שיטה לחקר הקשר בין מבנה הקולגן המקומי לבין התכונות המכניות של רובד טרשתי ברקמה סיבית

Summary

פיתחנו צינור הדמיה מכנו כדי לחקור את תכונות הרובד הטרשתי ההטרוגני, המבני והמכני. צינור זה מאפשר התאמה של הזווית המקומית הדומיננטית ופיזור כיוון סיבי הקולגן, התנהגות הקרע וטביעות האצבע המאמץ של רקמת הרובד הסיבי.

Abstract

קרע של פלאקים טרשת עורקים בעורקים הכליליים והעורקים התרדמה הוא הגורם העיקרי לאירועים קרדיווסקולריים קטלניים. עם זאת, מכניקת הקרע של רקמת הרובד ההטרוגנית, הקולגן מאוד, וכיצד זה קשור למבנה הסיבי של הרקמה, עדיין לא ידועים. צינורות קיימים לחקר מכניקת הפלאק מוגבלים להשגת מאפיינים מכניים גולמיים בלבד של רקמת הרובד, בהתבסס על ההנחה של הומוגניות מבנית של הרקמה. עם זאת, רקמת רובד סיבי היא הטרוגנית מבחינה מבנית, ניתן לטעון בעיקר בשל שונות מקומית בארכיטקטורה של סיבי קולגן.

צינור ההדמיה המכנו-הדמיה המתואר כאן פותח כדי לחקור את תכונות הרובד המבני והמכני ההטרוגניות. בצנרת זו, ארכיטקטורת הקולגן המקומית של הרקמה מאופיינת באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון (MPM) עם דור הרמוני שני (SHG), והתנהגות הכשל של הרקמה מאופיינת בתנאי בדיקת מתיחה חד צירית באמצעות ניתוח מתאם תמונה דיגיטלי (DIC). צינור ניסויי זה מאפשר התאמה של הזווית המקומית השלטת ופיזור כיוון סיבי הקולגן, התנהגות הקרע וטביעות האצבע המאמץ של רקמת הרובד הסיבי. הידע המתקבל הוא המפתח להבנה, חיזוי ומניעה טובים יותר של אירועי קרע רובד טרשתי.

Introduction

שבץ איסכמי, הנגרם לעיתים קרובות על ידי קרע ברובד טרשתי בעורקי התרדמה, הוא אחד הגורמים המובילים לתמותה ותחלואה ברחבי העולם¹. עם זאת, אסטרטגיות תכנון הטיפול הניתוחי הנוכחיות למניעת שבץ הקשור לטרשת עורקים אינן כוללות הערכת סיכון לקרע פלאק². הסיבה העיקרית לכך היא שסמנים ביולוגיים בסיכון שהוצעו בעבר, כגון עובי מכסה פלאק³ וגודל ליבת שומנים⁴, הוכחו כבעלי ערך ניבוי לא אופטימלי לאירועים קליניים עתידיים ^5,6. הבנה טובה יותר של מכניקת הפלאק ומנגנוני הקרע נחוצה כדי לייעל את הערכת הסיכון לקרע פלאק ולזהות סמני סיכון חדשים של רבדים טרשתיים.

קרע פלאק הוא אירוע מכני מקומי שבו רקמת הרובד הסיבי מאוד אינה עומדת בעומס המכני המופעל עליה על ידי לחץ הדם ומאבדת את שלמותה המבנית⁷. למרות זאת, המכניקה של אירוע קרע הפלאק והקשר שלו למיקרו-מבנה הבסיסי אינם מובנים היטב⁸. המחקרים הניסיוניים המעטים שאפיינו אי ספיקת רקמת פלאק כללו 9,10,11,12,13 דיווחו על תכונות קרע מכני גס ( כלומר^, זן וחוזק אולטימטיביים של אי ספיקת מתיחה), שנגזרו בהנחה של הומוגניות מבנית של הרקמה. עם זאת, רקמת הרובד הסיבי היא הטרוגנית מבחינה מבנית, ניתן לטעון בעיקר בשל שונות מקומית בארכיטקטורה של סיבי קולגן¹⁴. יתר על כן, הקשר בין מאפייני הכשל המכני של רקמת הרובד לבין ארכיטקטורת הקולגן נחקר רק במחקר שנערך לאחרונה על ידי Johnston et al. המחברים הראו הבדל בין פלאק בכיוון הסיבים הדומיננטי ודיווחו על לחצים אולטימטיביים גבוהים יותר וזנים אולטימטיביים נמוכים יותר עבור דגימות כובע רובד סיבי עם כיוון סיבים היקפיים^{בעיקר 15}. עם זאת, המחקר היה מוגבל גם לתכונות מכניות ומבניות ברוטו.

כדי לשפוך אור על המידע החיוני על ארכיטקטורת הקולגן המקומית והתכונות המכניות המקומיות של רקמת הרובד הסיבי, פיתחנו במחקר הנוכחי צינור הדמיה מכנו. צינור ex vivo זה מאפשר לכמת את כיוון ופיזור סיבי הקולגן המקומיים, כמו גם זן קרע מקומי. הצנרת כוללת הדמיית MPM עם SHG כדי לדמיין סיבי קולגן ברקמת הרובד, כמו גם בדיקות DIC ומתיחה חד צירית כדי לכמת את מאפייני הקרע של הרקמה.

מיקרוסקופיית מולטיפוטונים-יצירה הרמונית שנייה (MPM-SHG) הפכה לטכניקה פופולרית לחקר קולגן ברקמות ביולוגיות¹⁶. לטכניקה יתרונות רבים בהשוואה לשיטות דימות קולגן אחרות, כגון היסטולוגיה¹⁷, דימות טנזור דיפוזיה (DTI)14 ופיזור אור בזווית קטנה (SALS)¹⁵. ראשית, הדמיה MPM-SHG אינה הרסנית, מה שהופך אותה לאידיאלית לשילוב עם בדיקות מכניות¹⁸. שנית, אות SHG הוא ספציפי עבור קולגן, ולכן אין צורך להכתים את הרקמה. בשל אורכי גל העירור הארוכים (כמעט אינפרא אדום), עומק החדירה גדול יותר מאשר בטכניקות מיקרוסקופיה אחרות¹⁶. הרזולוציה הגבוהה (רמת מיקרומטר) המושגת עם הדמיית SHG מאפשרת גם הדמיה של סיבים בודדים. זה מציע אפשרויות רבות, כגון כימות מקומי של מספר סיבי הקולגן, כיוון סיבי קולגן, ופיזור¹⁹.

מתאם תמונה דיגיטלי (DIC) בשילוב עם בדיקות מכניות הוא שיטה נפוצה להשגת תכונות מכניות מקומיות של רקמות ביולוגיות²⁰. עם DIC, עקירה של כתמים המופעלים על פני הרקמה הוא מעקב על ידי השוואת תמונות מצלמה במהירות גבוהה שנרכשו במהלך בדיקות מכניות²⁰. שיטת עיבוד תמונה זו משמשת להערכת זני פני השטח בשדה מלא של הדגימה²⁰ וניתן להשתמש בה גם כדי לחקור את התנהגות הקרע של הרקמה²¹.

Protocol

כל השיטות המתוארות במאמר זה אושרו על ידי ועדת המחקר האתי במרכז הרפואי ארסמוס ברוטרדם; הסכמה מדעת התקבלה מחולים לפני איסוף דגימות פלאק. תרשים זרימת עבודה של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

1. איסוף רקמות, הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) והכנת דגימת בדיקה

1. איסוף ואחסון רקמות
   1. אספו דגימות טריות של רובד טרשתי אנושי ממטופלים שעברו ניתוח לכריתת עורקי התרדמה.
      הערה: דגימות הפלאק שנלקחו מניתוח זה כוללות את שכבת האינטימה החולה של עורק התרדמה, כולל הצטברות שומן (בריכת השומנים) והסתיידויות²².
   2. הסר את שאריות הדם באמצעות מלח חוצץ פוספט (1x PBS) וייבש את הדגימה עם פד גזה.
   3. מניחים את הדגימה בצינור של 15 מ"ל באמצעות פינצטה. הצמד להקפיא את הרקמה על ידי הנחת הצינור בחנקן נוזלי למשך 10 דקות.
   4. לאחר הקפאת הצמדה, יש לאחסן את הדגימה במקפיא בטמפרטורה של -80°C עד ליום הדמיית μCT.
      הערה: הקפאת הצמדה ממזערת את היווצרות הגביש, מה שמוביל לנזק מיקרו-מבני ברקמה. מחקר קודם על רקמת אבי העורקים החזירי הראה כי להקפאה ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לא הייתה השפעה משמעותית על התכונות המכניות של הרקמה²³.
2. הדמיית μCT
   1. ביום של הדמיית μCT, להוציא את דגימת הפלאק מתוך צינור 15 מ"ל. אם הרקמה נדבקת לצינור, מלאו את הצינורית ב-PBS בטמפרטורת החדר. השאירו את הרקמה ב-PBS עד שניתן יהיה להוציא את הדגימה מהצינור.
   2. יבש את דגימת הפלאק ביסודיות עם נייר טישו.
   3. הפעל את מערכת μCT על ידי לחיצה על הכפתור הירוק . לחצו על החימום בתוכנת ה-CT שבתחתית המסך והמתינו 15 דקות.
   4. מקם ידנית מסנן רנטגן של Cu 0.06 מ"מ + Al 0.5 מ"מ במערכת μCT.
   5. בחר את התיקיה שבה התמונות יאוחסנו.
   6. בחר את הפרמטרים בחלונית השמאלית. השתמש ברשימות הנפתחות כדי לבחור זמן סריקה של 4 דקות, רזולוציה של 172 מיקרומטר, מתח של 90 קילו וולט, אמפר של 88 mA, שדה ראייה של 86 מ"מ וסיבוב של 360°.
   7. פתח את דלת המכשיר. משוך את הפלטפורמה החוצה באופן ידני.
   8. שים פרפילם על הפלטפורמה ומקם את הדגימה על הפלטפורמה (לכיוון הקיצוניות הנוספת של הרציף).
   9. הכנס ידנית את הפלטפורמה למכשיר וסגור את הדלת.
   10. הפעל את מצב Live (סמל העין ). הזז את הפלטפורמה עם החצים במכשיר כדי למרכז את הדגימה ב- FOV.
   11. התחל הדמיה (סמל באמצע התחתון). לאחר סיום ההדמיה, לחץ על סמל הדלת בתחתית (מתחת ללחצן הביטול ).
   12. לאחר סריקת μCT, הקפיא שוב את דגימת הרובד הטרשתי כמתואר בשלב 1.1.3. אחסנו אותו בטמפרטורה של -80°C עד ליום של הדמיה במיקרוסקופ מולטיפוטונים ובדיקות מכניות.
   13. פתח את קבצי DICOM שנרכשו של הדמיית μCT בתוכנת הקוד הפתוח 3D Slicer²⁴.
   14. עבור אל עורך Segment . בחר צור פילוח חדש | אמצעי האחסון שיש לנתח כאמצעי אחסון ראשי.
   15. לחץ על הוסף כדי להוסיף קטע. לחץ על שמו וצבעו כדי לשנות פרמטרים אלה.
   16. כדי להגדיר את המקטעים, לחץ על אפקטים | סף בחלק התחתון של החלון. השתמש בכלי סף זה כדי להבדיל בין אזורי רקמה מסוידים (>450 HU) ולא מסוידים (<450 HU). לאחר בחירת הסף, לחץ על החל בחלק התחתון.
   17. הקש Show 3D (משמאל ל- Add) כדי להציג באופן חזותי את הפילוח בתצוגת התלת-ממד. אם ישנם אזורים של פילוח שאינם רצויים, להסיר אותם עם אפקט מספריים .
   18. שנה את אטימות המקטעים במודול הפילוח על ידי לחיצה על שם הפילוח הרצוי.
       הערה: במידת האפשר, ניתן לבצע הדמיית μCT וסקירה של תמונות μCT באותו יום כמו שאר הפרוטוקול. במקרה כזה, דלג על שלב 1.2.12. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי השלבים הבאים של פרוטוקול זה הם גם זמן רב ויש לבצע באותו יום. לאחר תרגול מסוים, ועם ההגדרות והרקמה המתוארות, הדמיית μCT צריכה להימשך ~ 45 דקות, סקירת תמונות μCT ~ 15 דקות, הכנת דגימת בדיקה אחת ~ 1 שעות, מיקרוסקופ ~ 4 שעות, ובדיקת מתיחה חד צירית ~ 2 שעות.
3. בדיקת הכנה לדוגמה
   1. ביום של דימות קולגן ובדיקות מכניות, יש להפשיר את הפלאק על ידי טבילה ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות.
   2. פתח את הבנייה התלת-ממדית של הלוח שנוצר בשלבים 1.2.13-1.2.18 בתוכנת כלי הפריסה התלת-ממדיים.
   3. השתמש בציוני הדרך הטבעיים של רקמת הרובד כדי לזהות אילו חלקים של השחזור התלת-ממדי מתאימים לדגימת הרובד האמיתי. זהה איזה אזור בשחזור התלת-ממדי אינו מכיל הסתיידויות וזהה חזותית אזור זה ברובד האמיתי.
   4. חותכים את הרובד הפתוח לאורך ציר האורך של העורק באמצעות מספריים כירורגיים ופינצטה. אם כבר קיים חתך מהניתוח, יש להתחיל מחתך זה לשימוש מיטבי ברקמה. אם לדגימה אין צורה צינורית וקשה להגדיר את כיוון האורך, אל תכלול את הדגימה בבדיקה.
   5. גזרו דגימות בדיקה מלבניות מדגימות הפלאק. יש לוודא שדגימות הבדיקה גדולות ככל האפשר תוך הימנעות מאזורי רקמה המכילים קרעים או הסתיידויות. היזהר במהלך חיתוך זה, שכן קרע קטן או סדק בקצה דגימת הבדיקה יכול לגרום להתפשטות סדק מהסדק הקיים במהלך בדיקת מתיחה.
   6. ודא שלדגימות הבדיקה יש יחס רוחב-אורך (WL) של <1 באורך המד לאחר הרכבתו בבודק המתיחה. אם הדגימות עונות על דרישה זו, הן מתאימות לבדיקות מתיחה מתאימות מבחינת תנאי גבול²⁵.
      הערה: הטווח במידות המדגם עשוי להיות גדול. הדגימות שבדקו המחברים היו באורך מד שנע בין 3.4 ל-12.9 מ"מ וברוחב שנע בין 1.6 ל-6.4 מ"מ.

2. הדמיית מיקרוסקופ מולטיפוטון

1. ההכנות
   1. לפני יום הדמיית הקולגן והבדיקה המכנית, יש לחלק 40 גרם בסיס אלסטומר סיליקון על פני שתי שפופרות של 50 מ"ל ולהוסיף 2 גרם של חומר הריפוי לכל צינור (יחס של 1:10) באמצעות פיפט פסטר. מערבבים את שני המרכיבים עם הפיפט.
   2. צנטריפוגה את הצינורות במשך דקה אחת ב 700 × גרם כדי להסיר בועות אוויר רבות ככל האפשר.
   3. ממלאים צלחת פטרי (בקוטר 10 ס"מ) בשכבה דקה (כ-0.5-1 ס"מ) סיליקון ודגרים עליה בתנור ב-65°C למשך 3 שעות או מניחים אותה בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות.
   4. קחו דגימת בדיקת פלאק וקיבעו את שני קצותיו לסיליקון על-ידי הצמדת מחטים ברקמה (איור 2A). ודא שהצד המואר של הדגימה פונה כלפי מעלה. הכנס את המחטים באזור הדגימה שתהיה במלחציים של מכשיר בדיקת המתיחה במהלך הבדיקה המכנית.
   5. הרכיבו משקפי בטיחות. השתמשו בחותך צדדי כדי לקצר את המחטים כך שיבלטו החוצה פחות מכמה מילימטרים מעל פני הדגימה, כדי למנוע מהן לפגוע במטרה של המיקרוסקופ. ממלאים את צלחת הפטרי ב-PBS עד שהדגימה שקועה במים.
2. הגדרת מיקרוסקופיה
   1. ודא כי מטרה נכונה מותקנת על מיקרוסקופ multiphoton. השתמש במטרה הממוטבת להעברת אור אינפרא אדום, עם הגדלה של פי 20.
   2. הפעל את מערכת המיקרוסקופ. פתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ.
   3. כאשר תתבקש לאתחל את טבלת ההדמיה, ודא שזרוע המעבה של המיקרוסקופ נדחפת לאחור והמטרה נמצאת במיקום הנמוך ביותר.
   4. הפעל את לייזר המולטיפוטון.
   5. שימו את צלחת הפטרי עם דגימת הבדיקה בתוכה מתחת למטרה, כמו באיור 3. הקפד לא למקם את המטרה מעל הדגימה עדיין מכיוון שעדיין יש למטב את הגדרות הלייזר. אחרת, העוצמה הגבוהה האפשרית של אור הלייזר עלולה להוביל לנזק לרקמה.
   6. ודא שהמטרה שקועה מעט ב- PBS. השתמש בפיפט כדי להוסיף PBS נוסף במידת הצורך.
   7. הגדר את אורך גל האור ל- 880 ננומטר.
      הערה: אורך גל זה נבחר מכיוון שלמסנן פליטת SHG במערכת שני פוטונים בשימוש יש אורך גל מרכזי של כ- 440 ננומטר. עבור מיקרוסקופים אחרים, אורך גל שונה עשוי להיות ישים יותר.
3. סריקת אריחים ובחירת מיקומי הדמיה
   1. כבה את לייזר המולטיפוטון והפעל את מצב שדה הבהירות של המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעל את מצב סריקה חיה .
   2. מקם את הבמה כך שהמטרה ממוקמת מעל הדגימה והבא את משטח הדגימה למיקוד. כבה את מצב הסריקה החיה .
   3. תחת כרטיסיית הרכישה , בחלונית השנייה, שנה את מקדם הזום ל - 1 על-ידי החלקת הסרגל המיועד.
      הערה: גורם זום זה, יחד עם מקדם ההגדלה של המטרה (20x), קובעים את גודל התמונה שצולמה (739 מיקרומטר x 739 מיקרומטר).
   4. תחת כרטיסיית הרכישה , בחלונית השנייה, שנה את מהירות הסריקה ל- 400 הרץ, את ממוצע הקו ל- 1 ואת הרזולוציה ל- 128 x 128 פיקסלים לתמונה (גודל פיקסלים של ~ 5.8 מיקרומטר x 5.8 מיקרומטר) באמצעות הרשימות הנפתחות.
   5. תחת כרטיסיית הרכישה , בחלונית הראשונה, לחץ על סמל דוגמת הרסטר והמתן להופעת חלונית סריקת אריחים .
   6. הפעל את מצב סריקה חיה . הזיזו את המטרה לפינה של הדגימה בעזרת הידיות בחלונית החכמה ולחצו על סמל מיקום הסימון בחלונית סריקת האריחים. חזור על פעולה זו עבור כל פינה של הדגימה. אם היא מבוצעת כהלכה, רשת עם כל האריחים שנבחרו להדמיה תופיע בצבע כתום.
   7. בטל את פונקציית התפירה האוטומטית .
   8. לחץ על התחל בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי ליצור סריקת אריחים של כל משטח הדגימה כדי לקבל סקירה כללית של הגיאומטריה של הדגימה.
      הערה: בהתבסס על ההגדרות, הרקמה ומערכת המיקרוסקופ המתוארות, רכישת סריקת אריחים של משטח הדגימה כולו אורכת ~10 דקות.
   9. לאחר סריקת האריחים, התבונן בקואורדינטות x ו- y של הפינה השמאלית העליונה של כל אריח בחלונית סריקת האריחים, המוצגות אוטומטית על-ידי תוכנת מערכת המיקרוסקופיה. שים לב לקואורדינטות אלה בגיליון אלקטרוני.
   10. בתוכנת המיקרוסקופ, בלוח סריקת האריחים, שימו לב למספר האריחים בכיווני x ו-y בתיבה הנקראת scanfield. שים לב לגודל סריקת האריח בגיליון האלקטרוני. חשב את הקואורדינטות של האריחים האחרים על-ידי הוספה/חיסור של גודל האריח (739 מיקרומטר).
       הערה: קואורדינטות אלה נחוצות כדי לזהות את המיקום המדויק של האריחים שיש לסרוק באמצעות הדמיית SHG. אם זמן ההדמיה הכולל אינו מהווה בעיה, ניתן לצלם את כל האריחים מבלי לדלג על אף אריח.
   11. מסריקת האריח, בחר את האריחים לצילום באמצעות הדמיית SHG. עבור בחירה זו, הימנע מאריחים שיהיו במלחציים והשאר אריח אחד בין כל אריח שנבחר הן בכיוון האורכי והן בכיוון ההיקפי, כפי שמוצג באיור 2B.
4. ויזואליזציה של קולגן: הדמיית SHG
   1. כבו את האורות בחדר וכסו את שלב המיקרוסקופ בבד האפלה גם כך ששום אור מהחדר לא יגיע לגלאי.
      הערה: מזעור האור המגיע לגלאים יפחית את הרעש במהלך רכישת התמונה.
   2. הפעל את לייזר המולטיפוטון (MP).
   3. בחר בגלאי זיהוי שאינו נסרק (NDD) המצויד במסנן פסים של 430-450 ננומטר.
   4. זהה את מיקום האריחים לצילום באמצעות המידע שהושג בשלב 2.3.10. מלא את הקואורדינטות בתיבות המיועדות ולחץ על Enter, כך שהמטרה תזוז לאריח הימני. הפעל את מצב סריקה חיה.
      הערה: עם מיקרוסקופים אחרים או גרסאות חדשות יותר של תוכנת ההפעלה, ניתן לבצע מעבר למיקומים בתוך סריקת האריחים באופן אוטומטי. במקרה זה, אין צורך לציין את הקואורדינטות x ו- y של כל אריח (שלב 2.3.10) ומילוי הקואורדינטות בתוכנת ההפעלה (שלב 2.4.4).
   5. הגדל את עוצמת הלייזר של MP באמצעות המחוון בלוח העליון מתחת להגדרות נתיב הקרן כדי לקבל את עוצמת הלייזר הגבוהה ביותר האפשרית ללא הלבנה משמעותית. לאחר מכן, התאם את רווח הגלאי לקבלת תמונות בהירות, אך ללא פיקסלים רוויים, באמצעות הידית בלוח החכם או על ידי לחיצה על שם הגלאי תחת הגדרות נתיב קרן | ערוצים נוספים. ערכים אופייניים לרווח הגלאי הם בין 500 ל- 800 וולט.
   6. השתמש בידית מיקום z בלוח החכם כדי לכוונן את מישור המיקוד.
   7. עבור לחלק העליון של הדגימה והגדר את המיקומים של החלק העליון של ערימת z על ידי לחיצה על ראש החץ בחלונית z-stack (תחת הכרטיסייה רכישה | חלונית^שלישית).
   8. לאחר מכן, התמקדו בדגימה עד שאות ה-SHG לא יזוהה עוד - זהו סוף המחסנית. שוב, לחץ על ראש החץ בחלונית z-stack כדי לקבוע מיקום זה. כשתסיים, כבה את מצב הסריקה החיה .
      הערה: ייתכן שהרקמה אינה שטוחה לחלוטין. לכן, משטח הדגימה של אזורים שונים ברקמה עשוי להיות בעל מיקומים שונים במקצת בכיוון z.
   9. תחת כרטיסיית הרכישה , בחלונית השנייה, שמור על מהירות הסריקה על 400 הרץ, הגדר את ממוצע הקו ל- 2 ואת הרזולוציה ל- 512 x 512 פיקסלים לתמונה (גודל פיקסלים של ~ 1.4 מיקרומטר x 1.4 מיקרומטר) באמצעות הרשימות הנפתחות. הפעל את לחצן סריקת X הדו-כיוונית.
   10. לחץ על גודל z-step בחלונית z-stack ומלא גודל z-step של 3 מיקרומטר בתיבה. לחץ על התחל בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי ליצור ערימת z. בסיום, הקפד לשמור את הקואורדינטות של האריח בשם הקובץ או לתת לכל אריח מספר משלו (כמו באיור 2B).
       הערה: בהתבסס על ההגדרות המתוארות, הרקמה ומערכת המיקרוסקופ, רכישת ערימת z של אריח יחיד אורכת ~10-15 דקות. שלבי ההכנה (שלבים 2.4.4-2.4.10) כלולים בהערכת זמן זו.

3. בדיקות מכניות

1. הכנת מערך בדיקת מתיחה חד צירית
   1. הכינו את מערך בדיקת המתיחה האופקית (איור 4) לשימוש, בהתאם להוראות של בודק המתיחה (למשל, הפעילו תוכנה, חברו מלחציים, חברו תא עומס).
   2. כדי למזער את ההחלקה של דגימת הבדיקה, חברו סרט קצף דו-צדדי (איור 4A,B-2) לפנים הפנימיות של מלחציים של בודק המתיחה ונייר זכוכית לצד הפנימי של סרט הקצף. בסופו של דבר, נייר הזכוכית יהיה במגע עם מדגם הבדיקה.
   3. הניחו את אמבט החימום (איור 4A,B-3) במקומו. מלאו את אמבט החימום ב-PBS עד לגובה הפן התחתון של המלחציים, כך שהוא עדיין לא יגיע לנייר הזכוכית.
   4. הפעל את מקור החשמל של אמבט החימום והגדר את הטמפרטורה לסביבות 37 °C (77 °F).
   5. הרכיבו את המצלמה המהירה מעל מערכת בדיקת המתיחה (איור 4A-4), למשל, באמצעות מעמד מעבדה, והרכיבו עדשה באורך מוקד של 50 מ"מ על המצלמה דרך טבעת מאריכה.
   6. ודא שהמלחציים ממוקדים וששדה הראייה גדול מספיק כדי להקליט את הדגימה במהלך כל הליך המתיחה (רוחב FOV: ± רוחב הדגימה; אורך FOV: ± פי 2 מאורך הדגימה).
   7. הרכיבו את מערכת התאורה (איור 4A-5) מעל מערכת בדיקת המתיחה, למשל, באמצעות מעמד מעבדה. הפעל את מערכת התאורה וכוונן את עוצמת האור ומיקומו כך שלא יהיו השתקפויות על משטח PBS שניתן לצפות בהן בתמונת המצלמה.
   8. התאם את זמן החשיפה והרווח של המצלמה לקבלת תמונות ברורות.
   9. הגדר את תוכנת רכישת התמונות ללכידה בקצב של 30 פריימים לשנייה ברזולוציה של 5.2 מגה פיקסל.
      הערה: קצב פריימים גבוה זה נחוץ כדי לבצע את ניתוח ה- DIC הבא וללמוד את התנהגות הקרע.
   10. הגדר את מהירות התזוזה של אחד המהדקים כך שקצב המאמץ ההנדסי העולמי במהלך בדיקות מכניות יהיה דומה לקצב המאמץ הפיזיולוגי in vivo של הרקמה
       (5%/s עבור רקמת פלאק²⁶).
2. יצירת דפוס כתמים
   הערה: פרוטוקול דפוס כתמים זה מבוסס על עבודה קודמת של Walsh et ^al.27.
   1. יבש את הדגימה על ידי טבילה קלה עם נייר טישו.
   2. שים את צבע הרקמה השחור בדלי המיועד של מברשת האוויר.
   3. חברו את מברשת האוויר למדחס. הפעל את מדחס מברשת האוויר והגדר את הלחץ ל- 25 PSI.
   4. נסו ליצור תבנית כתמים אופטימלית על נייר לפני הריסוס על הרקמה. רססו מספר פעמים עד לקבלת יחס שחור/לבן של 50 :50²⁸ . הזיזו את המחט של מברשת האוויר קדימה ואחורה כדי להתאים את החספוס של תבנית הכתם עד שגודל הכתם יהיה דומה לגודל של 3-5 פיקסלים של המצלמה המהירה²⁹.
      הערה: תבנית הכתמים תשמש לשתי מטרות שונות. ראשית, התזוזה של כתמים אלה נמדדת על ידי השוואת תמונות מצלמה במהירות גבוהה שנרכשו במהלך בדיקות מכניות (DIC, שלב 4.2). שנית, דפוס כתמים זה משמש לזיהוי מיקום הקרע בתמונה של המצב הלא מעוות של הדגימה (שלב 4.3.1).
   5. יש להחזיק את מברשת האוויר במרחק של כ-30 ס"מ מדגימת הבדיקה ולרסס על משטח האור.
   6. תנו לצבע להיקשר לדגימה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני שתטביעו את הדגימה ב-PBS.
3. בדיקת מתיחה חד צירית
   1. הניחו את הדגימה במלחציים של בודק המתיחה, כאשר הכיוון ההיקפי של הדגימות מיושר עם כיוון המתיחה של המתיחה והצד המואר של הדגימה פונה כלפי מעלה. ודא שאורך המד ההתחלתי מוגדר כך שיחס WL של הפסים הוא <1.
   2. הדקו את ברגי האחיזה על ידי הפעלת מומנט של 20 cNm באמצעות מברג מומנט. עשה זאת בהדרגה על ידי הפעלת מומנט קטן על כל בורג לפני הפעלת המומנט הסופי.
   3. בדקו ויזואלית אם הדגימה מכילה קרעים שעלולים להשפיע על הבדיקות.
   4. הכנס PBS נוסף לאמבט החימום עד שהמדגם שקוע והמתן עד שהטמפרטורה של PBS תגיע שוב ל -37 מעלות צלזיוס.
   5. קבל תמונת כיול באמצעות המצלמה במהירות גבוהה, שבה דגימת הבדיקה וסרגל כלולים כהפניה. ודא שהסרגל נמצא באותו מרחק ממטרת המצלמה כמו המשטח המואר של הדגימה.
   6. צור את תא העומס והתחל להקליט את מדידות הכוח והתזוזה הגלובליות מתא העומס ומהמפעיל של בודק המתיחה.
   7. יישרו את הדגימה על ידי החלת מתיחה מוקדמת של 0.05 N כדי להיפטר מהרפיון בדגימה. בצע 10 מחזורים של התניה מוקדמת עד 10% מאמץ בהתבסס על מדידת אורך המד על ידי המפעיל לאחר יישום המתיחה מראש.
   8. התחל את בדיקת המתיחה החד צירית עד לכישלון מוחלט של הדגימה, תוך הקלטת וידאו של עיוות הדגימה באמצעות המצלמה המהירה. לאחר כשל רקמות, הפסיקו לרשום את מדידות הכוח והתזוזה הגלובליות.
      הערה: בודקי מתיחה מסחריים מסוימים יכולים לבצע את שלבים 3.3.6-3.3.9 באופן אוטומטי. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצעדים הידניים שיש לנקוט אם אפשרות אוטומטית זו אינה כלולה בבודק המתיחה הנמצא בשימוש.
   9. הסר את דגימת הבדיקה מהתקן בדיקת המתיחה והשלך אותה בהתאם.
   10. בעת בדיקת המדגם הבא, החלף את נייר הזכוכית וסרט הקצף על המלחציים.

4. ניתוח נתונים

1. ניתוח ארגון קולגן
   1. פתח את ערימות z המתקבלות במהלך MPM עם SHG ב- ImageJ וצור הקרנות בעוצמה מרבית (MIPs) של כל ערימת z.
   2. נתחו כל MIP בעזרת הכלי FOA (Fiber Orientation Analysis)³⁰ מבוסס הקוד הפתוח של MATLAB כדי למדוד את זווית הכיוון של סיבי הקולגן הבודדים שנמצאים באריחים. השתמש בפרמטרים הבאים: סולמות: [3 4 5] או [2 4 6], בהתאם לקוטר כלי השיט, וסף כלי הדם: 0.999, 0.9995 או 0.9999, בהתאם לעוצמת אות SHG.
      הערה: פרטים נוספים על אופן השימוש בכלי זה ניתן למצוא במדריך^{התוכנה 31}.
   3. השתמשו בכלי קוד פתוח אחר המבוסס על MATLAB, FibLab³², כדי להתאים התפלגות גאוסית להיסטוגרמה של התפלגות הזווית.
      הערה: פרטים נוספים על אופן השימוש בכלי זה ניתן למצוא במדריך^{התוכנה 32}.
   4. מתוך תרשים ההתפלגות של גאוס המתקבל באמצעות FibLab, חלץ את הפרמטרים המבניים הבאים מסביבת העבודה של MATLAB: זווית הסיב הדומיננטית (μ p), שהיא אופן ההתפלגות, סטיית התקן (σ_p) של התפלגות זווית הסיב, והשבר האנאיזוטרופי (P_ani = 1 − P_iso).
      הערה: השבר האיזוטרופי הוא השטח שמתחת לקו הבסיס בהתפלגות גאוס, בעוד שהשבר האנאיזוטרופי מכיל את שטח הפסגה מעל קו בסיס^{זה 33}. גם σ_p וגם P_ani מספקים מידע על פיזור כיוון הסיבים באזור האריחים.
   5. לבדיקה חזותית, התווה μp באמצעות קווים מכוונים ו- σ_p ו- P_aniבאמצעות מפות צבע.
2. ניתוח תמונה דיגיטלית וניתוח שברים
   1. בצע בדיקה חזותית בתמונות המצלמה כדי לזהות את הפריים שבו מתרחש התחלת הקרע. במסגרת זו, זהה חזותית את מיקום הקרע.
   2. בצע בדיקה חזותית על תמונות המצלמה כדי לזהות סדק או קרע בסופו של דבר במיקום הקרע בתחילת הבדיקה המכנית. אם קיים קרע כזה, להוציא את הדגימה מהניתוח.
   3. בצע את ניתוח ה-DIC באמצעות תוכנת הקוד הפתוח מבוססת MATLAB Ncorr (v1.2)³⁴. בצע את השלבים במדריך^{Ncorr 35}.
      1. השתמש בתמונות המצלמה שצולמו במהלך בדיקת המתיחה עם המצלמה המהירה עבור DIC. בחר במסגרת האחרונה לפני המתיחה הסופית עד לכשל (לאחר התניה מראש) כתמונת ההתייחסות. לתמונות הנוכחיות, בחרו בכל התמונות מתחילת המתיחה הסופית ועד למסגרת האחרונה לפני המסגרת שבה התרחש התחלת הקרע.
      2. בחר את משטח הדגימה כאזור העניין (ROI). אל תכלול את האזורים הקרובים (כ-1 מ"מ) למלחציים, שכן הזנים באזורים אלה יושפעו מאוד מהאחיזה.
      3. בצע ניתוח DIC באמצעות הפרמטרים הבאים: רדיוס תת-קבוצה: 30 פיקסלים; מרווח בין תת-ערכות: שלושה פיקסלים; קיצוץ איטרציה: 50; הנורמה של חיתוך וקטור ההפרש: 10-5; רדיוס זן: 5; התפשטות אוטומטית, שלב #: 5.
      4. מניתוח DIC עם Ncorr, קבל את התפלגות Green-Lagrange (או זן אוילרי) של החזר ההשקעה. השתמש בפיזור זנים אלה כדי לחשב את זן Green-Lagrange הממוצע של כל משטח דגימת הפלאק בפריים האחרון לפני הקרע. חישוב זן לגראנז' ירוק במיקום הקרע.
3. מתאם נתונים מבניים ומכניים במיקום הקרע
   1. באמצעות ציוני הדרך הטבעיים בדגימת הבדיקה והכתמים המוחלים על דגימת הבדיקה, זהה את מיקום הקרע (שזוהה בשלב 4.2.1) בתמונת הייחוס (שלב 4.2.3.1).
   2. בעזרת ציוני הדרך הטבעיים בדוגמת הבדיקה, צור שכבת-על של תמונת הייחוס וסריקת האריח (שלב 2.3) כדי לזהות את מיקום הקרע בסריקת האריח. זהה את האריח MPM-SHG שבו התרחש הקרע. אם הקרע אינו באריח שנסרק באמצעות MPM-SHG, זהה את האריח הקרוב ביותר למיקום הקרע. השג את הפרמטרים המבניים שנמצאו באריח שבו התרחש הקרע.

Results

איסוף רקמות והכנת דגימת בדיקה
אוסף הרקמה מניב דגימות רקמה סיביות פלאק שניתן לנתח לדגימות בדיקה בודדות לצורך הדמיה מבנית ובדיקת מתיחה חד צירית. באופן אידיאלי, דגימת רקמה סיבית שנאספה מכילה אזורים עם מעט או ללא קרעים (איור 5A) והסתיידויות מאקרו (איור 5B). עודף של קרעים והסתיידויות אלה (איור 5C) עלול להוביל לדגימות פלאק שאינן עומדות בדרישת ממד הדגימה שהוזכרה קודם לכן של WL 1.

הדמיית מיקרוסקופ מולטיפוטונים
הדמיית SHG ועיבוד תמונה מספקים MIPs מכל אריח מצולם (איור 6A,B). עיבוד נוסף לאחר עיבוד על-ידי זיהוי סיבים (איור 6C) מניב היסטוגרמות של כיוון סיבים (איור 6D) שמהן ניתן לחלץ פרמטרים מבניים של קולגן (איור 6E). נוסף על כך, ניתן לקבל מפות צבע המציגות את פרמטרי הקולגן המבניים המקומיים על פני כל דגימת הפלאק לצורך ניתוח חזותי (איור 6F,G). עבור מדגם הבדיקה המייצג באיור 6, נמצאה שונות תוך-מדגמית גדולה בפרמטרים המבניים של הקולגן (ממוצע ± SD של μ p = -34° ± 32°; σ_p = 21° ± 4°; P_ani = 0.49 ± 0.14, אם הכיוון ההיקפי מוגדר כ-0°). וריאציה תוך-מדגמית זו מדגישה את החשיבות של קבלת פרמטרים מבניים מקומיים במקום להניח הומוגניות.

בדיקות מכניות
התנהגות קרע
המצלמה המהירה מספקת תמונות של התנהגות העיוות והקרע של דגימות הפלאק במהלך בדיקות מכניות (איור 7). מתמונות אלה ניתן לזהות את מיקום התחלת הקרע ואת נתיב התפשטות הקרע. תוצאות זיהוי הקרע אינן אופטימליות אם קיימות בועות או השתקפויות בתמונות המצלמה, או אם הקרע מתפשט מהר מדי מכדי להיקלט בקצב הפריימים שנבחר.

דפוסי מאמץ מקומיים
ניתוח מתאם תמונה דיגיטלי על הקלטות המצלמה שנרכשו במהלך בדיקת המתיחה החד-צירית מספק את מפות העיוות המקומי של הרקמות, כגון מפות הזנים Green-Lagrange המוצגות באיור 8. מפות אלה מציגות את שלושת רכיבי הזן (ε_xx, ε_xy ו- ε_yy) במסגרת לפני תחילת הקרע. ממפות זנים אלה ניתן לחלץ את הזנים הממוצעים באזור עניין ואת הזנים המקומיים בנקודה, כגון מיקום הקרע.

עבור המדגם המייצג באיור 8, נתוני הזנים המקומיים מראים שונות תוך-מדגיבית גדולה. עבור מדגם הבדיקה המייצג באיור 8, נמצאה שונות תוך-מדגמית גדולה בזנים המקומיים (טווחי הזנים הנצפים הם כדלקמן: ε_xx = -0.30-0.17; ε_xy = -0.13-0,20; ε_yy = 0-0.40). זה מדגיש את החשיבות של קבלת נתונים מקומיים במקום ערכים ממוצעים ברוטו המתקבלים עם ההנחה של הומוגניות רקמות.

קורלציה בין מידע על רקמות מכניות ומבניות
התוצאות הנ"ל מאפשרות לקשר בין התנהגות העיוות והקרע המקומית של הרקמה לארכיטקטורת הקולגן. לאחר זיהוי מיקום הקרע בהקלטות המצלמה (איור 9A), ניתן למפות אותו בחזרה לתמונת מצלמת הייחוס (איור 9B) ולסריקת אריחי המיקרוסקופ (איור 9C). זה מספק את אריח MPM-SHG שבו התרחש הקרע ואת הפרמטרים המבניים שנמצאו באריח זה (איור 9D). הפרמטרים המבניים שנמצאו באריח שבו התרחש הקרע במדגם מייצג, המוצגים באיור 9, הם μ p = 28°, σ_p = 19° ו- P_ani = 0.6. אותו הליך יכול להיות מיושם גם על מיקומי רקמות לא קרוע. חשוב לציין כי מיפוי מיקום הקרע בתמונת הייחוס ממסגרת הקרע עשוי להיות מאתגר במקרה של דפוס כתמים לקוי וציוני דרך טבעיים לא ברורים. בנוסף, אם ציוני הדרך הטבעיים של הרקמה אינם ברורים מספיק, רישום משותף של שכבת הסריקה של האריחים ותמונות המצלמה במהירות גבוהה עשוי להיות קשה.

איור 1: תרשים זרימת עבודה של פרוטוקול הניסוי המוצג. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: בחירת אריחים להדמיית SHG מסריקת האריחים . (A) דגימת בדיקה מוצמדת לסיליקון. (B) סריקת אריחים של דגימת הבדיקה שהתקבלה במיקרוסקופ brightfield. האריחים שנבחרו להדמיית SHG מסומנים בריבועים כחולים. (C) הקרנה בעוצמה מרבית של MPM עם SHG. סרגל קנה מידה = 140 מיקרומטר (C). קיצורים: SHG = דור הרמוני שני; MPM = מיקרוסקופ מולטיפוטון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דגימת פלאק שהונחה מתחת למטרה של מיקרוסקופ רב-פוטונים. המיקום של דגימת הפלאק מאובטח על ידי צלחת פטרי ממולאת במי מלח בציפוי פוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: בודק מתיחה חד-צירי מותאם אישית עם מרכיביו השונים שצוינו . (A) סקירה כוללת של המערכת. שימו לב שתוספות נייר הזכוכית במלחציים גלויות מכיוון שרק המהדקים התחתונים מחוברים. (B) תמונה מוגדלת של מהדקי המתיחה עם דגימת הבדיקה מוכנה לבדיקה. קיצורים: PVC = פוליוויניל כלוריד; LED = דיודה פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תוצאות איסוף רקמות והכנת דגימות מדגימות מייצגות . (A) דגימת פלאק טרייה ושלמה, שנלקחה ממטופלים שעברו ניתוח לכריתת עורקי התרדמה. (B) שחזור תלת-ממדי מסריקת μCT. רקמה מסוידת מוצגת בכחול בהיר ולא מסוידת באדום. דגימה אופטימלית ללא רקמה מסוידת ניתן לקבל מהאזור שבין הקווים הכחולים. (C) שחזור תלת ממדי מסריקת μCT המראה רובד תת-אופטימלי עם עודף רקמה מסוידת. סרגל קנה מידה = 3 מ"מ. קיצור: μCT = טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תוצאות MPM-SHG ממדגם מייצג. (A) סקירה כללית של סריקת אריחים; האריחים שנבחרו להדמיה מוצגים בכחול. (B) MIPs מאריחים שונים. (C) זיהוי סיבים על ידי הכלי FOA מאריח שנבחר (# 1). (D) היסטוגרמה של כיוון סיבים מאריח שנבחר. (E) היסטוגרמה של כיוון סיבים + התאמת גאוס, שממנה ניתן לחלץ פרמטרים מבניים של קולגן מאריח נבחר. (F) ייצוג של μ p (כיוון קו שחור) ו- σ_p (צבע רקע) על פני כל דוגמת הלוח. (G) ייצוג של μ_p (קו שחור כיוון) ו-P_ani (צבע רקע) על פני כל דוגמת הלוח. פסי קנה מידה = 140 מיקרומטר (B,C). קיצורים: MPM-SHG = מיקרוסקופיה מרובת פוטונים-יצירה הרמונית שנייה; MIPs = תחזיות בעוצמה מרבית; FOA = ניתוח כיוון סיבים; μ_p = זווית הסיב הדומיננטית; P_ani = שבר אנאיזוטרופי; σ_p = סטיית תקן של התפלגות זווית הסיבים; P_iso = שבר איזוטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: התחלת קרע והתפשטות בדגימת רקמת פלאק במהלך הליך בדיקת המתיחה.1) מצב מתוח מראש, רקמה שלמה. 2) התחלת קרע - מסגרת ראשונה בה נצפה קרע. מיקום התחלת הקרע מסומן בריבוע אדום. 3 ) ו-4) התפשטות קרע. 5) קרע מלא של דגימת הפלאק. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: דפוסי זני לגראנז' ירוקים של מדגם מייצג (ε_xx, ε_xy ו-ε_yy) במסגרת לפני הקרע, שהתקבלו בניתוח DIC. ניתנת סטיית תקן ממוצעת על פני כל הפלאק, יחד עם המתח במקום הקרע. קיצורים: DIC = מתאם תמונה דיגיטלית; ε_xx = מתח אורכי; ε_xy = גזירה; ε_yy = מתח מתיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: תמונת כיסוי של מיקום הקרע (ריבוע אדום) על גבי תמונות. (A) תמונת מצלמה במהירות גבוהה, שבה מזוהה הקרע (מסגרת הקרע). (B) תמונת מצלמה במהירות גבוהה, שבה מוחלת רק מתיחה מראש (מסגרת ייחוס). (C) תמונת סריקת האריח המתקבלת באמצעות מיקרוסקופיה. (D) מפה מקודדת בצבע המציגה פרמטרים מבניים מקומיים של קולגן באריחים שונים. μ_p (כיוון קו שחור) ו- P_ani (צבע רקע) לאורך כל דוגמת הלוח מוצגים. קיצורים: μ_p = זווית סיבים דומיננטית; P_ani = שבר אנאיזוטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

המחקר הנוכחי התמקד בפיתוח צינור דימות מכנו כדי לחקור את הקשר בין כיוון ופיזור הקולגן המקומי, תכונות מכניות מקומיות והתנהגות הקרע של רקמת רובד טרשתי סיבי. הפרוטוקול המתואר כאן הוא חדשני מכמה סיבות. ראשית, זו הפעם הראשונה שמתאם תמונה דיגיטלית מיושם כדי למדוד את העיוות המקומי של רקמת רובד סיבי תחת עומס מכני. שנית, פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש כדי לנתח את הקשר בין דפוס העיוות המקומי לבין ארכיטקטורת הקולגן המקומית של רקמת הרובד הסיבי. חשיבות ההערכה המקומית מודגשת הן על ידי נתוני המאמץ והן על ידי נתוני הקולגן המוצגים בסעיף התוצאות, המראים את האופי ההטרוגני של הרקמה. לכן, מומלץ להשתמש בטכניקות המאפשרות הערכה מקומית, כגון אלה המשמשות בפרוטוקול זה, למחקרים עתידיים של תכונות הרובד הסיבי.

הכנת דגימת בדיקה היא בין השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה. לוחות התרדמה הם בעיקר רקמות קולגן; עם זאת, הם עשויים להכיל הסתיידויות הנחשבות כמשפיעות על ההתנהגות המכנית הכוללת של הרובד^36,37. מכיוון שהמחקר מתמקד במרכיב הרקמה הסיבית של הרובד, נמנעים הסתיידויות בדגימות הבדיקה באמצעות הדמיית μCT³⁸. אם μCT אינו זמין, ניתן לשקול טכניקות הדמיה אחרות כגון MRI או OCT³⁹ לאיתור האזורים המסוידים ברובד. השגת דגימות בדיקת רקמות סיביות ללא הסתיידויות ובגודל גדול מספיק שניתן לבצע לבדיקה מכנית עשויה להיות משימה מאתגרת עבור פלאקים מסוידים בכבדות או מכילים הסתיידויות מפוזרות. משימה מאתגרת נוספת בפרוטוקול היא יצירת תבנית כתמים אופטימלית למתאם תמונות דיגיטליות. DIC אופטימלי דורש יחס שחור/לבן של 50:50²⁸ וכתמים בגודל של שלושה עד חמישה פיקסלים²⁹ כדי להבטיח איכות מתאימה. אי עמידה בדרישות אלה עלולה לגרום למדידות מקומיות לא מדויקות של הזן. לבסוף, מיפוי מיקום הקרע לתמונות SHG יכול להיות מאתגר אם ציוני הדרך הטבעיים של הרקמה אינם ברורים. עבור דגימות כאלה, יישום של מספר סמנים fiducial על הרקמה לפני הדמיה יהיה מועיל.

טכניקת MPM-SHG המשמשת בפרוטוקול הנוכחי עדיפה על טכניקות רבות אחרות להדמיית קולגן, שכן מדובר בטכניקה ברזולוציה גבוהה ולא הרסנית עם עומק חדירה גדול יחסית. עם זאת, עומק החדירה (<400 מיקרומטר) של MPM-SHG מהווה מגבלה, שכן הוא אינו מאפשר הדמיה של כל עובי דגימות הבדיקה, שנע בין 0.5 ל -2 מ"מ. במחקר שנערך לאחרונה עם דימות תהודה מגנטית של טנזור הדיפוזיה (DT-MRI), הראינו כי כיוון הסיבים השולט בחלקים העמוקים יותר של רקמת הרובד יכול להיות שונה מזה שבחלקים השטחיים והמוארים יותר של הרקמה¹⁴. לכן, יש צורך במחקרים נוספים כדי לחקור את ארכיטקטורת הקולגן המקומית בחלקים העמוקים יותר של דגימות רקמת רובד סיבי עבה ואת הקשר שלה למכניקת הרקמה המקומית. לשם כך ניתן להשתמש בדימות תחום תדר מרחבי מקוטב (pSFDI). טכניקת הדמיה אופטית זו שפותחה לאחרונה דווחה כבעלת פוטנציאל למדוד את כיוון הסיבים בעומק של 0.8 מ"מ בעלוני מסתם מיטרלי¹². ה- pSFDI מציע גם רכישה מהירה, שיכולה גם להקל על הדמיה של אזור הדגימה כולו במקום רק מבחר אריחים, כפי שקורה בפרוטוקול הנוכחי. מגבלה נוספת של הפרוטוקול הנוכחי היא שניתן היה לזהות רק עיוות פני השטח. במחקרים עתידיים, ניתן לכלול בפרוטוקול זה DIC⁴⁰ מרובה תצוגות בסיוע מראה או מתאם נפח דיגיטלי (DVC)⁴¹ כדי לקבל מידע נוסף על הזנים הנפחיים מתחת לפני השטח.

פרוטוקול הניסוי הנוכחי ניתן להרחבה נוספת או לשינוי במספר דרכים כדי לקבל מידע נוסף על מכניקת הקרע של הרובד והקשר שלו למיקרו-מבנה הבסיסי. ראשית, הפרוטוקול הנוכחי כולל בדיקות מתיחה חד צירית בכיוון ההיקפי. סוג זה של בדיקות מכניות נבחר מכיוון שהפלאק חווה בעיקר מתיחה בכיוון ההיקפי in vivo. לאפיון מכני מקיף יותר, ניתן להרחיב פרוטוקול זה עוד יותר כדי לשלב בדיקות ניפוח, בדיקות דו-צדדיות או בדיקות מתיחה חד-צירית בכיוון האורך. שנית, הפרוטוקול הנוכחי מתמקד רק בהשגת זנים מקומיים באמצעות DIC. עם זאת, ניתן לקבל תמונה מלאה יותר של ההתנהגות המכנית של הפלאק על ידי הכללת ניתוח מאמץ מקומי בפרוטוקול, אך הדבר דורש אפיון של נוקשות מקומית. למרות האתגר הנוכחי, ניתן להשיג זאת על ידי טכניקות חישוביות כגון שיטת היסוד הסופי ההופכי ^42,43 ושיטת השדות^{הווירטואליים 44}. מלבד התאמה ניסיונית, ניתן להוסיף כמה שלבים נוספים לאחר העיבוד לפרוטוקול הנוכחי. ראשית, במקום לזהות רק את מיקום הקרע, ניתן לזהות את נתיב התפשטות הסדק באמצעות תמונות המצלמה המהירות המתקבלות. נתיב התפשטות זה יכול להיות מתואם עם פרמטרים מבניים ומכניים מקומיים. שנית, מיקום התחלת הקרע זוהה חזותית בפרוטוקול המתואר. מחקר קודם על רקמות לא ביולוגיות השתמש בחוסר רציפות במדידות זן DIC כדי לזהות קרע⁴⁵. יישום זיהוי קרע אוטומטי כזה על רקמות פלאק יכול אולי לשפר את הדיוק של זיהוי הקרע. לבסוף, יתרון גדול של MPM-SHG בהשוואה לשיטות דימות קולגן אחרות הוא שהוא מדמיין סיבי קולגן בודדים. לכן, הנתונים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש גם כדי לחקור מאפיינים מקומיים נוספים של קולגן, כגון תכולת הקולגן.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לספק הבנה טובה יותר של המאפיינים המקומיים של רקמת רובד סיבי, הרכיב שנכשל מכנית בקרע פלאק in vivo. מידע זה נחוץ כדי לבסס סמנים חדשים של הדמיה מבנית ותפקודית המנבאים קרע פלאק בחולים. סמנים חדשים אלה נחוצים, שכן הסמנים הביולוגיים בסיכון שהוצעו בעבר הוכחו כבעלי ערך ניבוי לא אופטימלי לאירועים קליניים עתידיים ^5,6. בעתיד, OCT ו-ps-OCT יוכלו לזהות ולכמת רקמות סיביות במערכת העורקים^46,47,48. בנוסף, זן נחשב סמן חלופי להרכב פלאק מקומי⁴⁹. לפיכך, מדידות זן in vivo ⁴⁹ עשויות לסייע בזיהוי יציבות פלאק בחולים. עם זאת, יש להיזהר עם תרגום ישיר של התוצאות המתקבלות לקרע רובד in vivo. ראשית, רקמת הרובד הסיבי חווה עומס מורכב יותר in vivo מאשר עומס מתיחה חד כיווני המשמש בפרוטוקול זה. שנית, רבדים טרשתיים הם מבנים מרובי רכיבים; התפלגות המתח והמתח in vivo ברקמת הרובד הסיבי יכולה להיות מושפעת מנוכחותם ומיקומם של מרכיבי הרובד האחרים, כגון הסתיידויות³⁷.

ניתן להשתמש בצנרת הדמיית מכנו זו גם לחקר רקמות קולגן אחרות. בדיקות מכניות גלובליות והדמיה מבנית של קולגן כבר נמצאות בשימוש נרחב עבור רקמות ביולוגיות. עם זאת, הערכה מקומית של תכונות טרום כישלון וכשל, כמו גם ארכיטקטורת קולגן, היא קריטית לאפיון מכני מדויק של רקמות סיביות הטרוגניות. אנו צופים כי המבנה של פרוטוקול חדש זה יספק תובנה נוספת לגבי יחסי הגומלין בין המיקרו-מבנה והמכניקה של מספר רקמות ביולוגיות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
טבעת הארכה 10 מ"מ	Thorlabs Inc.	CML10
15 מ"ל צינור	VWR	525-0150
20x APO טבילה במים מטרה	Leica	507701
תוכנת פורס תלת מימד	N / A	גרסה 4.11
50 מ"ל צינורות	VWR	525-0156
אקדח מברשת אוויר AB 430- קוטר זרבובית 0.3 מ"מ	Conrad	4.01614E+12
האפלה, בד ניילון עם ציפוי פוליאוריטן	Thorlabs
צבע רקמה שחור	Polysciences inc	24113-2
עדשת מצלמה, אורך מוקד 50 מ"מ	Thorlabs Inc.
מעמד מצלמה	MVL50M1 VWR	241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton לייזר	מדחס קוהרנטי
+ צינור אוויר	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	גרסה 2208
סרט קצף דו צדדי, 1.9 x 150 ס"מ	Pattex
אמבט חימום	N/A		בהתאמה אישית
+ תוכנת הדמיה	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
פלאק טרשת עורקים של הצוואר האנושי (מניתוח כריתת אנדארטרקטומיה של הצוואר)	N/A
תמונה J	המכון הלאומי לבריאות	N/A
LAS-AF	Leica	גרסה 2.3	תוכנת הדמיה מיקרוסקופ מולטיפוטון
LEICA TCS SP5 II	Leica		המשמש להדמיית SHG
מערכת	תאורהמכשירי AMZ	LED-60TB	משמש להשגת תמונות ברורות עם המצלמה המהירה
MATLAB	MathWorks	גרסה R2021A
תוכנת FibLab מבוססת MATLAB	האוניברסיטה הטכנולוגית של איינדהובן	N/A
MATLAB כלי FOA (ניתוח כיוון סיבים) מבוסס MATLAB	איינדהובן האוניברסיטה הטכנולוגית	N/A
תוכנת Ncorr מבוססת MATLAB	גאורגיה המכון הטכנולוגי	גרסה 1.2
מחטים	צלחת פטרי אמרלד	BDAM302986
(קוטר 10 ס"מ)	VWR	BRND452000
Parafilm	VWR	291-1214
פיפטות פסטר	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת (μ CT) סורק + מסנן רנטגן של Cu 0.06 מ"מ + Al 0.5 מ"מ	PerkinElmer	CLS149276
Ruler	Fine Science Tools	1800030
נייר זכוכית (P180)	Conrad	4.00932E+12
חותך צד	Conrad	4.25084E+12
בסיס אלסטומר סיליקון וחומר ריפוי (Sylgard 184)	VWR	634165S
בודק מתיחה + תוכנה + מהדקים	N/A		מיוצרים בתוך החברה באמצעות מפעיל ליניארי גלילי (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), ותא עומס של 10 N (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
מברג מומנט	גרנט, קבוצת הופמן	659906