מאמר שיטה

צור רגישות יתר כמודל מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי

3.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64329

⸱

26 בספטמבר 2022

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD). CHS מבוסס על רגישות עם hapten תגובתי על ידי צביעת העור המגולח של החזה והבטן, עם אתגר עור אוזן לאחר מכן עם hapten מדולל, הגורם לתגובת נפיחות כי הוא מוערך בדרכים שונות.

תקציר

רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD) שניתן לחקור בעכברים. מחקר זה נועד להציג שיטת מעבדה אובייקטיבית שעשויה לסייע בחקר תגובת CHS בעכברים, אותה ניתן למדוד ולכמת על ידי בדיקות שונות. כדי לגרום ל-CHS, ביום "0", עכברים היו רגישים לנקודה מגולחת קודם לכן על ידי צביעת עור בטן עם תערובת הפטן 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן (TNCB) בתערובת אצטון-אתנול, בעוד שעכברי בקרה שלילית היו רגישים לתערובת אצטון-אתנול לבדה ברכב. ביום "4", עובי האוזן הבסיסי נמדד במיקרומטר לפני ההתעוררות של CHS (אתגר) על ידי צביעת שתי האוזניים עם TNCB מדולל הן בקבוצות הבדיקה והן בקבוצות הביקורת. לאחר 24 שעות נמדדה נפיחות האוזן במיקרומטר. CHS הוא דוגמה לתגובה חיסונית בתיווך תאי T הגורמת לנפיחות ברקמה מודלקת, המגיעה לשיא של 24 שעות לאחר אתגר העור עם אותו הפטן. עלייה בצקת אוזניים מתואמת עם משקל אוזניים מוגבר, פעילות מיאלופרוקסידאז (MPO), ריכוז ציטוקינים פרו-דלקתיים בתמציות האוזניים, עיבוי מוגבר של הדרמיס האדמטי בבדיקה ההיסטולוגית וחדירות כלי הדם באוזן. כמו כן, נרשמה עלייה בריכוז נוגדני IgG1 ספציפיים ל-TNP בסרה של קבוצת הבדיקה בהשוואה לעכברי הביקורת. בנוסף, ניתן להעביר CHS בהצלחה עם תאי CHS-effector המתקבלים מתורמים שהיו רגישים בעבר ל-TNCB. התאים המשפיעים על CHS ניתנו תוך ורידי לעכברים נמענים תמימים, אשר לאחר מכן אותגרו עם אותו הפטן מדולל. נפיחות באוזן נמדדה במיקרומטר 24 שעות לאחר מכן.

מבוא

דרמטיטיס במגע אלרגי (ACD) היא מחלה דלקתית נפוצה בעור במדינות מתועשות הנגרמת על ידי תגובת רגישות יתר מסוג IV הנובעת מחשיפה לכימיקלים במשקל מולקולרי נמוך הנקראים הפטנס. החומרים הגורמים לרגישות למגע בבני אדם כוללים יוני מתכות כבדות (כרום, ניקל, ברזל, קובלט), טרפנטין, חומרי ריח, צבעים וחומרים משמרים הנמצאים במוצרי קוסמטיקה (למשל, p-פנילנדיאמין), תרופות מסוימות (למשל, ניאומיצין, בנזוקאין), אנטיביוטיקה β-לקטם (כלומר, פניצילין), כימיקלים המיוצרים על ידי צמחים (pentadecacatechol, חומר הנמצא בקיסוס רעיל), כמו גם הידרוקינון המשמש בתעשיית הצילום 1,2 . חומרים אטיולוגיים ACD גבוהים מאוד מכיוון שיותר מ-100,000 כימיקלים משמשים בתעשייה בלבד, ו-2,000 כימיקלים חדשים מסונתזים מדי שנה. עד כה זוהו יותר מ-3,700 מולקולות שעשויות להיות מגע עם הפטנים/אלרגנים3. תגובת רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של ACD שניתן לחקור בעכברים, שרקנים וחולדות וניתן לגרום לה על ידי יישום עור מקומי של הפטנים כימיים תגובתיים המומסים בממסים אורגניים 4,5,6. מחקר זה נועד לתאר שיטת מעבדה אובייקטיבית שעשויה לסייע בחקר תגובת CHS בעכברים, אותה ניתן למדוד ולכמת על ידי בדיקות שונות.

ה-CHS מורכב משלבי רגישות (אינדוקציה) ואפקטור (אתגר). במודלים של בעלי חיים, הפטנים נקשרים תחילה באופן קוולנטי לחלבונים בגוף כדי ליצור ניאו-אנטיגנים. במהלך שלב הרגישות, קרטינוציטים מופעלים מקדמים את הנדידה וההבשלה של תאים דנדריטיים בעור (sDCs) על ידי ייצור ציטוקים פרו-דלקתיים-נמק סרטניים α (TNF-α) ואינטרלוקין 1β (IL-1β)7. תאי לנגרהנס אפידרמליים (LCs) מציגים אנטיגנים במהלך אינדוקציה CHS ושלבי אפקטור8. LCs שנחשפו להפטן במהלך הרגישות מקדמים את האינדוקציה של תאי הוויסות והאפקט9. עדויות הולכות וגוברות ממספר מחקרים מצביעות על כך שתגובות CHS ניתנות לתיווך על ידי תאי Th1 מוגבלים מסוג CD4+ MHC Class II, המשחררים באופן מקומי אינטרפרון-γ (IFN-γ) כדי להשתמש בהחדרה דלקתית אופיינית, לימפוציטים מוגבלים ב-Tc1 מסוג CD8+ MHC מסוג I שיכולים גם לשחרר Γ IFN אך בעיקר לתווך נזק ציטוטוקסי לקרטינוציטים, וכעת גם אינטרלוקין 17 (IL-17)-המייצרים תאי Th1710, 11.

פותחו מספר מודלים שונים של CHS המשתמשיםבמינים שונים 1 2,13,14 והפטנים (השוואה מפורטת של הפטנים, ממסים שונים וזמן היישום מסוכמת בטבלה 1). העכבר, מין מעבדה הנפוץ, מציע כמה יתרונות בחקר CHS. ישנם יותר זנים, נוקאאוטים (KO) ובעלי חיים מהונדסים בקרב עכברים בהשוואה למינים אחרים, מה שהופך אותם לחיה מושכת מאוד15. בנוסף, מודל CHS דורש בעלי חיים רבים, ועכברים הם חסכוניים יותר כאן. מודלים של בעלי חיים אינם מחקים ACD בכל ההיבטים; בפרט, הם מראים קרום ו desquamation, אשר אינו נפוץ עבור בני אדם 16,17. המאפיינים של מחלה כרונית הם מאתגרים להתרבות, בעיקר משום המודל המתואר אינו מניח את היישום של hapten במשך תקופה ארוכה של זמן. עם זאת, אושר כאן כי רבים מההיבטים המשמעותיים של ACD משוחזרים. כמו כן הוכח כי, כמו בבני אדם, תכונות אלה קשורות לתגובות אלרגיות מקומיות. הבחירה של hapten, הממס שלה, ואת היישום שלה המתואר בפרוטוקול זה הוכתבו על ידי העובדה כי התוצאות אושרו על ידי בדיקות מבחנה רבות וכי הוא נבדק ושונה במעבדה במשך שנים רבות עד הגרסה הנוכחית הוקמה. מודלים של מורין מאפשרים ניתוח של תת-קבוצות תאים או ציטוקינים המעורבים בפיתוח ACD וחיוניים להערכות פרה-קליניות של טיפולים חדשים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שהוצגו במאמר זה נערכו על פי הנחיות הוועדה האתית המקומית הראשונה לניסויים בבעלי חיים בקרקוב. כל ההליכים שתוארו בוצעו על פי ההמלצות המקומיות, במיוחד לגבי שימוש בקטמין/קסילאזין כחומר הרדמה, שימוש בשני צידי האוזניים למריחת החומר/הפטן, חיתוך האוזן ואיסוף דם על ידי הסרת גלגל העין. BALB/c (הפלוטיפ H-2d), CBA/J (H-2k) ו-C57BL/6 (H-2b) עכברים זכרים ונקבות, בני 6-12 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי (ראו טבלת חומרים). עבור מובהקות סטטיסטית, עדיף שכל קבוצת עכברים מורכבת מ-10-12 בעלי חיים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. נקו את שולחן הניתוחים עם תמיסת אתנול של 70% לפני ואחרי כל ההליכים. אם אתם משתמשים בעכברים הדורשים תנאים סטריליים, בצעו את כל הפעולות בארון בטיחות ביולוגית.

2. סימון עכברים לצורך זיהוי

  1. תייג את העכברים על ידי גילוח העור עם סכין גילוח: #0 - לא מסומן, #2 - על הכפה הקדמית הימנית, #3 - בצד ימין, #4 - על הכפה האחורית הימנית, #5 - בבסיס הזנב, #6 - על הכפה האחורית השמאלית, #7 - בצד שמאל, #8 - על הכפה הקדמית השמאלית.
    הערה: בשל התגובה המושרה, לא ניתן לסמן עכברים באופן קלאסי על ידי ניקוב או תיוג אוזניים. העכברים לא הורדו בעת התיוג.

3. אינדוקציה של CHS

הערה: הליך זה מתואר באיור 1.

  1. בצע את הרגישות (אינדוקציה) בהתאם לשלבים הבאים.
    1. ביום "0", לגלח עכברים על החזה והבטן (מרובע 2 ס"מ x 2 ס"מ) על ידי מריחת סבון אפור עם מים וגילוח עם סכין גילוח.
      הערה: לפני מריחת hapten, יש להמתין 6 שעות כדי שהעור לא יהיה מגורה.
    2. הכן 5% hapten: 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB, ראה טבלת חומרים) בתערובת אצטון-אתנול (יחס 1:3) או רכב בלבד (אצטון-אתנול). הכינו תמיסות ממש לפני השימוש בבקבוקון זכוכית והגנו עליו מפני אור על ידי כיסוי הבקבוקון ברדיד אלומיניום.
    3. באותו יום, הרגישו את העכברים על ידי מריחת 150 μL של 5% hapten על הנקודה המגולחת בעבר. בקבוצת עכברי הביקורת, יש למרוח את הרכב לבדו כדי להעריך את התגובה הדלקתית הלא ספציפית. לפני שאתם מחזירים את החיה לכלוב, חכו 30 שניות, ותנו להפטן להתייבש.
      אזהרה: השתמש בכפפות; TNCB גורם לתגובה אלרגית קשה אצל רוב האנשים.
  2. בצעו את ההתעוררות (אתגר) ואת מדידת הנפיחות באוזן.
    1. ביום "4", הכינו 0.4% hapten: TNCB בתערובת אצטון-אתנול (יחס 1:1). הכינו את התמיסה ממש לפני השימוש בבקבוקון זכוכית והגנו עליו מפני אור על ידי כיסוי הבקבוקון ברדיד אלומיניום.
    2. מרדימים את העכברים בהזרקה תוך-צפקית (i.p.) של תערובת של קטמין (90-120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים) להרדמה עמוקה. ודא שהעכבר מורדם במלואו למשך 5 דקות לפחות על ידי צביטה בבוהן.
    3. מדוד את עובי האוזן (מדידה של 0 שעות, קו בסיס) באמצעות מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) על ידי צופה שאינו מודע לקבוצות הניסוי.
    4. יש למרוח 10 μL של 0.4% hapten על שני צידי האוזניים בשתי הקבוצות (בדיקה ובקרה). לפני שאתם מחזירים את החיה לכלוב, חכו 30 שניות ותנו להפטן להתייבש.
    5. ביום "5", 24 שעות לאחר יישום הפטן, חזור על שלבים 3.2.2-3.2.3 למדידת 24 שעות.
    6. הערך את תגובת ה- CHS על ידי חישוב ההבדל בעובי האוריקל לפני ואחרי האתגר עם הפטן: עובי אוזן 24 שעות (μm) - עובי אוזן 0 שעות (μm). ספרו כל אוזן כמדידה נפרדת. לאחר מכן, ביטאו את נפיחות האוזן במיקרומטרים (μm) ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM) (טבלה 2, איור 3).

4. ביופסיות אוזניים

  1. מיד לאחר המדידה של 24 שעות של עובי האוזן (כאשר העכבר עדיין נמצא בהרדמה עמוקה), חתכו את האוזניים קרוב ככל האפשר לגולגולת עם מספריים. אספו את הביופסיות מהצד הדיסטלי של האוזניים על ידי יצירת אגרוף בקוטר 6 מ"מ באמצעות אגרוף ביופסיה (ראו טבלת חומרים).
    1. מדוד את משקל האוזן (שלב 4.2) ובנוסף בצע אחת מהבדיקות הבאות על אותה ביופסיה של האוזן: בדיקת מיאלופרוקסידאז (MPO) (שלב 4.3) או מדידה במבחנה של ריכוז הציטוקינים בתמציות האוזן (למשל, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [שלב 4.4]).
      הערה: חתכו את האוזניים לפני איסוף הדם. לאחר הליך זה, יש להרדים את העכברים (למשל, על ידי נקע צוואר הרחם).
  2. מדוד את המשקל של כל ביופסיה של אוזן על המאזן האנליטי ובטא אותו במיליגרם (מ"ג) (איור 4).
  3. בצע בדיקת MPO בהתאם לשלבים הבאים.
    1. הכן מאגר הומוגניזציה על ידי המסת 0.5% הקסאדצילטרימתילמוניום ברומיד ב 50 mmol זרחן חיץ KH2PO4/Na2HPO4 והתאמת ה- pH ל- 6.0 (השתמש בטמפרטורת החדר, RT).
    2. הומוגניזציה של הביופסיות בצינורות מיקרו-צנטריפוג' של 2 מ"ל עם 500 μL של חיץ מוכן למשך 10 דקות באמצעות הומוגנייזר עם חרוזי נירוסטה בקוטר 5 מ"מ (הוסף שני חרוזים/בקבוקון) (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן, קררו את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והומוגניים אותה למשך 10 דקות נוספות.
      הערה: לצינורות Microcentrifuge יש תחתית עגולה כך שהחרוזים יכולים לנוע בקלות.
    3. להקפיא את ההומוגנאטים ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הפשרה ומערבולת (יש לוודא שהדגימות מופשרות). חזור על הליך זה 3x.
    4. צנטריפוגה ההומוגנטים ב 3,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (64 °F). קוצרים את הסופרנאטים עם פיפטה. להביע את פעילות ה- MPO ביחידות (U) לכל 1 מ"ג חלבון.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. הדגימות יציבות בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך 3 חודשים.
    5. כדי למדוד את פעילות ה-MPO, בצעו תגובה אנזימטית על ידי ערבוב של 20 μL של סופרנטנט ו-200 μL של מצע MPO (0.167 מ"ג/מ"ל של אורתו-דיאניסין דיהידרוכלוריד ב-50 מילימול של KH2PO4/Na2HPO4 buffer עם 5 x 10−4% H202) והוסיפו ל-96 צלחות שטוחות-תחתית שטוחות. דגירה של הצלחות למשך 20 דקות ב- RT.
    6. הכן את העקומה הסטנדרטית על ידי שימוש ב- 20 μL של תקן MPO בריכוזים מ- 0.008 U עד 0.5 U ב- 200 μL של מצע ה- MPO. הכן את הדגימה הריקה עם מצע ה- MPO בלבד.
      אזהרה: השתמשו במסכה תוך כדי עבודה עם אורתו-דיאניסין דיהידרוכלוריד.
      הערה: הלוחות חייבים להיות עשויים מפוליפרופילן, בעל יכולת קשירה נמוכה יותר כך שחלבונים או DNA לא ייקשרו.
    7. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) באורך גל של λ = 460 ננומטר. התגובה האנזימטית יציבה במשך 10 דקות. קרא את פעילות ה- MPO בדגימות שנבדקו מהעקומה הסטנדרטית.
    8. כדי למדוד את ריכוז החלבון, השתמשו ב-20 μL של ה-supernatant, ערכו בדיקה עם ערכת חומצה ביצינכונינית לקביעת חלבונים (ראו טבלת חומרים), ומדדו את ה-OD ב-λ = 562 ננומטר (איור 5).
  4. לבצע מדידה במבחנה של ציטוקינים בתמצית האוזן.
    1. הומוגניזציה של ביופסיות האוזן ב-RT בצינורות מיקרו-צנטריפוג' של 2 מ"ל עם ריאגנט מיצוי חלבון רקמה (T-PER) של 500 μL למשך 10 דקות באמצעות הומוגנייזר עם חרוזי נירוסטה בקוטר 5 מ"מ (הוסיפו שני חרוזים/בקבוקון). לאחר מכן, קררו את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והומוגניים אותה למשך 10 דקות נוספות.
      הערה: לצינורות Microcentrifuge יש תחתית עגולה כך שהחרוזים יכולים לנוע בקלות.
    2. צנטריפוגה ההומוגנטים ב 3,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (64 °F).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. הדגימות יציבות בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
    3. הערך את רמות הציטוקינים באמצעות ערכת ELISA הזמינה מסחרית (לדוגמה, IFN-γ) (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן (איור 6).

5. היסטולוגיה של רקמת האוזן

  1. מיד לאחר המדידה של 24 שעות של עובי האוזן, כאשר העכבר עדיין מורדם עמוקות, חתכו את האוזניים קרוב ככל האפשר לגולגולת עם המספריים (שלב 4.1).
    הערה: לאחר הליך זה, יש להרדים את העכברים (למשל, על ידי נקע צוואר הרחם).
  2. בצע הטבעת פרפין של בלוקי הרקמה בהתאם לשלבים הבאים.
    1. מיד לאחר ההסרה, מכניסים את האוזן לכ-10 מ"ל של 10% פורמלין למשך 24 שעות.
    2. מכניסים את האוזניים לקלטת עיבוד רקמות. שים את הקסטות במעבד אוטומטי (ראה טבלת חומרים) למחזורי התייבשות (אלכוהול 70%, 90%, 100%, 30 דקות כל אחד ב- RT), מחזורי ניקוי (קסילן 3x, 30 דקות כל אחד ב- RT), ומחזורי חדירת שעווה (פרפין 3x, 30 דקות כל אחד ב- 56 °C).
    3. הסר את הקלטות מהמעבד האוטומטי, והחזק את לוחית החימום עד שתידרש. ממלאים את תבנית השעווה בשעווה חמה (מהמתקן).
    4. הסר את החלקים מהקלטת עם מלקחיים מחוממים והניח אותם בתבנית; לאחר מכן, מניחים את בסיס הקלטת בחלק העליון של התבנית ולאחר מכן ממלאים בשעווה נוספת. מניחים אותו במים צוננים על צלחת קרה למשך 30 דקות, כך שהפרפין מתמצק ויוצר גוש המכיל את הדגימה.
    5. השתמש במיקרוטום סיבובי (ראה טבלת חומרים) כדי לחתוך מקטעים בעובי של כ-5 מיקרומטר. צפו את החלקים באמבטיה חמה כדי לשטח אותם. הרימו את החלקים על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. אפשרו להם להתייבש ב-RT כדי לוודא שהמקטעים נצמדים לשקופית.
      הערה: השתמש בשקופיות המבטלות את הצורך ליישם חומרי דבק או ציפויי חלבון כדי למנוע אובדן של חלקי רקמה במהלך הכתמה.
  3. בצעו צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E).
    1. הכינו 17 כלים מכתימים עם הדברים הבאים: קסילן (ארבע מנות), 100% אתנול (אלכוהול מוחלט) (ארבע מנות), 90% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול, 50% אתנול, PBS (שלוש מנות), תמיסת המטוקסילין, תמיסת אאוזין. העבר את השקופיות ממנה אחת לאחרת בהתאם לשלבים הבאים, ובצע את הכל ב- RT.
      הערה: ניתן לחזור על ההליך בכל מנה בערך פי 10 (למשל, אם משתמשים במנה של 20 שקופיות, ניתן להכין 200 כתמים מבלי לשנות את הנוזלים).
    2. Deparaffinize את החלקים על ידי דגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 30 דקות באינקובטור. טבלו את השקופיות בקסילן למשך 30 דקות. חוזרים על 1x בקסילן חדש למשך 30 דקות.
    3. טבלו את השקופיות ב-100% אתנול למשך 5 דקות. חזרו על 1x ב-100% אתנול חדש למשך 5 דקות. טבלו את השקופיות בשורת האתנול, 90%, 80%, 70% ו-50%, למשך 2 דקות בכל דילול.
    4. יש לטבול את השקופיות במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) למשך 5 דקות. נגבו את עודפי הנוזלים מסביב לרקמה ומהצד האחורי של המגלשות.
    5. הכתימו את החלקים בתמיסת המטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך 7-8 דקות. יש לשטוף במים זורמים במשך 30 שניות מהצד האחורי כדי לא לפגוע בקטעים. חזור על שלב 5.3.4.
    6. הכתימו את החלקים בתמיסת eosin (ראו טבלת חומרים) למשך 30 שניות. יש לשטוף כאמור בשלב 5.3.5 ולאחר מכן חזור על שלב 5.3.4.
    7. טבלו את השקופיות ב-100% אתנול (אלכוהול מוחלט) למשך 2 דקות. יש לחזור על 1x ב-100% אתנול חדש למשך 2 דקות.
    8. טבלו את השקופיות בקסילן למשך 5 דקות. חזרו על 1x בקסילן חדש למשך 5 דקות.
    9. תנו למקטעים להתייבש באוויר במשך 15 דקות ב-RT. הוסיפו טיפה של מדיום הרכבה (ראו טבלת חומרים) על מכסה ואז הניחו אותה בראש המקטע.
  4. בחנו את הקטע תחת מיקרוסקופ אור תחת הגדלה של פי 20 או 40x, וצלמו תמונות (איור 7).

6. בדיקת חדירות כלי דם

הערה: לחלופין למדידת עובי האוזן, ניתן לבצע בדיקת חדירות כלי דם.

  1. הרגישו את העכברים ביום "0" (שלבים 3.1.1-3.1.3), ולאחר מכן, ביום "4", הרימו את העכברים (שלב 3.2.2) והחלו ישירות את הפטן על האוזניים (שלב 3.2.4), תוך השמטת מדידת האוזן של 0 שעות.
  2. בשעה 23 שעות לאחר האתגר, הרדמה את העכברים (שלב 3.2.2).
  3. הזריקו תוך ורידי (כלומר) 8.3 μL/g משקל גוף של 1% צבע כחול של אוונס (ראו טבלת חומרים) ב-Dulbecco′s S S פוספט-בופר מלוחים (DPBS).
  4. הרדמה את העכברים בהרדמה עמוקה שוב (שלב 3.2.2)-1 שעה לאחר הזרקה כחולה של אוונס.
  5. אסוף ביופסיות אוזניים (שלב 4.1).
    הערה: לאחר הליך זה, יש להרדים את העכברים (למשל, על ידי נקע צוואר הרחם).
  6. מוציאים את הצבע מהרקמה, מניחים אגרופי אוזניים לתוך הצינורות המכילים 1 מ"ל של פורמיד, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% CO2 למשך 18 שעות.
  7. צנטריפוגה את הביופסיות ב 3,000 x g במשך 3 דקות ב RT. לאסוף את supernatants עם פיפטה.
  8. מדוד את ה-OD באורך גל של λ = 565 ננומטר בלוחות בעלי תחתית שטוחה של 96 היטב כנגד ריק המכיל פורמיד. הצבע יציב במשך 24 שעות. קראו את ריכוז דגימות הבדיקה מהעקומה הסטנדרטית (השתמשו בריכוזים של כחול אוונס הנעים בין 0.2-30 מיקרוגרם של צבע/מ"ל פורמיד) (איור 8).
    הערה: הלוחות חייבים להיות עשויים מפוליפרופילן, בעל יכולת קשירה נמוכה יותר כך שחלבונים או DNA לא ייקשרו.

7. איסוף סרום ומדידת נוגדנים נגד אימונוגלובולין (IgG1)

  1. לאחר איסוף ביופסיות אוזניים (שלב 4.1), כאשר העכבר עדיין נמצא בהרדמה עמוקה, הסר את גלגל העין עם פינצטה, הפעיל לחץ עדין על העכבר ואסף דם מהסינוס הרטרו-מסלולי לתוך הצינור (בקבוקון עם ג'ל להשגת סרום, ראה טבלת חומרים). שיטה חלופית לאיסוף דם עשויה להיות לנקב את הלב עם מזרק ולאסוף את הדם.
    הערה: יש לאסוף את הדם לאחר הסרת האוזניים. יש להשתמש באותה שיטה של דימום לאורך מחקר שלם בשל הבדלים פוטנציאליים בפרמטרים של הדם18. לאחר הליך זה, יש להרדים עכברים (למשל, על ידי פריקה של צוואר הרחם).
  2. הפוך מינימום של 6x, המתן 30 דקות עד שהדם ייקרע, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,300-2,000 x g במשך 10 דקות ב- RT.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. המדגם יציב ב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.
  3. מצפים צלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 היטב עם 50 μL של אלבומין בסרום בקר מצומד עם 2,4,6-טריניטרופניל (TNP-BSA) מומס ב-DPBS בקונצרט של 10 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר מכן, מצפים את הצלחת השנייה באלבומין סרום בקר (BSA) בלבד המומס ב-DPBS (רקע) בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: סרום העכבר מכיל נוגדנים (Abs) נגד BSA, ולכן יש לבדוק את הדגימות בשתי הצלחות, ולאחר מכן, יש לבצע חישוב (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. לשטוף את הצלחות עם 300 μL של DPBS המכיל 0.05% Tween 20. חזור על 3x.
  5. הכן מדולל בדיקה (AD): DPBS המכיל 1% BSA. חסום את הבארות עם AD למשך שעה אחת ב- RT. שטפו שוב (שלב 7.4).
  6. הכינו תקן פנימי (iSTD): הרגישו את העכברים עם TNCB (שלבים 3.1.1-3.1.3), ו-10 ימים לאחר הרגישות, אספו ושאלו את הסרום מכל התורמים (שלב 7.1 ושלב 7.2).
  7. הוסף לצלחת 50 μL של ריכוזים מדורגים של iSTD מדולל עם AD ליצירת העקומה הסטנדרטית (המתוארת בטבלה 3). הוסיפו לצלחת 50 μL של דגימות סרום. בדוק כל דגימה ועקומה סטנדרטית בשתי הלוחות (TNP-BSA ו- BSA מצופה). דגירה למשך 2 שעות ב- RT. לשטוף את הצלחות (שלב 7.4).
  8. הוסף 50 μL של נוגדן חד שבטי נגד עכבר IgG1 שעבר ביוטינילציה (mAb, ראה טבלת חומרים) מדולל 1:250 עם AD ודגירה למשך שעה אחת ב- RT. שטפו שוב (שלב 7.4).
  9. הוסיפו 50 μL של סטרפטווידין פרוקסידאז חזרתי (HRD streptavidin, ראו טבלת חומרים) מדולל 1:2000 עם AD, ודגירה למשך 30 דקות ב-RT בחושך. שטפו את הצלחת (שלב 7.4).
  10. הוסף 50 μL של מצע TMB (ראה טבלת חומרים) ודגירה למשך 30 דקות ב- RT בחושך.
  11. לעצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 25 μL של 1 M H2SO4; התגובה יציבה במשך 30 דקות.
  12. מדוד את ה-OD באורך גל של λ = 450 ננומטר וברקע של 570 ננומטר (יש להפחית את הרקע מכל מדידה של 450 ננומטר). בעת הצגת התוצאות, הפחת את מדידות BSA מה- TNP-BSA עבור דגימות ועקומת התקן. לאחר מכן, חשב את היחידה (U) של נוגדנים לפי העקומה הסטנדרטית (איור 9).

8. העברה מאמצת של תאי CHS-effector

הערה: הליך זה מתואר באיור 2.

  1. תורמים (ביחס של אחד מתורם:1 מקבל): רגישים לעכברים עם TNCB ביום "0" (שלבים 3.1.1-3.1.3).
  2. ביום "4", הרדמה את ההרדמה העמוקה של העכברים (שלב 3.2.2).
  3. לבודד עם מלקחיים את בלוטות הלימפה בבית השחי ובמפשעה (ALNs) וטחולים (SPLs). אגד את ה-ALNs בבקבוקון אחד ואת ה-SPLs בבקבוקון אחר.
    הערה: יש בלוטת לימפה אקסילרית אחת מאחורי שריר החזה בכל בית השחי. בלוטת לימפה מפשעתית אחת באזור הירך ממוקמת ליד שלושה כלי דם. הטחול ממוקם בצד שמאל של הגוף מאחורי המעי והקיבה19. עבוד עם כלים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על תנאים סטריליים. לאחר הליך זה, יש להרדים את העכברים (למשל, על ידי נקע צוואר הרחם).
  4. רסקת רקמה בין הקצוות הקפואים של שתי שקופיות מיקרוסקופ. מעבירים את תרחיף התא דרך מסננת תאים בגודל נקבובית של 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
  5. שטפו את התאים עם DPBS בתוספת 1% סרום בקר עוברי (FBS). צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C. דקאנט את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא הנותר ב-1-5.0 מ"ל של DPBS.
  6. ספרו את התאים החיים באמצעות המוציטומטר20 עם כחול טריפאן, וערבבו 10 μL של תרחיף התא עם 90-990 μL (תלוי במספר התא) של כחול טריפאן. קחו בחשבון את הדילול בעת חישוב מספר התא (10x-100x).
  7. הכינו תערובת של ALNs ו-SPLs (יחס 1:1): 8.0 x 106 עד 7.0 x 107/עכבר ב-200 μL של DPBS.
  8. נמענים (עכברים סינגניים נאיביים): מרדימים עכברים נימים (שלב 3.2.2) ומזריקים ל-i.v. תערובת מוכנה של התאים בעלי אפקט CHS (שלב 8.7). בקבוצת הביקורת של העכברים, אין להזריק תאים.
  9. מדוד את עובי האוזן לפני (0 שעות) ואחרי (24 שעות) את האתגר (שלבים 3.2.1-3.2.6) (איור 10).
  10. בנוסף, בצע בדיקות על תאים מבודדים של CHS-effector (למשל, פנוטיפ תאי או מדידת ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי CHS-effector על ידי ציטומטריה של זרימה). ניתן גם לבסס תרביות תאים, וניתן להעריך את יכולתם של התאים בעלי אפקט CHS להתרבות בנוכחות האנטיגן או את כמות הציטוקינים המופרשים בסופרנאטים של התרבית21,22 (נתונים שלא הוצגו).
    הערה: ביצוע בדיקות נוספות דורש בהתאמה יותר תורמי תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עבור אינדוקציה CHS, החיות היו רגישות באמצעות צביעת עור (בטן) עם 150 μL של 5% TNCB או sham רגיש עם הרכב בלבד. ביום "4", תגובות הנפיחות באוזן של שתי האוזניים הושרו על ידי צביעת מגע (אתגר) עם 10 μL של 0.4% TNCB בשני העכברים שהיו בעבר במגע עם TNCB (קבוצת בדיקה) והן בעכברים של קבוצת הביקורת (רגישות ל-sham). הנתונים שהוצגו מראים שהעכברים הרגישו ל-TNCB וקראו תיגר 4 ימים לאחר מכן פיתחו נפיחות מוגברת באופן משמעותי באוזן בהשוואה לעכברים בעלי רגישות דומה (איור 3, טבלה 2, קבוצת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

CHS מושרה באמצעות haptens, אשר נקשרים לאנטיגנים של חלבון עצמי בעור, ויוצרים ניאו-אנטיגנים. CHS מתווך על ידי גיוס חוץ-וסקולרי מקומי של תאי T ספציפיים לאנטיגן, מה שגורם לנפיחות ברקמה המאותגרת, המגיעה לשיא של 24 שעות לאחר חשיפת העור המשני לאותו הפטן6. הנפיחות של הרקמה נגרמת בעיקר על ידי חדירה של לויקוציטים ותצהיר פיברין תלוי לויקוציטים24. ניתן לזהות שינויים אלה באמצעות מיקרומטר המודד את נפיחות האוזן של עכברים רגישים ומאותגרים על ידי הפטן לעומת עכברים רגישים ומאותגרים....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי SUBZ subvention. A020.22.060 של האוניברסיטה הרפואית בוורוצלב, פולין, ועל ידי מענקים ממשרד המדע וההשכלה הגבוהה N N401 545940 לטרשת נפוצה ו- IP2012 0443 72 ל- MMS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
70% אתנולMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה65350-Mלחיטוי פני השטח
צלחות תחתונות שטוחות 96 בארות, פוליפרופילןGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, אוסטריה655101למדידת MPO ו-Evans blue - הלוחות צריכים להיות עשויים מפוליפרופילן, בעל יכולת קשירה נמוכה יותר כך שחלבונים או DNA לא יקשרו
אצטון (מגיב ACS, ≥ 99.5%)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה179124
רדיד אלומיניוםMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהZ185140
איזון אנליטיSartorius Weighing Technology GmbH, גטינגן, גרמניהPRACTUM224-1s, 29105177
מעבד רקמות אוטומטיMediMeas Instruments, Sarsehri, הריאנה, הודוMTP-E-212הכן באופן אוטומטי דגימות רקמה על ידי קיבוע, ייבוש, ניקוי והחדרה שלהן עם פרפין
BD Vacutainer SST II Advance (שפופרת עם ג'ל להשגת סרום)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD
ערכת חומצה בינצ'ונינית לקביעת חלבוןMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהBCA1-1KT
ביוטין חולדה נגד עכבר IgG1בקטון דיקינסון (BD Biosciences), פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב553441
BSA (אלבומין בסרום בקר)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניהA9418, מסננת תאים 2 מ"ג/מ"ל
גודל נקבוביות 70 μ mBIOLOGIX, סין15-1070מתאים לצינורות של 50 מ"ל
CoverslipVWR, Radnor, פנסילבניה, ארצות הברית631-158324 מ"מ, אך ניתן להשתמש בגדלים שונים
קיבולת פיפטות חד פעמיות: 5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"לMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′ s פוספט חוצץ מלח)ThermoFisher Scientific,  וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב14190144ללא סידן, ללא מגנזיום, תרבית תאי יונקים
DPX Mountant להיסטולוגיהMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה6522אמצעי הרכבה עבור H-E, עשוי לשמש כחלק אחר למשל, קנדה בלזם
Dumont 5 פינצטה - ישרAnimalab, פוזנן, פולין11251-10FSTמכשירים כירורגיים לפרוצדורות בעכברים (יש לעקר)
פינצטה Dumont 7 - כפופהAnimalab , פוזנן, פולין11272-50FSTמכשירים כירורגיים להליכים בעכברים (יש לעקר)
תמיסת Eosin Y,Merck KGaA אלכוהולית, דרמשטדט, גרמניהHT110116
צינורות נעילת כספת Eppendorf 1.5 מ"לEppenforf, גרמניה3,01,20,086מפוליפרופילן
Eppendorf, 2.0 מ"לEppenforf, גרמניה3,01,20,094פוליפרופילן, תחתית עגולה (חרוזי ההומוגניזציה יכולים לזוז בקלות)
אתנול 100% (אלקוהול מוחלט)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.07017
אתנול 96%Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.59010
Evans blueMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהE2129
FBS (סרום בקר עוברי)ThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב
A3160802 תמיסת פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניהHT501128
פורממיד 99.5% (GC)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניהF7503
-20 ° CBosch, גרמניהמקרר GSN54AW30
+4 ° C / מקפיא -20 & deg; CBosch, גרמניהKGV36V10תרבית תאי יונקים, מוסמכת, ברזיל, 10 x 50 מ"ל
זכוכית microskope, SuperFrost PlusVWR, Radnor, פנסילבניה, ארצות הברית631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449שקופיות המבטלות את הצורך במריחת חומרי דבק או ציפויי חלבון, כדי למנוע אובדן חלקי רקמה במהלך הצביעה.
לוח גרף פריזמהGraphPad תוכנה בע"מv. 9.4.0
סבון אפורPollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., פוליןBialy jelen סבון בראפור סבון בר טבעי היפואלרגני. מוצר זמין לכלל הציבור
H2SO4 (חומצה גופרתית) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, ארה"ב612-5719תא ספירה ידני מומלץ, שהוא מדויק יותר
Hexadecyltrimethylammonium bromideMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהH5882
הומוגנייזרQIAGEN Hilden, גרמניהTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234הומוגנייזר עם חרוזי נירוסטה (קוטר 5 מ"מ) לצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל
חזרת peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, ארה"בSA-5004-1
תמיסת מי חמצן (H202)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניהH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, גרמניה4107106837 oC באטמוספירה של 5% CO2, ו-65 0C לדפרפיניזציה של הסעיפים להיסטולוגיה
קטמין 100 מ"ג/מ"ל, פתרון להזרקהBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, פוליןcat.# לא זמין
KH2PO4 (אשלגן דימימן פוספט) 99.995% בסיס נטול מיםMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.05108
צנטריפוגת מעבדהHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, גרמניהמהירות B00013899עד 300 x גרם, עם קירור ל-4 0C
צנטריפוגת מעבדהHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, גרמניה75002425מהירות ל-3,000 x גרם, עם קירור ל-4 מסכת 0C
(FFP2)VWR, רדנור, פנסילבניה, ארצות הברית111-0917לעבודה עם עכברים אורתו-דיאניזין דיהידרוכלוריד
יחידת גידול של הקתדרה למדעים ביו-רפואיים, הפקולטה למדעי הבריאות, המכללה הרפואית של אוניברסיטת ג'גילוניאן, קרקוב, פוליןCBA/J, C57BL/6
מיקרומטרMitutoyo, טוקיו, יפן193-111ספרות מיקרומטר חיצוני, עצירת מחגר, טווח 0-25 מ"מ, סיום 0.001 מ"מ, דיוק +/- 0.002 מ"מ, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
מיקרופלייט, 96 באר, מיקרולון, כריכה גבוהה (למבחן ELISA)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, אוסטריה655061עם משטחי קשירה maxi-sorp לתוצאות אמינות וניתנות לשחזור במבחנים קולומטריים
מיקרוסקופ עם יעדיםLeica Microsystems CMS GmbH, גרמניהDM1000, 294011-082007ההיסטולוגיה המוצגת במאמר בוצעה תחת מערכת ההדמיה ThermoFisher Scientific EVOS M5000, עם מטרות: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD ו-FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase מלויקוציטים אנושיים (תקן MPO)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניהM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (נתרן פוספט הפטהידרט)Merck KGaA, דרמשטאדט, גרמניהS9390
Olive-oilMerck KGaA, דרמשטאדט, גרמניה75343OptEIA טהור, טבעי
IFN-γ ELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב555138
אורתו-דיאניזין דיהידרוכלורידMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהD3252
שעוות פרפיןMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה76242חרוזים, PBS מוצק שעווה
(מי מלח חוצץ פוספט)ThermoFisherScientific,  וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב20012027pH 7.2, מד pH של תרבית תאי יונקים
Elmetron, פוליןCP-401
פיפטות, נפח משתנה עם קצותMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהEP3123000900-1EA3-pack, אפשרות 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, כולל epT.I.P.S.
סכין גילוחVWR, רדנור, פנסילבניה, ארצות הבריתPERS94-0462להבי מגרד וחותך, קצה יחיד, עמוד שדרה מאלומיניום, 100 להבים לקופסה, עטוף בנפרד
מיקרוטום סיבוביMRC מעבדה-מכשירים, אסקס, CM20 2HU UKHIS-202A
מספריים - ישר, חד / חדAnimalab, פוזנן, פולין14060-10FSTמכשירים כירורגיים לפרוצדורות בעכברים (יש לעקר)
מכסה בורג (חלק עליון פתוח)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה27056מכסה חור פוליפרופילן שחור, לשימוש עם 22  בקבוקון מ"ל עם 20-400 חוט
ספקטרופוטומטרBioTek Instruments, ארה"ב201446ספקטרופוטומטר מיקרופלייט אוניברסלי: λ טווח: 200 - 999 ננומטר, טווח מדידת ספיגה: 0.000 - 4.000
צלחת מכתים ABS 20 שקופיות עם מתלהMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהS6141למשל 20 כלי צביעה שקופיות עם כיסויים, מתלה שקופיות וידית
אגרוף ביופסיה חד פעמי סטרילי 6 מ"מIntegra LifeSciences, פרינסטון, ניו ג'רזי, ארה"ב33-36
מספריים כירורגייםAnimalab, פוזנן, פולין52138-46מכשירים כירורגיים לפרוצדורות בעכברים (יש לעקר)
קלטות לעיבוד רקמותMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהZ672122עיבוד רקמות / הטמעת קלטות עם מכסה
סט ריאגנטים מצע TMBBecton Dickinson (BD Biosciences), פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)Tokyo Chemical Industry Co., LTD, יפןC0307
TNP-BSA (אלבומין בסרום בקר מצומד עם 2,4,6-trinitrophenyl)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (מגיב לתוספת חלבון רקמות)ThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב78510
צינורות 15 מ"ל סטריליMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהCLS430055 (קורנינג)פוליפרופילן, תחתית חרוטית
צינורות 50 מ"ל,Merck KGaA סטרילי, דרמשטדט, גרמניהCLS430290 (קורנינג)פוליפרופילן, תחתון חרוטי
Tween 20Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניהבקבוקונים P1379
בורג עליון, זכוכית שקופה (בקבוקון בלבד) 22 מ"לMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה27173להכנת הפטן, מוברג כך שלא יתאדה
אמבט מיםAJL אלקטרוני, פוליןLW102
מתקן שעווה (פרפין)VWR, רדנור, פנסילבניה, ארצות הברית114-8737
תמיסת קסילזין (קסילפן 20 מ"ג/מ"ל) להזרקהVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# לא זמין
קסילן (דרגה היסטולוגית)Merck KGaA (גרמניה דרמשטאדט) 534056
366882 בדיקות וניתוח חלבון , צינורות נעילה בטוחה מקפיא עכבר ,

מקורות

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016(2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765(2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

תגיות

T

מאמרים קשורים