא לכלול את כל הנתונים שאינם תמונה בקבצים המפורטים באמצעות אפשרויות הסינון בחלק התחתון של החלון.
  8. בשלב האחרון של צינור תיקון התאורה, לחץ על שמור תמונות כדי להגדיר מיקום בו יאוחסנו תמונות ההתייחסות, ולאחר מכן, לחץ על כפתור ניתוח תמונות .
  9. פתח את קו הצינור CellCycleAnalysis.cpproj (כלול כקובץ משלים 2). גרור ושחרר את התמונות שהוקלטו בשלב 3.3 (ראה איור 4A כדוגמה), כולל תמונת ההפניה (שלב 3.8), לתוך השדה המיועד בשלב הראשון תמונות של הצינור.
    הערה: הקפד לא לכלול את כל הנתונים שאינם תמונה בקבצים המפורטים באמצעות אפשרויות הסינון בחלק התחתון של החלון.
  10. בשלב CorrectIlluminationApply של הצינור, בחר את תמונת ההפניה בתפריט הנפתח על-ידי בחירה בפונקציה בחר את התאורה.
  11. בשלב האחרון של צינור ניתוח מחזור התא, הגדר מיקום שבו אוחסנה תמונת הייחוס בשלב 3.7 ולחץ על כפתור ניתוח תמונות כדי להתחיל למדוד בתפזורת את עוצמות הקרינה המשולבות של כל הגרעינים בתוך התמונות שהוקלטו בשלב 3.3.
    הערה: CellProfiler4.2.1 יפיק קובץ טקסט "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt", המכיל את הנתונים של כל גרעין שנמדד (תמונה, ObjectID, עוצמת פלואורסצנטיות משולבת, קואורדינטות תמונה) בפורמט CSV.
  12. ודא שהרכיב DisplayHistogram של קו הצינור מסומן כפעיל.
  13. שימו לב לעוצמות הקרינה המשולבות בהיסטוגרמה עבור פסגות G1 ו-G2 (ראה איור 4B כדוגמה) והכניסו את המרווחים סביבם לרכיבי FilteredObjects של הצינור. הפעל את רכיבי הצינור על ידי לחיצה על תיבות הסימון.
  14. הפעל את רכיבי קו הצינור המתאימים של DisplayDataOnImage כדי ליצור תמונה המדגישה את התאים בשלב G1 או G2 ולהפעיל שוב את הצינור (ראה איור 4C כדוגמה).
  15. בחר עד חמישה תאים המייצגים את שלב מחזור התא הרצוי מהתמונה שנוצרה באזור המסומן של תא התצפית ונסה להעביר את התאים במיקרוסקופ SMLM.
    הערה: מכיוון שמשתמשים כאן בשני קווי תאים עם גודל גנום לא ידוע, גדלי הגנום נקבעו על ידי השוואת פסגות G1 של קו תאים פיברובלסטים אנושיים לפסגות G1 של תאי HeLa ו-C3H10T1/2. ניתן לראות את ההיסטוגרמות ואת הקשר הפרופורציונלי בין גדלי הגנום שלהם באיור משלים S1.

4. SMLM-fBALM

הערה: למרות שסכום החמצן נטו בתגובות הביוכימיות המשולבות הללו הוא אפס, מומלץ לבצע את התגובה בצלחת שאינה אטומה, מכיוון שריכוזי חמצן מוגבלים יכולים להאט את ייצור D-glucono-1,5-lactone. הריכוז ההולך וגדל של D-glucono-1,5-lactone מוריד בהדרגה את ה-pH, דבר הכרחי מכיוון שהורדת ה-pH המיידית תשנה את מבנה העל של הדגימה.

  1. הכן 1 מ"ל של מאגר ההדמיה על ידי ערבוב המרכיבים הבאים: 900 מיקרוליטר גלוקוז (1 גרם/מ"ל גלוקוז ב-1x DPBS), 50 מיקרוליטר גלוקוז אוקסידאז (0.5 מ"ג/מ"ל ב-1x DPBS) ו-50 מיקרוליטר קטלאז (40 מיקרוגרם/מ"ל ב-1x DPBS).
  2. הסר את ה-1x DPBS מהדגימה באמצעות פיפטה והוסף 1 מ"ל של מאגר ההדמיה לתוך הצלחת המכילה את התאים.
  3. הרכיב את המנה על הבמה של מיקרוסקופ בעל יכולת SMLM. השתמש בעדשת אובייקט NA גבוהה ובהגדלה אופטית גבוהה.
  4. אתר את אחד הגרעינים שנבחרו (משלב 3.15) באמצעות מערכת הקואורדינטות של המנה ומרכז אותו בשדה הראייה של המצלמה.
    הערה: התגובה האנזימטית אורכת ~60-180 דקות עד שמגיעים ל-pH הנכון לשיטת fBALM ומאפשרת מצמוץ מתאים. מומלץ להרכיב את צלחת התצפית בהקדם האפשרי כדי לספק זמן מספיק לדגימה להסתגל לטמפרטורת המכשיר מכיוון ששינויי טמפרטורה עלולים להוביל לסחיפה צירית. ודא שהטמפרטורה בחדר המאכלס את מיקרוסקופ SMLM יציבה לאורך כל המדידה.
  5. קבע את גובה הגרעין על ידי שינוי המיקוד עם כונן ה-z של המיקרוסקופ והקלטת המיקום של הגבול העליון והתחתון.
  6. בנקודות זמן שונות, בדוק אם יש מצמוץ תקין שנוצר על ידי תהליך fBALM על ידי הגדלת עוצמת הלייזר. לאחר שהדגימה מציגה מצמוץ סטוכסטי תקין, התחל ברכישת סדרת התמונות הדרושה לשחזור ה-SMLM הסופר-רזולוציוני.
    הערה: המיקרוסקופ המשמש ל-fBALM צריך להיות מצויד בלייזרי עירור המתאימים לעורר את הפלואורופור המשומש ויכולים ליצור צפיפות פוטונים גבוהה מספיק כדי להבטיח ספירת פוטונים מספקת לכל מסגרת. בדוק זאת בניסוי פיילוט לפני כל הניסויים האחרים.
  7. לאחר שהובטח מצמוץ תקין של תהליך fBALM, התחל ברכישת סדרת התמונות באמצעות זמן חשיפה של 50 אלפיות השנייה, וכתוצאה מכך קצב פריימים של ~20 פריימים לשנייה.
  8. קח ערימת z דרך הגרעין (סביב החלק האמצעי) עם מרווחי צעדים של 200 ננומטר ורק 500 פריימים לכל קטע אופטי קל. בחזרה לחלק האמצעי, צלם סדרת תמונות של 50,000 פריימים כדי לאסוף מספיק אירועים מהבהבים לשחזור טוב של פרטים מבניים בדיוק לוקליזציה גבוה (זה ייקח ~45 דקות).
    הערה: מחסנית ה-z חשובה כדי לקבוע את החלק של החלק האמצעי של אות ה-DNA ביחס לכל הגרעין. ודא שגודל הפיקסלים האפקטיבי מתאים היטב ל-SMLM22 והאות במצלמה אינו רווי את החיישן.
  9. ודא שהדרישות הבאות מתקיימות
    1. ודאו שמחשב הרכישה כולל מספיק שטח דיסק, שכן גודלן של תמונות של 16 סיביות, בהתאם למספר ולגודל של תמונות של 16 סיביות, גודלי הקבצים של אוספי התמונות יכולים להיות גדולים למדי.
    2. ודא שהמחשב שמפעיל את תוכנת הרכישה יכול לטפל ב-file מערכת בהתקן האחסון המשומש המסוגל לטפל בגדלים גדולים file (>4 GB) ושקצב ההעברה להתקן האחסון גבוה מספיק כדי לכתוב את הקבצים בזמן אמת בעת הקלטה ישירה של נתוני תמונה להתקן האחסון.
    3. בעת שמירת הנתונים לאחר רכישת תמונה, ודא שהמחשב מצויד במספיק זיכרון RAM (למשל, 64 GB).

5. הכנה והקלטה של צלחת עם חרוזים פלואורסצנטיים לכיול z של מיקרוסקופ SMLM

הערה: לכיול צירי נכון של העדשות האסטיגמטיות של המיקרוסקופ כדי להקצות מיקומים נכונים לאורך הציר האופטי, יש לשקול הקלטת ערימות z של חרוזים פלואורסצנטיים של 100 ננומטר.

  1. לדלל חרוזים 1:10,000 ב-1x DPBS ולזרוע חרוזים של 100 ננומטר על אותו סוג צלחת המשמש למדידות SMLM.
    הערה: השתמש רק באיכות ובמפרטים האופטיים הטובים ביותר כגון תלושי כיסוי #1.5.
  2. התקן את צלחת הכיול על המיקרוסקופ; הקלט ערימות תמונות דרך מישור המוקד של החרוזים (~1.5 מיקרומטר בסך הכל; צעדים של 10 ננומטר המשמשים כאן)15.
  3. העברת הנתונים למחשב ניתוח הנתונים.
    הערה: אין לאחסן ולהשתמש בשקופיות הכיול במשך זמן רב.

6. עיבוד נתונים SMLM

הערה: התוסף ImageJ23 "ThunderSTORM"24 שימש לרישום הלוקליזציות (למשל, המרה של הנקודות המהבהבות בערימת התמונות לרשימה המכילה קואורדינטות לוקליזציה, מספר מסגרת וכו'). ImageJ או Fiji25 פועל על כל מערכות ההפעלה השולחניות העיקריות (Linux/Windows/macOS) וניתן להוריד אותו ולהשתמש בו ללא תשלום.

  1. כדי להשתמש ב-ThunderSTORM ב-FijI, הקפד להוסיף את אתר העדכונים של מעבדת Hohlbein תחת עזרה | עדכון | נהל אתרי עדכון, סמן את תיבת הסימון של מעבדת Hohlbein והפעל מחדש את פיג'י. ודא שלתוכנית יש גישה למספיק זיכרון.
    הערה: נתוני התמונה צריכים להיות בתבנית file הניתנת לקריאה על-ידי ImageJ/Fiji. בעת הקלטת הנתונים במערכת מסחרית סטנדרטית, פתח את הנתונים ישירות באמצעות התוסף Bio-Formats עבור ImageJ (שמגיע אוטומטית עם פיג'י). במקרה זה, סקריפט MATLAB h52tif.m (המסופק בדף GitHub שהוזכר בתחילת הפרוטוקול) שימש להמרת הנתונים שהוקלטו על ידי ההגדרה המותאמת אישית שלנו מפורמט hdf5 לפורמט TIFF.
    1. בהתאם לכמות הזיכרון הזמינה במערכת המשמשת ולמספר הפריימים שיש להקליט, פצל את הנתונים למספר תת-ערימות כדי למנוע את גמר הזיכרון.
      הערה: בהמשך נעשה שימוש בהגדרות ששימשו לחילוץ הנתונים המוצגים בסעיף התוצאות. להסבר מפורט יותר על הגדרות ThunderSTORM, עיין במדריכי ThunderSTORM, אותם ניתן למצוא באינטרנט.
  2. בצע אופטימיזציה של ההגדרות לזיהוי אותות מהבהבים על ידי התאמת הגדרות ThunderSTORM בהתאם לתנאי ההקלטה הרצויים. לחץ על ThunderSTORM | הפעל ניתוח, בחר הגדרת מצלמה והזן את גודל הפיקסלים הנכון של נתוני התמונה, ספירת ה-A/D, היעילות הקוונטית של המצלמה המשומשת, רמת הבסיס ורווח EM (עבור הגדרה זו, גודל פיקסלים: 65 ננומטר, ספירת A/D: 0.64, יעילות קוונטית: 0.8).
  3. לאחר מכן, בחר את האלגוריתם לקביעת קואורדינטות הלוקליזציה על ידי התאמת האותות המהבהבים. בקטע סינון תמונה, השתמש במסנן Wavelet (B-Spline) עם סדר B-Spline 3 וסולם B-Spline 2.0. עבור ההגדרות האחרות, הגדר את שיטת הלוקליזציה המשוערת של מולקולות למקסימום מקומי, סף עוצמת שיא ל-2*std (Wave.F1) וקישוריות ל-8 שכונות. בסעיף לוקליזציה תת-פיקסלית של מולקולות, בחר PSF: גאוס משולב, רדיוס התאמה [px]: 3, שיטת התאמה: סבירות מקסימלית, וסיגמא ראשונית [px]: 1.6.
  4. הפעל את התוסף כדי ליצור טבלה המכילה ערך עבור כל לוקליזציה שזוהתה והמאפיינים שלה. שמור את הטבלה בכונן הקשיח.
  5. אם יש צורך לנתח מספר ערימות תמונות או לפצל את ערימות התמונות למספר ערימות (למשל, כדי לאפשר ניתוח של מערכי נתונים גדולים או במקרה שאין הרבה זיכרון זמין במחשב ניתוח הנתונים), אוטומציה של זיהוי לוקליזציה על ידי הפעלת מאקרו.
  6. אם היה צורך לחלק את נתוני הרכישה למספר ערימות תמונות, שרשר את טבלאות הלוקליזציה ב-ThunderSTORM על ידי ייבוא קובץ אחד אחרי השני. ודא שהאפשרות צרף לטבלה הנוכחית בתפריט ייבוא מופעלת ושנעשה שימוש במספר ההתחלתי הנכון כדי למנוע החלפת לוקליזציות בטבלה.
  7. לאחר יצירת טבלת הלוקליזציה המלאה, בדוק את התוצאה על ידי שחזור התמונה מהמיקומים בטבלת התוצאות. לחץ על כפתור ההדמיה בחלון התוצאות של ThunderSTORM והמתן להופעת התמונה המשוחזרת (למשל, היסטוגרמה של הלוקליזציות).
  8. בדוק את התמונה המשוחזרת לאיתור בעיות כגון סחיפה רוחבית וחפצי הדמיה אחרים. מדוד ותקן את הסחיפה בתפריט המשנה Drift על ידי קביעת המתאם הצולב של תת-סעיפים מסוכמים של מחסנית הנתונים (המשמש כאן) או על ידי שימוש בסמנים נאמנים במדגם. לאחר לחיצה על תפריט >> , הזן 5 סלים ואת מקדם ההגדלה (6.5 בפרוטוקול זה). המתן עד שיופיע חלון המציג את סחף ה- x וה- y.
    הערה: התמונות הראשונות לאחר ההקלטה עשויות עדיין לסבול מפלואורסצנטיות רקע חזקה (תוך הבאת הפלואורופורים למצב כהה); לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לא לכלול את כמה מאות התמונות הראשונות מהניתוח (למשל, הקלד "מסגרת >500" בשדה המסנן בחלון הראשי של ThunderSTORM).
  9. כדי להימנע מספירת יתר של אותות הנראים על פני מספר מסגרות עוקבות, החל מיזוג על נתוני הלוקליזציה באמצעות רדיוס הלוקליזציה המתחשב בדיוק הלוקליזציה הממוצע (20 ננומטר כאן), מסגרת כהה אחת ופריימים מקסימליים 0 ( ללא הגבלה על זמן ההפעלה המרבי של מולקולה).
  10. אם יש לנתח רק קטע אולטרה-דק אופטי קל דק, אל תכלול את כל הלוקליזציות מעל ומתחת למישור המוקד ממערך הנתונים. ראשית, חפש את הנקודה ב-z המכילה את הכי הרבה לוקליזציה על ידי לחיצה על Plot Histogram בחלון המכיל את טבלת התוצאות, ולאחר מכן השליך את הלוקליזציות 50 ננומטר מעל ומתחת לנקודה זו באמצעות פקודת הסינון:
    z > "שיא היסטוגרמה" - 50 & z < "שיא היסטוגרמה" + 50
  11. לקביעת חלק ה-DNA בקטע המוקלט, קבע את הלוקליזציות בכל מישור של ערימת התמונות (עובי 200 ננומטר; 100 ננומטר מכל צד) שנרשמו בשלב 4.7.1. פתח את טבלת תוצאות הלוקליזציה הראשונה של המחסנית על-ידי בחירה בתוספים | סופת רעמים | יבוא/ייצוא | ייבא תוצאות וסנן כל פרוסה מוקלטת ל-200 ננומטר. לשם כך, לחץ על החל לאחר הקלדה בשדה המסנן:
    z > -100 & z < 100
  12. לחץ על הדמיה ובחר באפשרות היסטוגרמות כדי ליצור תמונה של כל פרוסה. שמור את התמונה המתקבלת בתיקייה בתבנית TIFF. סגור את כל התמונות הפתוחות. חזור על פעולה זו עבור כל מישורי התמונה.
  13. פתיחת כל הפרוסות ושילובן באמצעות תמונה | ערימות | תמונות לערימה. בחר תמונה | ערימות | Z-Project ובחר באפשרות סכום . פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה ב-ImageJ (ניתוח | כלים | מנהל החזר ROI); לאחר מכן, בחר בכלי בחירת מצולע מסרגל הכלים ImageJ בחלון הראשי של ImageJ ותאר את הגרעין. לחצו על הוספה במנהל ההחזר על ההשקעה.
    1. לחץ על נתח | הגדר מדידות ובחר צפיפות משולבת. לחץ על נתח | למדוד. ב- ThunderSTORM, פתח את טבלת התוצאות של המישור המרכזי כמתואר לעיל וסנן אותה לעובי של 100 ננומטר באמצעות הפקודה הבאה בשדה המסנן:
      z > -50 & z < 50
  14. צור היסטוגרמה של הלוקליזציות המסוננות כמתואר לעיל, הפעל את החזר ה-ROI המוגדר על ידי בחירתו במנהל ה-ROI ולחץ על ניתוח | למדוד.
  15. קבע את חלק הלוקליזציות בחתך האמצעי בעובי 100 ננומטר ביחס למספר הכולל של הלוקליזציות על ידי חלוקת הצפיפות המשולבת הנמדדת - גורם ההמרה הדרוש בשלב 8.2 לחישוב צפיפות ה- DNA המוחלטת.
    הערה: תכולת ה-DNA פרופורציונלית למספר הלוקליזציות. כדי להעריך את חלק ה-DNA בתמונה ברזולוציה גבוהה (חתך אמצעי) מספיק אפוא לקבוע את המספר הכולל של לוקליזציות לאורך נפח הגרעין כולו ולקבוע את המספר הכולל של לוקליזציות בקטע המעניין. ניתן להשיג זאת על ידי יצירת היסטוגרמות דו-ממדיות של הלוקליזציות.

7. כיול Z של מיקרוסקופ SMLM

  1. פתח את ערימות התמונות שהוקלטו בסעיף 5 בפיג'י.
  2. בתפריט התוסף ThunderSTORM, בחר בתפריט המשנה כיול תלת-ממד | כיול עדשות גליליות.
  3. הזן את גודל הצעד המשמש להקלטת נתוני הכיול (10 ננומטר) והגדר את אזור ערימת התמונות שישמש לכיול.
  4. ציין מיקום לשמירת קובץ הכיול.
  5. השתמש בנתוני הכיול בחלון הדו-שיח Run Analysis על-ידי בחירה ב-PSF: Elliptical Gaussian (3D Astigmatism) בחלונית Sub-pixel localization of molecules והתאמת נתיב הקובץ לקובץ הכיול שנוצר בסעיף 5.

8. טסלציה וורונוי

הערה: לאחר יצירת טבלת הלוקליזציה וטיפוחה, המשך לשלב האחרון של ניתוח התמונה - טסלציה של וורונוי. השתמש ב-MATLAB 2021 לשלב זה; סקריפטים של MATLAB הם חלק מחבילת התוכנה "מנתח לוקליזציה להפצות בקנה מידה ננומטרי" (LAND) וניתן להוריד אותם מהקישורים בטבלת החומרים. בדומה לרישום הנתונים ויצירת טבלת הלוקליזציה, חשוב להשתמש במערכת המצוידת היטב בזיכרון ובכוח עיבוד. המערכת ששימשה ליצירת התמונות לפרסום זה הייתה מצוידת ב-128 ג'יגה-בייט זיכרון RAM ומעבד Intel i9 בעל 9 ליבות.

  1. המר את טבלת הלוקליזציה של ThunderSTORM מפורמט .csv לפורמט Orte על ידי הפעלת סקריפט MATLAB "TS2Orte.m", שהופך את טבלת הלוקליזציה למטריצת MATLAB ושומר אותה בפורמט ".mat".
  2. לאחר שהנתונים בפורמט הנכון, התחל את ההכנות לחישוב טסלציה וצפיפות ה- DNA של וורונואי. חשב את גורם ההמרה על ידי חלוקת מספר זוגות הבסיסים בגרעין במספר היחסי של לוקליזציות בקטע המצולם ביחס לנפח (ראה שלב 6.15). היכנס לתיקיית LAND-Voronoi ובתיקיית המשנה /coreAlgorithm , פתח את הקובץ voronoiCluster.m והתאם את גורם ההמרה לחישובי הצפיפות המוחלטת בשורה 13.
    הערה: ראה איור 5 לדוגמא של גרעין G1 HeLa; נמדד מקדם המרה של 265.
  3. ערוך את הסקריפט שמתחיל את הניתוח "VonoRoi.m". התאם את נתיב הקובץ לנתוני הלוקליזציה של Orte ולתיקיית הפלט עבור קבצי התוצאות. ברשימת הקואורדינטות, ציין את הקואורדינטות המגדירות את האזור בו יש לבצע את הטסלציה. מכיוון שהחישוב של Voronoi טסלציה יכול לקחת זמן רב (תלוי במפרט של המכונה בה נעשה שימוש), הגדר מספר אזורים לחישוב בתוך אותו מערך נתוני קלט.
  4. לאחר הפעלת הסקריפט, חפש את התמונה המציגה את צפיפות ה-DNA המוחלטת יחד עם קבצים אחרים המכילים גרפים המציגים את ההיסטוגרמה של התפלגות השטח וקובץ "densities.mat" המכיל את הצפיפות של כל תא Voronoi מחושב בתיקיית הפלט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרעין HeLa המוצג באיור 5 נבחר מהטבלה שנוצרה על ידי CellProfiler4.2.1 בסעיף 3 כדי להיות בעל עוצמת פלואורסצנטיות משולבת הקרובה לשיא הראשון בהיסטוגרמה המוצגת באיור 5 המייצגת גרעינים בשלב G1 . בהתחשב בגודלו הקטן ובמבנה הפנימי הבולט שלו, סביר להניח שמדובר בגרעין G1 מוקדם שעדיין נמצא בתהליך של עיבוי הכרומטין שלו לאחר מיטוזה. הימצאות ב-G1 פירושה שניתן להניח תכולת DNA של 3N (~9 × 109 bp) עבור ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר כיצד למדוד צפיפות DNA מוחלטת בגרעיני תאי יונקים באמצעות SMLM. בנוסף, הדגמנו כיצד לקבוע את שלב מחזור התא של תאים מתורבתים וכיצד להשתמש במידע זה כדי להעריך את כמות ה-DNA הקיימת בחתך אופטי דק במיוחד. כמו כן מתוארים בפירוט הכנת תאים דבקים למיקרוסקופ fBALM SMLM וכיצד לעבד נתוני SMLM כדי ליצור תמונות מיקרוסקופיות סופר-רזולוציה של DNA גנומי בגרעיני התא. לבסוף, הפרוטוקול מראה כיצד ניתן לשלב את טסלציה של וורונוי של נתוני SMLM עם הערכות DNA של חתך האור-אופטי המצולם כדי לחשב את צפיפות ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר סנדרה ריץ על שאפשרה לנו להשתמש במתקן ליבת ההדמיה IMB, לד"ר שי-יה צ'ן על שאפשרה לנו להשתמש במיקרוסקופ SMLM שנבנה בהתאמה אישית, לד"ר לאונרד קובן (IMB) על אספקת פיברובלסטים אנושיים, לד"ר כריסטוף ניהרס (IMB) על אספקת קו התאים C3H10T1/2, ולד"ר יאן נוימן על סקריפט MATLAB ששינינו עבור עבודה זו. אנו רוצים גם להודות לד"ר מריון קרמר, ד"ר תומאס קרמר וד"ר כריסטוף קרמר על דיונים פוריים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<תרבית תאים חזקה> חזקה
µ-צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית גבוהה Grid-500איבידי81168
C3H 10T1/2IMB (מעבדת ניירס)
DMEMתרמופישר12320032
dPBSתרמופישר14190144
FBSטכנולוגיות חיים16000-044
הלהמתקן ליבת מיקרוסקופיה (IMB)
HFBIMB (מעבדת קובן)
L-גלוטמיןסיגמא-אלדריץ'G7513
חומצות ואמינוסים לא חיוניים וויטמינים ל-HFB
נתרן פירובאטS8636
<חזק>הכנת דוגמאות
קטלאזמרק2593710
גלוקוזתרמופישר241922500
גלוקוז אוקסידאזמרק49180
פאראפורמלדהידסיגמא-אלדריץ'158127
קוקטייל RNaseתרמופישרAM2286
סיטוקס אורנג'תרמופישרS11368
ערכת דגימה למיקרוספירות פלואורסצנטיות של TetraSpeckתרמופישרT7284
טריטון X-100תרמופישר327372500
<חזק>תוכנה
BioFormatsOpenMicroscopy.orgתוכנה בקוד פתוח https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgתוכנה בקוד פתוח https://cellprofiler.org
פיג׳יnih.govתוכנה בקוד פתוח https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
ארץnih.govתוכנה בקוד פתוח https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021עבודות מתמטיקהתוכנה מסחרית - דורשת "תיבת כלים לעיבוד תמונה"
R v.4.. 0.3r-project.orgתוכנה בקוד פתוח https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3תוכנה בקוד פתוח https://zitmen.github.io/thunderstorm/
<חזק>מיקרוסקופים:
AF 7000לייקה
לייקה גרמני גרמנילייקה
מיקרוסקופ SMLMמעבדת קרמרנבנתה בהתאמה אישית על ידי ד"ר ס-ויי. חן

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Passarge, E. Emil Heitz and the concept of heterochromatin: longitudinal chromosome differentiation was recognized fifty years ago. American Journal of Human Genetics. 31 (2), 106-115 (1979).
  2. Cremer, T., Cremer, M. Chromosome territories. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (3), 003889(2010).
  3. Vecchio, L., Solimando, L., Biggiogera, M., Fakan, S. Use of halogenated precursors for simultaneous DNA and RNA detection by means of immunoelectron and immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (1), 45-55 (2008).
  4. Solimando, L., et al. Spatial organization of nucleotide excision repair proteins after UV-induced DNA damage in the human cell nucleus. Journal of Cell Science. 122, 83-91 (2009).
  5. Niedojadlo, J., et al. Transcribed DNA is preferentially located in the perichromatin region of mammalian cell nuclei. Experimental Cell Research. 317 (4), 433-444 (2011).
  6. Padeken, J., Heun, P. Nucleolus and nuclear periphery: velcro for heterochromatin. Current Opinion in Cell Biology. 28, 54-60 (2014).
  7. Zhang, Y., et al. Overview of histone modification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1283, 1-16 (2021).
  8. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Frontiers in Bioscience (Landmark Ed). 25 (6), 1058-1109 (2020).
  9. Saul, D., Kosinsky, R. L. Epigenetics of aging and aging-associated diseases). International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 401(2021).
  10. Eckersley-Maslin, M. A., Alda-Catalinas, C., Reik, W. Dynamics of the epigenetic landscape during the maternal-to-zygotic transition. Nature Reviews, Molecular Cell Biology. 19 (7), 436-450 (2018).
  11. Stevens, T. J., et al. 3D structures of individual mammalian genomes studied by single-cell Hi-C. Nature. 544 (7648), 59-64 (2017).
  12. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  13. Cremer, C., Masters, B. R. Resolution enhancement techniques in microscopy. The European Physical Journal H. 38 (3), 281-344 (2013).
  14. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  16. Szczurek, A., et al. Super-resolution binding activated localization microscopy through reversible change of DNA conformation. Nucleus. 9 (1), 182-189 (2018).
  17. Szczurek, A., et al. Imaging chromatin nanostructure with binding-activated localization microscopy based on DNA structure fluctuations. Nucleic Acids Research. 45 (8), 56(2017).
  18. Levet, F., et al. SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data. Nature Methods. 12 (11), 1065-1071 (2015).
  19. Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  21. Team, R. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).
  22. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Maeshima, K., et al. The physical size of transcription factors is key to transcriptional regulation in chromatin domains. Journal of Physics. Condensed Matter. 27 (6), 064116(2015).
  27. Itoh, Y., Woods, E. J., Minami, K., Maeshima, K., Collepardo-Guevara, R. Liquid-like chromatin in the cell: What can we learn from imaging and computational modeling. Current Opinion in Structural Biology. 71, 123-135 (2021).
  28. Strickfaden, H., Xu, Z. Z., Hendzel, M. J. Visualization of miniSOG tagged DNA repair proteins in combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI). Journal of Visualized Experiments. (103), e52893(2015).
  29. Xie, L., et al. BRD2 compartmentalizes the accessible genome. Nature Genetics. 54 (4), 481-491 (2022).
  30. Heo, S. J., et al. Nuclear softening expedites interstitial cell migration in fibrous networks and dense connective tissues. Science Advances. 6 (25), (2020).
  31. Gelléri, M., et al. True-to-scale DNA-density maps correlate with major accessibility differences between active and inactive chromatin. bioRxiv. , (2022).
  32. Derenzini, M., Olins, A. L., Olins, D. E. Chromatin structure in situ: the contribution of DNA ultrastructural cytochemistry. European Journal of Histochemistry. 58 (1), 2307(2014).
  33. Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589, 2931-2943 (2015).
  34. Shah, F. A., Johansson, B. R., Thomsen, P., Palmquist, A. Ultrastructural evaluation of shrinkage artefacts induced by fixatives and embedding resins on osteocyte processes and pericellular space dimensions. Journal of Biomedical Materials Research A. 103 (4), 1565-1576 (2015).
  35. Gavelis, G. S., et al. Dinoflagellate nucleus contains an extensive endomembrane network, the nuclear net. Scientific Reports. 9 (1), 839(2019).
  36. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: a novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801-810 (2009).
  37. Gorisch, S. M., Richter, K., Scheuermann, M. O., Herrmann, H., Lichter, P. Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Experimental Cell Research. 289 (2), 282-294 (2003).
  38. Lenart, P., et al. Nuclear envelope breakdown in starfish oocytes proceeds by partial NPC disassembly followed by a rapidly spreading fenestration of nuclear membranes. The Journal of Cell Biology. 160 (7), 1055-1068 (2003).
  39. Verschure, P. J., et al. Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules. EMBO Reports. 4 (9), 861-866 (2003).
  40. Strickfaden, H., et al. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  41. Lin, Y. R., et al. M33 condenses chromatin through nuclear body formation and methylation of both histone H3 lysine 9 and lysine 27. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1868 (11), 119100(2021).
  42. Strickfaden, H., Sharma, A. K., Hendzel, M. J. A charge-dependent phase transition determines interphase chromatin organization. bioRxiv. , (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Density MappingCell NucleiSingle Molecule LocalizationSuper Resolution MicroscopyChromatin StructureVoronoi TessellationFPALM ImagingEpigenetic ModificationsCell Cycle StagesHeterochromatin Euchromatin

Related Articles