השתלה של נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שנוצרו על ידי תכנות עצבי יכולה להיות גישה טיפולית פוטנציאלית להפרעות נוירו-התפתחותיות. פרוטוקול זה מתאר את הדור וההשתלה של מבשרים עצביים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים במוחם של עכברים ילודים, מה שמאפשר חקירה ארוכת טווח של נוירונים מושתלים והערכת הפוטנציאל הטיפולי שלהם.
מאמר שיטה
השתלת תאי עצב GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכברים המוקדם לאחר הלידה כדי למתן הפרעות נוירו-התפתחותיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
מספר מופחת או תפקוד לקוי של interneurons מעכבים הוא תורם נפוץ להפרעות נוירו-התפתחותיות. לכן, טיפול תאי באמצעות interneurons כדי להחליף או למתן את ההשפעות של מעגלים עצביים משתנים היא דרך טיפולית אטרקטיבית. לשם כך, נדרש ידע נוסף על האופן שבו תאים דמויי GABAergic דמויי תאי גזע אנושיים (hdINs) מתבגרים, משתלבים ומתפקדים לאורך זמן במעגלים המארחים. חשיבות מיוחדת בהפרעות נוירו-התפתחותיות היא הבנה טובה יותר של השאלה אם תהליכים אלה בתאים מושתלים מושפעים ממוח מארח מתפתח ומתבגר. הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור מהיר ויעיל ביותר של HDINs מתאי גזע עובריים אנושיים המבוססים על הביטוי המהונדס של גורמי השעתוק Ascl1 ו - Dlx2. מבשרים עצביים אלה מושתלים באופן חד צדדי, לאחר 7 ימים במבחנה, להיפוקמפוס של עכברים ילודים בני יומיים. הנוירונים המושתלים מתפזרים בהיפוקמפוס ה-ipsi והקונטרלטרלי של מודל עכבר של תסמונת אפילפסיה מוקדית-דיספלסיה בקליפת המוח ושורדים עד 9 חודשים לאחר ההשתלה. גישה זו מאפשרת לחקור את הזהות התאית, האינטגרציה, הפונקציונליות והפוטנציאל הטיפולי של אינטרנורונים מושתלים לאורך זמן רב בפיתוח מוחות בריאים וחולים.
מבוא
ההקמה, ההבשלה והעידון של רשתות עצביות מתרחשות במהלך התקופה הפרינטלית והמוקדמת שלאחר הלידה, ומהוות חלונות זמן מכריעים להתפתחות המוח1. מתוך שפע של קישוריות לאחר הלידה, המוח מתפתח לכוונון עדין של קשרים שנמשכים עד גיל ההתבגרות2. כתוצאה מכך, שינויים בגנים המתבטאים בתקופות אלה, כמו גם גורמים חיצוניים או עלבונות, מגדירים את נטייתו של הפרט להפרעות נוירו-התפתחותיות מרובות. ליקויים בקוגניציה ובתפקוד המוטורי מתפתחים עם הזמן, והטיפולים התרופתיים מוגבלים, רובם מתמקדים בסימפטומים עם סיכון לתופעות לוואי חמורות.
תפקוד לקוי של חומצה גמא-אמינובוטירית (GABA)עיכוב ארגי הוכח כתורם מרכזי לגורם הבסיסי להפרעות נוירו-התפתחותיות שונות3, כגון תסמונת X שביר, תסמונת אנג'למן, אפילפסיה, סכיזופרניה ואוטיזם. GABA הוא המשדר המעכב העיקרי של מערכת העצבים המרכזית והוא חיוני לשמירה על איזון מעורר/מעכב (E/I), סנכרון של ירי עצבי וחישוב. GABAergic interneurons הם אוכלוסייה הטרוגנית של נוירונים, עם מורכבות תפקודית גוברת באזורי מוח מורכבים יותר4 ועם אבולוציה 5,6. בהתחשב ביכולת ההתחדשות האנדוגנית המוגבלת של המוח האנושי וההשלכה של תפקוד לקוי של interneuron במספר הפרעות נוירולוגיות, השתלת interneurons GABAergic עשויה להיות דרך טיפולית מבטיחה לחקור. לאורך קו זה, נראה כי תאים דמויי GABAergic דמויי תאי גזע אנושיים (hdINs) הם המקור התרגומי והישים ביותר למטרה זו בהשוואה למבשרי נוירונים אלוגניים של מכרסמים או למקורות אחרים המשמשים במקומות אחרים7. פרוטוקולים ליצירת תאי עצב GABAergic ממקורות תאים מגוונים זמינים 8,9,10,11,12,13, אך נדרש ידע נוסף על האופן שבו HDINs מתבגרים, משתלבים ומתפקדים לאורך זמן במוח פתולוגי מתפתח. מספר מחקרים זיהו שינויים בגנים הפעילים במהלך דפוס קליפת המוח, ביסוס קישוריות עצבית14 וכוונון איזון E/I פיזיולוגי15. השתלת יילודים של HDINs לתוך מודלים של עכברים עם הפרעות גנטיות תואמות מאפשרת לנו לעקוב אחר יחסי הגומלין בין המארח לשתל, שהוא הידע הדרוש כדי לקבוע אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
אימונומודולציה משמשת בדרך כלל ובהצלחה בהשתלות קסנוגרפט כדי למנוע הפעלת תגובה חיסונית של המארח ודחייה16. עם זאת, הממשל של תרופות אימונוסופרסיביות, כגון cyclosporine A, גורם רעילות כלייתית לאחר ניהול כרוני, הוא אינטנסיבי בעבודה בגלל הצורך זריקות תוך צפק יומי כדי להשיג ריכוזים מערכתיים יציבים, גרימת מתח בעלי חיים17, ויש לו השפעות מחוץ למטרה שיכולים לתקשר עם הפתולוגיה18. בנוסף, התפשרות על המערכת החיסונית הוכחה כמשנה פנוטיפים התנהגותיים19, עם שינויים באזורים הנוירואנטומיים המתאימים20. השתלה בשבוע הראשון לחיים הוכחה כמאפשרת הסתגלות לתאים מושתלים 21,22, בעוד שאחרים דיווחו על הישרדות ראשונית ואחריה דחייה של השתלים בחודש הראשון שלאחר הלידה 23,24.
פרוטוקול זה מתאר הליכים מדור hdIN ועד השתלת תאים בעכברים ילודים המביאים להישרדות השתלה ארוכת טווח ומאפשרים לחקור את הספציפיות העצבית, האינטגרציה הסינפטית, התפקוד והפוטנציאל הטיפולי של אינטרנורונים אנושיים מושתלים במהלך ההתפתחות הפיזיולוגית והפתולוגית.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסויים אושרו על ידי מועצת האתיקה למחקר בבעלי חיים של מאלמו/לונד, היתר אתי מספר 12548-19, ונערכו בהסכמה עם תקנות הסוכנות השוודית לרווחת בעלי חיים ועם הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU לניסויים בבעלי חיים. C57BL6/J ועכברי נוק-אאוט דמויי חלבון 2 (Cntnap2) הקשורים למגע, זכרים ונקבות כאחד, שימשו ביום שלאחר הלידה (P) 2 למחקר הנוכחי. נעשה שימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). בעלי החיים ותאי הגזע התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
1. דור של מבשרי hdIN
הערה: כל השלבים בסעיף זה נעשים במכסה מנוע של תרבית תאים. ה-hESCs נשמרו כתאים נטולי הזנה על צלחות מצופות באמצעות תרבית תאי גזע והועברו כמושבות.
- בצע תכנות קדימה של hESCs למבשרי hdIN (איור 1).
הערה: גישת התכנות קדימה מבוססת על הפרוצדורה המתוארת ב- Gonzalez-Ramos et al.8 ו- Yang et al.9.- מתמרים את ה-hESCs עם וקטורים לנטי-ויראליים המכילים את מערכת Tet-On בתרבית תאי גזע טריים המכילים 10 μM של מעכב ROCK (RI) (ראו טבלת חומרים). יש לשמור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור.
- שנה את המדיום למדיום של תרבית תאי גזע טריים 16 שעות לאחר ההתמרה ושמור על התאים המתמרים באותו אופן כמו תאי גזע עובריים שאינם מותמרים.
- בעת המפגש, יש לנתק את תאי ה-hESCs כתאים בודדים באמצעות תמיסת ניתוק תאים (ראו טבלת חומרים) ולצבוע אותם בלוחות מצופים של 6 בארות בצפיפות של 3 x 105 תאים /באר בתרבית תאי גזע המכילים 10 μM של RI ביום במבחנה (DIV) −1.
- ב-1 DIV, החליפו את המדיום המתרבת במדיום N2 המכיל 2 גרם/ליטר של דוקסיציקלין (DOX, ראו טבלת חומרים).
הערה: DOX משמש להשראת ביטוי טרנסגני של Ascl1 ו - Dlx29, מ- 1 DIV עד 7 DIV, ולאחר מכן ממשיך in vivo על ידי הוספתו למי השתייה25. - ב-2 DIV מתחילה תקופת בחירה של עמידות לאנטיביוטיקה שתימשך עד 5 DIV. הוסיפו פורומיצין (פורו) והיגרומיצין (היגרו) למדיום הטרי (ראו טבלת חומרים). החלף את המדיום ב- 2 DIV, 4 DIV ו- 5 DIV.
הערה: מטב את הריכוזים של puro ו- hygro לפני פרוטוקול ההתמיינות באמצעות hESCs מתמרים ולא מותמרים כדי להבטיח את הישרדותם של התאים הנושאים רק את קלטות העמידות לאנטיביוטיקה. בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב-0.5 מיקרוגרם/מ"ל של פורו ו-750 מיקרוגרם/מ"ל של היגרו. - ב-5 DIV מסתיימת תקופת בחירת האנטיביוטיקה. יש להחליף למדיום N2 בתוספת 2 גרם/ליטר של DOX ו-4 מיקרומטר של ציטוזין β-D-ארבינופורנוסייד (Ara-C, ראו טבלת חומרים).
איור 1: יצירת מבשרי hdIN מ-hESCs על-ידי ביטוי יתר של Ascl1 ו-Dlx2. (A) סכמות של פרוטוקול ההבחנה המשמש ליצירת מבשרי hdIN. (ב-ה) אימונוציטוכימיה של מבשרי hdIN ב-7 DIV עבור (B) הסמן העצבי MAP2, (C) הסמן המתפשט Ki67, (D) הכתמה גרעינית כללית, ו-(E) מיזוג של הסמנים הקודמים. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
2. הכנת ההשעיה החד-תאית להשתלה
הערה: כל השלבים בסעיף זה נעשים במכסה המנוע של תרבית התאים. ב- 7 DIV, מבשרי hdIN מנותקים ומשמשים להשתלה.
- בצע ניתוק של התאים בהתאם לשלבים הבאים.
- הסר את המדיום ושטוף בזהירות את התאים עם DPBS ללא סידן ומגנזיום.
- הוסף 400 μL של תמיסת ניתוק התאים (ראה טבלת חומרים) לכל באר של צלחת 6 בארות.
הערה: ודא את כיסוי המשטח כולו על-ידי התמיסה. - דגירה במשך 2-3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עד שגבול התאים מתחיל להיראות מבריק, מה שמעיד על פירוק אנזימטי של חלבונים על פני התא וניתוק מפני השטח של הבאר.
הערה: כדי להגדיל את הישרדות התאים, אל תחכה זמן רב מדי כאשר כל התאים מנותקים לחלוטין ומרחפים סביבם. - לאחר מכן, הוסף 600 μL של מדיום N2 טרי לכל באר של צלחת 6 בארות כדי לעצור את האנזים, ומכנית עם פיפטה, לעזור לנתק את התאים כדי לקבל השעיה של תא אחד.
- מעבירים את מתלה התא לצינור פלסטיק (15 מ"ל) וצנטריפוגה ב-180 x גרם למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- בצע resuspension של התאים.
- יש להשליך את ה-supernatant באמצעות מערכת ואקום (בזהירות, מבלי להפריע לכדור) ולהשהות את הכדור במדיום ההשתלה המכיל 10 μM של RI, 1 מיקרוגרם/מ"ל של DNase, ו-2 מיקרוגרם/מיקרוגרם של DOX.
- ספרו את סך התאים במתלים באמצעות תא ספירה ומונה תאים ידני והתאימו את עוצמת הקול לריכוז סופי של 100,000 תאים/μL.
- שמור את תרחיף התא בצינור סגור על קרח עד להשתלה למשך 4 שעות לכל היותר.
הערה: ההשתלה צריכה להתבצע באותו יום כמו הכנת השעיית התא (7 DIV).
3. השתלת תאים תוך-היפוקמפליים
הערה: כל השלבים בסעיף זה מבוצעים מחוץ למכסה המנוע של תרבית התאים במתקן החי. השתלה מוקדמת של תאים במוח לאחר הלידה בוצעה ב-P2, בהתחשב ב-P0 ביום הלידה.
- היכונו לניסוי ההשתלה בעקבות השלבים הבאים.
- Autoclave כל החומר הכירורגי או, אם לא ניתן, לעקר עם שיטה מאושרת אחרת.
- הרכיבו את מזרק ההזרקה במחזיק ללא נימי זכוכית. שטפו את המחט במים.
הערה: המחט חייבת להיות 33 גרם. - עקום 90° קצה של מחט אינסולין 30 גרם.
- צרו במה ביתית דמוית פליי-דו למיקום הגור עם ראש שטוח (איור 2A).
- הביאו את כלוב העכברים עם האם והגורים לפני שאתם מכינים משהו לניתוח כדי לאפשר להם להתאקלם לסביבה החדשה.
- הכינו מגש עם קרח רטוב וכלוב ריק עם קצת נייר לאיזופלוראן.
- להרדים את גור העכברים.
- השרו פיסת נייר עם איזופלורן (ראו טבלת חומרים) והניחו אותה בתוך הכלוב הריק. קחו בזהירות גור אחד והכניסו אותו לכלוב כשהנייר ספוג באיזופלורן.
הערה: לעולם אל תשאירו פחות משלושה גורים עם האמא. אין לחרוג מ-20-30 שניות של הרדמה איזופלוראן, אחרת הגור עלול למות. - ודא את ההשפעה של ההרדמה על ידי הפסקת תנועה.
- מיד לאחר ההרדמה, הניחו את הגור על רקמה רטובה על פני קרח רטוב. החזיקו את החיה על הקרח למשך 3 דקות עד שהגפיים העליונות יהפכו ללבנות (איור 2B, חץ כחול). זה בדרך כלל לוקח 2-3 דקות.
- נצלו את הזמן הזה לטעינת המזרק עם השעיית התא. החזירו את התאים בזהירות עם פיפטה לפני כן.
- הניחו את הגור על המסגרת הסטריאוטקסית. השתמשו בפסי האוזניים בכיוון ההפוך (איור 2A, חיצי מגנטה).
הערה: הצד האחורי של מוטות האוזניים פחות מחודד, וכיוון שלגורי P2 אין אוזניים, השתמש בצד השטוח יותר כדי להימנע מפגיעה בחיה. - מהצד, בדוק אם הראש ישר. הראש חייב להיות שטוח; השתמש בשלב דמוי Play-Doh כדי להתאים את עצמו לכך.
הערה: גורים בגיל זה עדיין לא פקחו את עיניהם, ולכן אין צורך לעשות צעד נוסף בעניין זה. לגורים אין פרווה בגיל זה, ולכן אין צורך בגילוח של האזור. לא ניתן טיפול ספציפי בכאב מכיוון שלא מדובר בחתך פתוח בעור, ולא מעורבת תפירה. - יש לשמור את הגור מכוסה על קרח (על גבי נייר טישו) למשך כל משך הניתוח.
הערה: אין למקם את הקרח במגע ישיר עם עור הגור.
- השרו פיסת נייר עם איזופלורן (ראו טבלת חומרים) והניחו אותה בתוך הכלוב הריק. קחו בזהירות גור אחד והכניסו אותו לכלוב כשהנייר ספוג באיזופלורן.
- בצע את ההזרקה.
- נקו את פני העור באמצעות רקמה רכה ספוגה באתנול.
- זהה למבדה והגדר את הקואורדינטות לאפס בקונסולת התצוגה הדיגיטלית של המכשיר הסטריאוטקסי (איור 2C, קו מקווקו צהוב). תפרים Sagittal ו lambdoid נראים בקלות על ידי העין, שכן הם vascularized, כמו קווים אדומים.
הערה: אם אתם חווים קשיים לדמיין למבדה, הניחו חתיכת קרח קטנה על העור והמתינו מספר דקות עד שהיא תתקרר. לאחר מכן, להסיר את חתיכת קרח, ואת הלבנה עדינה של העור יאפשר לך לדמיין. - העבר את מחט ההזרקה לקואורדינטות הרצויות. בפרוטוקול המתואר, האזור הממוקד היה ההיפוקמפוס, והקואורדינטות היו כדלקמן: קדמי-אחורי (AP) +0.85 ובינוני-לרוחב (ML) +1.35.
- השתמש במחט אינסולין מכופפת של 90° כדי לחדור לגולגולת וליצור חור זעיר.
- הורידו את מחט ההזרקה עד שהיא חצתה את הגולגולת, ואפס את הקואורדינטות הדורסו-גחוניות (DV). הורד את המחט עד לקואורדינטות ה- DV הרצויות. בפרוטוקול המתואר, הקואורדינטות היו DV −1.1.
- להזריק על פי מרווחי הזמן שנקבעו מראש.
הערה: בפרוטוקול המתואר, התזמונים המדויקים היו כדלקמן: (i) לאחר ירידה לקואורדינטות DV, המתן 3 דקות, (ii) הזרקת 1 μL של נפח למשך 5 דקות, ו- (iii) לאחר שכל הנפח הוזרק, המתן 3 דקות. - החזירו את המחט באיטיות.
- סיים את ההליך.
הערה: הניתוח אינו יכול להימשך יותר מ-15 דקות כדי להבטיח את הישרדותו של הגור ולהימנע מכל נזק הנובע מההרדמה על ידי היפותרמיה.- חממו את הגור עם הידיים עד שהוא מתחיל לזוז לפני שאתם מחזירים אותו לאם.
- יש לתת DOX בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל בתמיסת סוכרוז של 0.5% בתור מי שתייה לפחות יומיים לפני ו-3 שבועות לאחר ההשתלה (PT) כדי להמשיך את התמיינות התאים in vivo.
איור 2: השתלה סטריאוטקסית בגורי עכברים שזה עתה נולדו ב-P2. (A) במה דמוית Play-Doh להחזקת גופו של הגור במקומו ופסי אוזניים הפוכים (חיצי מגנטה). (B) כפה קדמית לבנה (חץ כחול) המעידה על זרימת הדם המופחתת באזור זה, כך שהגור חווה הרדמה על ידי היפותרמיה. (C) סקירה כללית של ההתקנה כאשר הגור כבר מכוסה בקרח מעל נייר הטישו הרך. (ג#) זום סגור של ראש הגור, כאשר מחט ההזרקה כבר מוחדרת למוח (קו מקווקו צהוב המציין תפרים למבדה ולמבדואיד). נתון זה מעובד מתוך גונזלס ראמוס ואחרים. 27. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול שהוצג כאן ומודגם באיור 1A, מבשרי hdIN עדיין לא התרבו ב-7 DIV כפי שהוגדר על-ידי (i) פעילות חיסונית שלילית עבור סמן מחזור התא Ki67 ו-(ii) ביטוי סמנים עצביים כגון חלבון 2 הקשור למיקרוטובול (MAP2) (איור 1B-E). אפיון זה בוצע על שאריות תאים שעברו ציפוי מחדש במשך 24 שעות לאחר שעברו את כל שלבי ההליך. בנוסף, ניתוח ביטוי הגנים שפורסם בעבר הצביע על כך שמעבר מהיר ממצב פלוריפוטנטי לפנוטיפ עצבי מתרחש סביב 4 DIV ו-7 DIV8. בסך הכל, תוצאות אלה אישרו את נוכחותם של תאים פוסטמיטוטיים ואת היעדר הסיכון להיווצרות טרטומה.
לאחר מכן, הישרדותם של מבשרי ה-hdIN לאחר השתלה מוקדמת לאחר הלידה בהיפוקמפוס של עכברים מסוג בר (WT) נבדקה על ידי אימונוהיסטוכימיה כנגד הסמן הציטופלסמטי האנושי STEM121. מבשרי ה-hdIN הושתלו בהיפוקמפוס הגבי הימני של עכברים תמימים בעלי יכולת חיסונית ב-P2, אשר הוקרבו לאחר מכן ב-P14 וחודשיים PT. תאים מושתלים נמצאו על פני כל ההיפוקמפוס הגבי, כמו גם התפזרו דרך קורפוס קלוסום וההיפוקמפוס הקונטרלטרלי, בשתי נקודות הזמן. יתר על כן, בשתי נקודות הזמן, HDINs מושתלים ביטאו את Ascl1, אחד מגורמי שעתוק האינדוקציה (איור משלים 1), ולא היו מתרבים, כפי שמעיד היעדר ביטוי Ki67 (איור משלים 2).
חשוב לציין כי לא נמצאה תגובה חיסונית או דלקת מקומית נגד התאים המושתלים ב-P14 או בחודשיים PT, כפי שהוערך על-ידי היעדר מיקרוגליה תגובתית שזוהתה באמצעות Iba1, CD68 ו-galectin-3 (Gal3) (איור 3), מידת האסטרוגליוזיס נקבעה על-ידי החלבון החומצי של פיברילרי גליה (GFAP) וציטוקינים דלקתיים כגון אינטרלוקין-1 (IL-1), והיעדר לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CD8) (איור 4).
איור 3: HDINs ב-P14 וחודשיים PT בהיפוקמפוס של עכברי WT שזה עתה נולדו מבלי לעורר דחייה חיסונית מהרקמה המארחת. אימונופלואורסצנציה עבור סמני Iba1, CD68 ו- Gal3 ברקמת המוח מ- (A-D) הקרבה של אזור ליבה איסכמי במודל עכבר שבץ אלקטרוקואגולציה (בקרה חיובית, Ctrl +), (E-H) חיות בקרה שליליות (Ctrl-) בגיל חודשיים ו- (M-P) P14, ובעלי חיים (I-L) שעברו השתלת תאים בגיל חודשיים ו(Q-T ) עמ' 14. החיצים הלבנים מצביעים על כמה דוגמאות של כלי דם הנראים בכל הערוצים עקב אוטופלואורסצנציה. קיצורים: Ctx = קליפת המוח; ירך = היפוקמפוס; DG = פיתול משונן; CA1 = קורנו אמוניס 1. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: hdINs בגיל חודשיים PT לתוך ההיפוקמפוס של עכברי WT שזה עתה נולדו מבלי לעורר דחייה חיסונית מהרקמה המארחת. אימונופלואורסצנציה עבור סמני IL1, GFAP ו-CD8 ברקמת המוח מ-(A-D) הקרבה של אזור ליבה איסכמי במודל עכבר שבץ אלקטרוקואגולציה (בקרה חיובית, Ctrl +), (E-H) חיות בקרה שליליות (Ctrl-) בגיל חודשיים, ובעלי חיים (I-L) שעברו השתלת תאים בגיל חודשיים. קיצורים: Ctx = קליפת המוח; ירך = היפוקמפוס; DG = פיתול משונן. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
באופן דומה, מבשרי hdIN הושתלו גם בהיפוקמפוס של עכברי Cntnap2 KO, מודל להפרעת ספקטרום האוטיזם ולתסמונת אפילפסיה מוקדית של דיספלסיה בקליפת המוח. בעכברי Cntnap2 KO, אכן, ה-HDINs שרדו עד 9 חודשים PT והיו ממוקמים באתר ההזרקה, אם כי הם פוזרו גם על פני ההיפוקמפוס האיפסילטרלי ואפילו ההיפוקמפוס הקונטרלטרלי כפי שנצפה בעכברי WT (איור 5). יתר על כן, רוב ה-HDINs המושתלים היו פעילים חיסונית עבור סמנים בין-עצביים, כצפוי מתוצאות קודמות במבחנה 8,26 ובמכרסמים בוגרים in vivo25.
איור 5: HDINs מושתלים בהיפוקמפוס של עכברי Cntnap2 KO בגיל 9 חודשים PT. (A) אימונוכימיה כנגד הסמן האנושי הציטופלסמטי STEM121 בעכברים מושתלי תאים (משמאל) ובעכברים (מימין). (א1 ו-א2) תמונות מוגדלות של תאים חיוביים STEM121. (B) אימונופלואורסצנציה עבור STEM121 (מגנטה) והסמנים הבין-עצביים פרבאלבומין (PV) וסומטוסטטין (SST). חיצים לבנים מציינים תאים חיוביים כפולים עבור STEM121 והסמן הבין-עצבי בהתאמה. (C) תצוגה אורתוגונלית של HDin מושתל אימונואקטיבי עבור STEM121 ו-PV. סרגל קנה מידה: 200 μm (A ו- B), 100 μm (a1 ו- a2), 20 μm (הגדלה ריבועית קטנה ב- a1 ו- a2, ו- C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: HDINs מושתלים בגיל חודשיים PT בהיפוקמפוס של עכברי WT שזה עתה נולדו ומבטאים Ascl1. אימונופלואורסצנציה נגד Ascl1 והסמן האנושי הציטופלסמטי STEM121 ב-(A) CA3 ו-(B) DG בעכברי WT שהושתלו בתאים. (א) תמונה מוגדלת של תא חיובי STEM121. החיצים הלבנים מצביעים על תאים חיוביים כפולים עבור STEM121 ו- Ascl1. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: HDINs מושתלים לאחר מיטוטי בגיל חודשיים PT בהיפוקמפוס של עכברי WT שזה עתה נולדו. אימונופלואורסצנציה כנגד הסמן המתפשט Ki67 והסמן האנושי הציטופלסמטי STEM121 בעכברי WT תמימים ו-(B) מושתלי תאים. (ב) תמונה מוגדלת של תא חיובי STEM121. החץ הצהוב מציין תא חיובי עבור Ki67 ושלילי עבור STEM121. החץ הלבן מציין תאים חיוביים עבור STEM121 ושליליים עבור Ki67. הכוכבית הלבנה מצביעה על חדר לרוחב. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
דיון
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה חזקה, מהירה, פשוטה ונגישה באופן נרחב ליצירת מבשרי hdIN במבחנה ושימוש בה כטיפול תאי התערבותי מוקדם במודלים פרה-קליניים של הפרעות נוירו-התפתחותיות.
למרות שחלק מהפנוטיפים האופייניים להפרעות נוירו-התפתחותיות מתעוררים במהלך גיל ההתבגרות או הבגרות, שינויים פתופיזיולוגיים כבר קיימים במהלך ההתפתחות המוקדמת. מסיבה זו, התערבות מוקדמת תהיה מוצדקת מאוד להשגת השפעות מועילות על ידי פעולה בתקופות התפתחות מוח קריטיות לפני סימפטומטולוגיה או ביטוי קליני. בעתיד, סריקה גנטית ופיתוח סמנים ביולוגיים יאפשרו טיפול מניעתי או טרום סימפטומטי, המהווה משנה משחק עבור אותם חולים. לכן, מבשרי hdIN הושתלו מוקדם לאחר הלידה במודל העכבר Cntnap2 KO כאשר שינויים אפילפטוגניים ברשת העצבית עשויים להיות מתמשכים28 ובנקודת זמן שבה שינויים תאיים תוארו במודל זה של בעלי חיים29. חשוב, עם זאת, לשקול את המלכודות הפוטנציאליות של אקסטרפולציה של גיל ואת התזמון של תהליכים מסוימים בעכבר לעומת המוח האנושי.
תוך התמקדות בהליך עצמו, פרוטוקול ההתמיינות המוצג כאן מבוסס על שימוש בגורמי שעתוק, המאפשרים תכנות מהיר ויעיל ביותר של תאי גזע בהשוואה לפרוטוקולים אחרים במקומות אחרים המבוססים על מולקולות קטנות10,30. חיסרון פוטנציאלי של גישה זו יכול להיות הדרישה עבור וקטורים lentiviral, אשר נושאת סיכון של מוטגנזה החדרה. שני שלבים קריטיים בפרוטוקול הם הוספת האנטיביוטיקה והחומר האנטי-מיטוטי למדיום כדי לבחור עבור תאים המבטאים את גורמי השעתוק ולחסל תאים מתרבים, תוך הימנעות מהסיכון להיווצרות טרטומה, בהתאמה. למרות שרק מבשרי hdIN נבדקו במחקר זה, ההליך צפוי להיות אפשרי עם מקורות תאים אחרים ופרוטוקולי תכנות/התמיינות אחרים. עם זאת, יש לאמת תת-סוגים ו/או מודלים עצביים אחרים.
גילו של מבשר ה- hdIN להשתלה, 7 DIV, נקבע על סמך (i) היעדר תאים מתרבים, שהוערכו על ידי פעילות חיסונית כנגד Ki67, (ii) יחד עם התצפית שדווחה בעבר על ירידות בביטוי גנים פלוריפוטנטיים כגון POU5F1 והופעת הסמן העצבי MAP2 והסמן הבין-עצבי GAD1 באותה נקודת זמן8 . עם זאת, העבודה המקורית המתארת פרוטוקול זה ביצעה השתלות ב 14 DIV לאחר גמילה DOX9. זה מעלה שאלות לגבי האם DOX במי השתייה של האם יכול להגיע לתאים המושתלים במוחם של גורים מניקים דרך החלב, או אם 7 DIV של אינדוקציה של DOX מספיקים כדי לקבוע את גורל GABAergic. למרות שיאנג ואחרים זיהו 14 יום של DOX כמספיקים ליצירת תאים עצביים יציבים במבחנה9, Gonzalez-Ramos et al.8 זיהו ביטוי גנים GAD1 כבר ב-7 DIV, מה שמצביע על כך שההפעלה במורד הזרם של GAD67 על ידי Ascl1 ו-Dlx2 כבר התרחשה בנקודת זמן זו. לפיכך, התבנית החלה ב-7 DIV ועשויה להיות פחות תלויה בטיפול ב-DOX. יתר על כן, עדויות במכרסמים ובבני אדם מצביעות על נוכחות של DOX בחלב אם 31,32, והתוצאות המוצגות כאן מראות כי hdINs מושתלים היו פעילים חיסונית עבורAscl1 ב 2 שבועות וחודשיים PT וסמנים interneuron מאוחר יותר ב 9 חודשים PT. בתוך האוכלוסייה המושתלת, מלבד נוירונים חיוביים PV ו- SST, סמנים אחרים עבור תת-אוכלוסיות של interneurons נמצאו גם בכמויות נמוכות יותר, כגון קלרטינין (CR) ו calbindin (CB).
היבט מאתגר של הליך זה הוא תיאום התזמונים הן להבחנה והן לגיל הגורים. בדרך כלל, הריון עכבר לוקח 21 ימים לאחר הגדרת כלוב ההזדווגות, אם כי זה יכול להשתנות לפעמים. תרחיש זה אינו מתרחש בעת ביצוע השתלות תאים במכרסמים בוגרים כאשר הכל יכול להיות מתוכנן בקפידה ומסודר. עם זאת, ניתן למתן זאת בקלות על ידי הצבת שניים עד שלושה כלובי הזדווגות עם מרווח של יומיים או שניים עד שלושה אצוות הבחנה עם קיטועי זמן של יומיים זה מזה.
אף על פי שהעכברים ששימשו במחקר זה לא היו מדוכאי חיסון או מדוכאי חיסון, התאים המושתלים שרדו עד 9 חודשים in vivo, וסמנים של תגובה חיסונית נגד תאים קסנוגניים או דלקת מקומית לא נצפו ב- P14 או חודשיים PT. דחייה חיסונית של תאים קסנוגניים מושתלים מופעלת נגד MHC/פפטידים, והמתווכים התאיים העיקריים של דחיית השתל הם לימפוציטים מסוג T ותאים מיקרוגליאליים33, 34. לכן, נבדקה פעילות חיסונית לסמנים של תאי T, כמו גם מיקרוגליה תגובתית. לא זוהו סימנים לדחייה חיסונית של התאים המושתלים ברקמה המארחת על ידי רמות של מיקרוגליה תגובתית או על ידי נוכחות של לימפוציטים מסוג T בעכברי WT ב-P14 או חודשיים. יתר על כן, לא נצפתה דלקת מקומית בהתבסס על הרמות המוערכות של אסטרוגליוזיס וציטוקינים דלקתיים. תוצאה זו יכולה להיות תלויה בחלקה בסבילות חיסונית של ילודים 35,36,37, שנצפתה על ידי זהויות תאים אחרות, מיקומים ומודלים של בעלי חיים35,38. Englund et al. זיהו הבדלים אזוריים בתוצאות התאים המושתלים במונחים של נדידה והבשלה, כולל תצפית של תאים מושתלים בחומר הלבן הסמוך35.
לבסוף, נצפתה פיזור גדול יותר של התאים המושתלים בתוך ההיפוקמפוס בהשוואה למחקרים אחרים שהושתלו במכרסמים בוגרים, שם hdINs נשארו כליבה מושתלת25. פיזור זה גם שונה מתוצאות שנצפו בעבר על ידי Yang et al.9, אשר ניתן להסביר במקרה זה על ידי גיל התאים בזמן ההשתלה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
תודות
פרויקט זה מומן על ידי מועצת המחקר השוודית (מספר מענק: 2016-02605, M.A.), קרן המוח השוודית F02021-0369 (M.A.), קרן קראפורד (M.A.) ותוכנית אופק 2020 של האיחוד האירופי (H2020-MSCA-ITN-2016) במסגרת פרויקט רשת ההדרכה החדשנית של מארי סקלודובסקה-קירי Training4CRM No. 722779 (M.K.). אנו אסירי תודה על עזרתם של אנדרס מיגוז, ממעבדתו של ג'וזפ מריה קאנאלס (המעבדה לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית, אוניברסיטת ברצלונה), על הוראת השתלת תאים סטריאוטקסית בעכברי P2, ומקנזי הווארד, ראש קבוצה באוניברסיטת טקסס באוסטין, על העצות והקואורדינטות הראשוניות להשתלת תאים בהיפוקמפוס של עכברי P2 שזה עתה נולדו. אנו מודים לסוזן ג'רס על הסיוע בטיפול בבעלי חיים וללינג קאו על העזרה בעיבוד רקמות, כמו גם לסטודנטים שתרמו בדרך זו או אחרת למחקר ובמיוחד לדיאנה האטמיאן. לבסוף, חלק מהגרפיקה ששימשה להמחשת מאמר זה נוצרה עם BioRender.com.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחט 30 גרם | B בראון | 4656300 | |
| 33 גרם מחט למזרק המילטון | המילטון | 7762-06 | |
| צלחות 4 בארות | Thermo Scientific | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | שימוש בתמיסת ניתוק תאים לפיצול תאים (מבשרי hESC ו-hdIN) |
| פיפטות נפח מתכווננות 10, 20, 200, 1000 ומיקרו; L | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
| Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
| Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
| Anti-Galectin 3 (Goat) | R& D systems | AF1197 | 1:500 |
| Anti-GFAP (Guiena Pig) | מערכות סינפטיות | 173004 | 1:500 |
| Anti-Iba1 (ארנב) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| Anti-IL1 (עז) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| Anti-Ki67 (ארנב) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| Anti-MAP2 (עוף) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
| Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| Avidin/Biotin ערכת חסימה | מעבדות וקטור | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | מודל בעלי חיים |
| סוס ביוטיניל נגד עכברים | מעבדות וקטור | BA-2001 | 1:200 |
| Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | מודל | |
| צנטריפוגה | לצינורות 15 מ"ל | ||
| מיקרוסקופ קונפוקלי | ניקון | קונפוקלי A1RHD | |
| Costar 6-well Clear TC-מטופל | קורנינג | 3516 | |
| Cy3 סטרפטווידין | ג'קסון ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
| ציטוזין ובטא;-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µ |
| ערכת מצע M DAB, פרוקסידאז (עם ניקל) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| סטריאוטקס דיגיטלי | KOPF | דגם 940 | |
| DMEM/F12 | תרמו פישר 11320082 מדעי | לשימוש עבור N2 medium | |
| DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 & micro; גרם/מ"ל |
| דוקסיציקלין | סיגמא-אולדריץ' | D9891 | 2 ומיקרו; g/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי | אולימפוס | BX51 מיקרוסקופ | |
| אתנול | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | וקטור לנטי-ויראלי |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | וקטור לנטי-ויראלי |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral |
| vector H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | קו תאי גזע עובריים אנושיים תחת הסכם MTA |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| מזרק המילטון | המילטון | 7634-01 | 5 ומיקרו; L |
| HBSS | Gibco | 14175095 | ללא סידן, ללא מגנזיום - מדיום השתלה |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
| Incubator | 5% CO2, 37 ° C | ||
| Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
| מונה תאים ידני | VWR | 720-1984 | |
| מטריג'ל hESC מטריקס מוסמך, | 354277 קורנינג | לציפוי | |
| מתנול | Merck Millipore | 1060091000 | |
| כיסויי מיקרוסקופ 24 x 60 מ"מ | תרמו מדעי | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| שקופיות מיקרוסקופ | VWR | 631-1551 | |
| תוכנת מיקרוסקופ | Olympus | CellSens מדיה הרכבה | |
| Merck | 10981 | PVA-Dabco | |
| מתאם עכבר לסטריאוטקס | RWD | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | ערכת בסיסי בינוני ותוסף 5X - תרבית תאי גזע |
| מדיום תוסף N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| פניצילין-סטרפטומיצין | סיגמא-אולדריץ' | P0781 | |
| פרטקס | HistoLab | 811 | |
| מילוי | |||
| Play-Doh | |||
| Puromycin (דיהידרוכלוריד) | Gibco | A1113803 | |
| עובי משקפי כיסוי עגול מס' 1.5H (tol. ± 5 μ מ) 13 מ"מ ואוסלאש; | Marienfeld | MARI0117530 | לאימונוציטוכימיה |
| סרום | תרמו פישר | עז, חמור, סוס | |
| טיפים | לפיפטה סטרילית לנפחים 0.1-1000 ומיקרו; L | ||
| פיפטות סרולוגיות סטריליות | 5, 10, 25 מ"ל | ||
| מים סטריליים בראון | B בראון | 3626873 | |
| סוכרוז | סיגמא-אולדריץ' | S8501 | לתמיסת סוכרוז 0.5% |
| טריטון X-100 | סיגמא-אולדריץ' | X100 | |
| טריפן תמיסה כחולה | Gibco | 15250061 | |
| צינורות | Sarstedt | 15 מ"ל, אפנדורף 1.5 מ"ל | |
| פינצטה | VWR | ||
| טהורים במיוחד | מערכת מים MilliQ | ||
| קסילן | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632 (מעכב ROCK) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 ומיקרו; מ |
מקורות
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050(2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382(2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651(2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243(2021).
- Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970(2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136(2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11(2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
