הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית
במאמר זה
סיכום
תקציר
Aptamers הן מולקולות זיהוי מטרה שנקשרות עם זיקה גבוהה וספציפיות. ניתן למנף מאפיינים אלה כדי לשלוט במולקולות אחרות בעלות יכולת יצירת אותות. עבור המערכת המתוארת כאן, זיהוי מטרה באמצעות תחום אפטמרי, Stem II של ריבוזימי ראש פטיש שונה, מפעיל את הריבוזיום המתבקע מעצמו על ידי ייצוב המבנה הבלתי מובנה הראשוני. הרנ"א החותך פועל בצומת של גזע III וגבעול I, ויוצר שני תוצרי מחשוף. מכפלת המחשוף הארוכה יותר יוצרת תגובת הגברה מעריכית איזותרמית (EXPAR) של שני מרובעי G פעילים קטליטית דומים. תוצרי ההגברה המתקבלים מזרזים הפחתת פרוקסידאז, המשולבת להפחתה של מצע קולורימטרי עם פלט שהעין הבלתי יכולה לזהות. המערכת בת 3 החלקים המתוארת במחקר הנוכחי משפרת את שיטות הזיהוי כגון בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs) על ידי הפקת אות חזותי הניתן לזיהוי לציון נוכחות של תאופילין נמוך עד 0.5 מיקרומטר תוך 15 דקות בלבד.
מבוא
Aptamers הם בדרך כלל DNA חד גדילי או RNA שנבחר בתהליך אבולוציוני עם זיקה גבוהה קישור וספציפיות למטרות הרצויות1. בנוסף ליכולת הקשירה, ניתן לקשר ולשלוט במוטיבים של אותפלט 2,3, להגביר את האות האמור ולשפר את רגישות המערכת. מערכת G-quadruplex איזותרמית מעריכית מעריכית (GQ-EXPAR) היא מערכת בת שלושה חלקים (איור 1) המפתחת אות חזותי כאשר רכיבים עוקבים מתווספים לכלי תגובה יחיד כדי להפיק פלט חזותי4. מערכת זו מאפשרת זיהוי של מטרה ספציפית, להלן תיאופילין, בדגימה נתונה תוך 15 דקות באמצעות זרימת עבודה יעילה המאפשרת זיהוי מהיר וספציפי של מטרה מעניינת. יש לשקול שיטה זו עבור דגימות שבהן כימות ספציפי של ריכוז המטרה הוא חשש נמוך יותר מאשר ספציפיות גבוהה של התגובה בזמן קצר.
ריבומתג אלוסטרי, מולקולת RNA מחליפת מבנה (ריבוזים) שעוברת פיצול עצמי, מייצרת את האות הראשוני. מבנה זה מבוסס על ריבוזימי ראש פטיש, עם תחום אפטמרי שהוכנס בגזע II כמווסת של פעילות המחשוף. פונקציית המחשוף העצמי שלו מופעלת כאשר התחום האפטמרי שלו מיוצב על קשירה למטרה5. אחרת, המתג אינו פעיל במצבו המקורי.
תגובת ההגברה המעריכית העוקבת (EXPAR) משתמשת בשחרור גדיל הרנ"א העצמי מהשלב הראשון לתגובת הגברה איזותרמית6. תוצר ההגברה של EXPAR הוא בעל פעילות פרוקסידז7, הפועל כבסיס לשלב האחרון של המערכת. כאשר חלק מהמצעים מחומצנים בשילוב עם פירוק מי חמצן, הם מייצרים פלט פלואורסצנטי שניתן למדוד על מכשור שונה. ניתן להחליף מצעים נפוצים אחרים כדי לייצר מוצר צבעוני לזיהוי חזותי. EXPAR ופעילות הפרוקסידז של מוצרי ההגברה שלה פועלים כמשפר אותות דו-שלבי, ומגבירים את הרגישות לרמות גבוהות יותר בהשוואה לאסטרטגיות קונבנציונליות 7,8.
הזיהוי של תאופילין לעומת קפאין משמש כדוגמה לספציפיות של פלטפורמת הזיהוי הזו, מאחר שהם נבדלים רק בקבוצת מתיל אחת (איור 2). הדגמה זו של המערכת מייצרת פלט קולורימטרי לזיהוי חזותי של לפחות 500 ננומטר תיאופילין.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ראה טבלה משלימה 1 (טבלת מערך התגובה) להכנת הצינור, כולל הנפחים והריכוזים הספציפיים של רכיבי התגובה. הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בערכת פלטפורמת זיהוי שהורכבה מראש כמתואר בטבלת החומרים. כל הרכיבים חייבים להישמר על קרח אלא אם צוין אחרת.
1. הכנת ריבוזימים
הערה: רכיב הזיהוי העיקרי הוא ריבוזים אלוסטרי (מווסת אפטמר) המזהה תאופילין (ראה טבלה משלימה 2).
- יש לאסוף 5U של פולינוקלאוטיד קינאז T4 (0.5 μL, ראו טבלת חומרים) בצינור PCR, אשר ישמש להפעלת תוצרי המחשוף של הריבוזים.
הערה: רכיב זה נוסף תחילה כדי שהמשתמש יוכל לראות את הניפוק הנכון של האנזים. - הוסף 1 μL של חיץ ריבוזימי 5x מוכן מראש (ראה טבלת חומרים) לכל צינור דגימה (צינור PCR).
- למטרות הדגמה חזותית של ספציפיות, הוסף 1.5 μL של 2 mM תאופילין (מטרה) או 2 mM קפאין (בקרה) (ראה טבלת חומרים) לכל מבחנה כדגימות הבדיקה.
הערה: לצורך קביעת עקומה סטנדרטית, מומלץ להתחיל באנליזה של 3.125 מילימטר ולבדוק דילול פי חמישה עד 0.001 מילימטר. - מערבבים היטב כל צינורית דגימה על ידי פיפטינג 5-10 פעמים.
- הוסף 2 μL של 600 nM RNA המכיל תחום aptameric ספציפי למטרה (ראה טבלת חומרים) לכל צינור דגימה כדי להגיע לריכוז סופי של 240 nM ב 5 μL של תמיסת בדיקה, ולאחר מכן לערבב במהירות על ידי pipetting ולהניח על בלוק קר כדי למזער את אות הרקע.
הערה: חשוב להכין תחילה את כל התגובות ללא ריבוזים, שכן תגובת המחשוף העצמי תתחיל מיד כאשר ריבוזים משולב עם חיץ ריבוזימים ועשוי לייצר רקע משמעותי. - לאחר הכנת כל צינורות התגובה, יש לדגור על כל דגימה (5 מיקרוליטר) בטמפרטורת החדר (23°C) למשך 3 דקות בדיוק באמצעות טיימר. מיד להחזיר את צינורות הדגימה לקרח (4 ° C) לאחר הדגירה.
2. GQ-EXPAR
- הוסיפו 3.5 מיקרוליטר של תערובת אנזימים ניקאז-פולימראז (ראו טבלת חומרים) לכל צינור דגימה וערבבו היטב.
הערה: ריכוזי האנזימים הנדרשים תלויים ברצפי הזיהוי, סוגי האנזימים וטמפרטורות התגובה, שהשילוב ביניהם נקבע אמפירית. - הוסף 31.5 μL של תערובת תגובת EXPAR המכילה תבנית, נוקלאוטידים ומאגר תגובה (ראה טבלת חומרים) לכל צינור דגימה ופיפט לערבוב.
הערה: ריכוזי הרכיבים ממוטבים בהתבסס על האנזימים והרצפים של תוצרי פולימראז. - לאחר הכנת כל הדגימות, יש לדגור על כל דגימה מוכנה (40 מיקרוליטר) בטמפרטורה של 55°C למשך 5 דקות בדיוק באמצעות טיימר. אם אפשר, לדגור על thermocycler, אם כי מכסה מחומם הוא מיותר.
- מיד להחזיר את צינורות הדגימה לקרח (4 ° C) לאחר שלב הדגירה.
3. פיתוח צבע
- הוסף 2 μL של תמיסת Hemin (25 uM, ראה טבלה של חומרים) לכל צינור דגימה וערבב היטב.
- הוסף 58 μL של תמיסת TMB הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) לכל שפופרת דגימה וערבב היטב.
- לדגור על תגובת התפתחות הצבע (100 μL) בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות לפחות ועד 30 דקות.
הערה: (אופציונלי) ניתן לעצור את התפתחות הצבע על-ידי הוספת 20 מיקרוליטר של חומצה גופרתית בנפח 2 M. - קרא את הדגימות באופן איכותי בעין, או כמת את התוצאות באמצעות קורא לוחות ספיגה ב 450 ננומטר אם תגובות התפתחות הצבע נעצרות באמצעות חומצה גופרתית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פלטפורמת הזיהוי המתוארת באיור 1 ממירה זיהוי מטרה אפטמרי להבדלים חזותיים ברורים בין תכשירי הדגימה (מטרה לעומת מטרה שאינה מטרה, איור 2) בפרק זמן קצר. ריבוזים אלוסטרי שזוהה על ידי Soukup et al.5 שימש כנקודת המוצא ליצירת רצף פחות רועש עם תגובה למטרה על פני דגימות הביקורת והשליליות. המבנה הממוטב היה מסוגל לזהות תאופילין של 500 ננומטר בלבד ב-30 דקות (איור 3) – תכשירי דגימה שנחשפו למטרה מייצרים צבע כחול בשלב 3, בעוד...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה המוצגת כאן מנצלת את המעבר בין מבנה משני לא מסודר בתחילה בריבוזימים אלוסטריים לבין היציבות הנוספת המוענקת באמצעות קשירת המטרה לתחום האפטמרי כדי להפעיל את ריבוזימי ראש הפטיש cis-cranking. יציבות הריבוזים הותאמה כדי למזער את הפעילות הקטליטית בהיעדר המטרה תוך מתן אפשרות לקשירת המטרה לשחזר את המבנה הפעיל. בנוסף, יש להקפיד על איזון החוצצים של האנזימים המרובים הדרושים להקלה על התפתחות ה-EXPAR והצבע. לבסוף, בהתחשב בכך שמדובר במערכת תלת שלבית, השילוב של זמני הדגירה והטמפרטורות לצד ריכוזי רכיבי התגובה גרם לכך שמקסום האות תוך...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
Aptagen, LLC מייצרת ומשווקת ערכת הדגמה GQ-EXPAR למי שרוצה ניסיון ישיר עם מערכת זיהוי מבוססת אפטמר.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מימון המחקר והפיתוח של Aptagen LLC.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) עם H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | מגיב לפיתוח צבע. צמצם את החשיפה לאור ולאווירה. בעבר מספר קטלוג BIOO Scientific 1806. סופק בערכת הדגמה של Apta-beacon כצינור 3-2. |
| 5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC CCC TCC CCA GA-BIOTIN-3' | טכנולוגיות DNA משולבות (IDT) | תבנית DNA QtQ47 מותאמת אישית עבור EXPAR לייצור G-quadruplex, מוכן על ידי G-quadruplex. זה משמש עבור החלק ה"אקספוננציאלי" של EXPAR, כדי להגדיל במהירות את כמות ה-DNAzyme המשמשת לפיתוח צבע שלב 3. התבנית כוללת 3'-ביוטין למניעת הרחבה לא מכוונת על ידי Bst 2.0 DNA פולימראז במהלך EXPAR. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 2-2. | |
| 5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG UU GUAG UU-3' | טכנולוגיות DNA משולבות (IDT) | רצף ריבוזים אלוסטרי המזהה תיאופילין מותאם אישית (ריבוזים בעל פיצוח עצמי המווסת על ידי תחום אפטמר RNA עבור תיאופילין) שונה מ- Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) שינוי זיהוי מולקולרי של אפטמרים RNA על ידי ברירה אלוסטרית, כתב העת לביולוגיה מולקולרית 298, 623-632. מסופק בערכת הדגמה של Apta-beacon כצינור 1-3. | |
| 5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TACC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-BIOTIN-3' | טכנולוגיות DNA משולבות (IDT) | תבנית DNA P3tQ49 מותאמת אישית עבור EXPAR לייצור G-quadruplex, מוכן על ידי מוצר מחשוף P3. זה משמש בשלב 2 כדי לתרגם את תוצר המחשוף ל-DNAzyme המשמש לפיתוח צבע שלב 3. התבנית כוללת 3'-ביוטין למניעת הרחבה לא מכוונת על ידי Bst 2.0 DNA פולימראז במהלך EXPAR. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 2-2. | |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | הרכב פי 5: 600 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5), 150 מ"מ MgCl2, 25 mM DTT. משמש בשלב 1. מסופק בערכת הדגמה של Apta-beacon כצינור 1-4. |
| ערכת הדגמה Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | ערכת ההדגמה מציגה את הספציפיות של הבדיקה הקולורימטרית על ידי זיהוי מטרות קשות של מולקולות קטנות, תיאופילין לעומת קפאין, הנבדלות רק בקבוצת מתיל אחת. |
| Bst 2.0 DNA פולימראז | ניו אינגלנד Biolabs | M0537S | פולימראז הגברה איזותרמית עם פעילות תזוזה של גדיל. חלק מתערובת ניקאז-פולימראז, שהוכנה ב-9.375 U/uL. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | בשילוב עם 2 uL של מאגר הגברה איזותרמית 10X ו-27.5 uL של מים נטולי נוקלאז כדי לייצר 1.11X EXPAR Buffer ב-EXPAR Mix. מוצר זה מחליף את B7203SVIAL ששימש בעבר שהיה חלק מפיתוח המערכת הראשוני (אותו הרכב למעט BSA לא רקומביננטי). חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 2-2. |
| קפאין | סיגמא-אולדריץ' | C0750-100G | אפטמר מטרה נגדית (בקרה), מוכן עם מים נטולי נוקלאז. מסופק בערכת הדגמה של Apta-beacon כצינור 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | חלק מתערובת התגובה EXPAR. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 2-2. |
| תערובת תגובה EXPAR | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μ M P3tQ49, 0.38 μ M QtQ47, 44.44 מ"מ Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 מ"מ NaCl, 31.5 מ"מ KCl, 6.35 מ"מ MgCl2, 1.27 מ"מ MgSO4, 6.35 מ"מ (NH4)2SO4, 63.5 μ גרם/מ"ל BSA, 0.0635% Tween 20. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | מושעה ב-DMF לריכוז סופי של 25 uM. מסופק בערכת הדגמה של Apta-beacon כצינור 3-1. |
| מאגר הגברה איזותרמי | ניו | אינגלנד ביולאבס | B0537SVIAL בשילוב עם 2 uL של מאגר 10x 3.1 ו-27.5 ומיקרו; L של מים נטולי נוקלאז לייצור 1.11x EXPAR Buffer ב-EXPAR Mix. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | קופקטור ריבוזיים ראש פטיש, הכרחי למחשוף עצמי. חלק מצינור ערכת הדגמה של Apta-beacon 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler לשליטה בטמפרטורות הדגירה. ניתן להשתמש בכל תרמו-סייקלר או בלוק חם. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | משמש להשעיית המין ולמקסום חיי המדף במקפיא. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 3-1. |
| ניקאז-פולימראז מיקס | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 יחידות/μ L) ו-Bst 2.0 DNA פולימראז (0.5 יחידות/μ L). מסופק בערכת הדגמה של Apta-beacon כצינור 2-1. |
| Nt.BstNBI | ניו אינגלנד Biolabs | R0607S | אנזים חיתוך כדי לאפשר המשך הגברה איזותרמית. חלק מתערובת ניקאז-פולימראז, שהוכנה ב-0.5 U/uL. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | מאגר לאנזים הדרוש להסרת פוספט מחזורי. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 1-4. |
| T4 פולינוקלאוטיד קינאז ניו | אינגלנד Biolabs | M0201S | מסיר פוספט מחזורי לאחר מחשוף כדי לאפשר לתוצר המחשוף להגביר את תגובת ההגברה האיזותרמית. מסופק בערכת הדגמה של Apta-beacon כצינורות PCR. |
| קורא צלחות Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | למדידת אות ספיגה מתוצאות שלב 3. |
| יעד אפטמר Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | , מוכן עם מים נטולי נוקלאז. מסופק בערכת הדגמה של Apta-beacon כצינור 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. חלק מצינור ערכת ההדגמה של Apta-beacon 1-4. |
מקורות
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
