מאמר שיטה

גישת הדמיה תוך-חיונית פלואורסצנטית לחקר דינמיקת איתות סידן הנגרמת על ידי עומס באוסטאוציטים של עכברים

DOI:

10.3791/64366

⸱

24 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, 3Department of Biomedical Engineering, The City College of New York, 4Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Orthopaedic Surgery, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המאמר הנוכחי מתאר ביצוע גישת הדמיה תוך-חיונית כדי לצפות באיתות סידן המושרה מכנית של אוסטאוציטים משובצים in vivo בזמן אמת בתגובה לעומס מכני ברמת הרקמה של המטטרסל השלישי של העכבר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת העצם רגישה להפליא להבדלים בגודל העומס המכני. אוסטאוציטים, תאים דנדריטיים היוצרים סינציטיום בכל העצם, אחראים על התפקוד המכנו-סנסורי של רקמת העצם. מחקרים המשתמשים בהיסטולוגיה, מודלים מתמטיים, תרביות תאים ותרביות איברי עצם ex vivo קידמו מאוד את ההבנה של מכניוביולוגיה של אוסטאוציטים. עם זאת, השאלה הבסיסית כיצד אוסטאוציטים מגיבים ומקודדים מידע מכני ברמה המולקולרית in vivo אינה מובנת היטב. תנודות בריכוז הסידן התוך-תאיות באוסטאוציטים מציעות מטרה שימושית ללמידה נוספת על מנגנוני טרנסדוקציה מכניים חריפים של העצם. כאן, אנו מדווחים על שיטה לחקר מכניוביולוגיה של אוסטאוציטים in vivo, המשלבת זן עכבר עם אינדיקטור סידן מקודד גנטית פלואורסצנטי המתבטא באוסטאוציטים עם מערכת העמסה והדמיה in vivo כדי לזהות ישירות את רמות הסידן האוסטאוציטים במהלך ההעמסה. זה מושג באמצעות מכשיר כיפוף תלת-נקודתי שיכול לספק עומסים מכניים מוגדרים היטב למטטרסל השלישי של עכברים חיים ובמקביל לנטר תגובות סידן פלואורסצנטיות של אוסטאוציטים באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. טכניקה זו מאפשרת תצפית ישירה in vivo על אירועי איתות סידן אוסטאוציטים בתגובה לעומס עצם שלמה והיא שימושית במאמץ לחשוף מנגנונים במכניוביולוגיה של אוסטאוציטים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטריצת העצם מאורגנת על פי דרישה מכנית 1,2 ויכולה להשתנות באופן דינמי כדי להסביר דרישות מכניות משתנות 3,4,5. עבודה מכוננת על המנגנון המכני-סנסורי בעצם פורסמה כמאמר מודלים לפני כ-30 שנה 6,7,8, שם הוצע כי אוסטאוציטים המוטמעים בתוך רקמת חישת העצם מרימים עיוות מכני באמצעות תנועת נוזלים בסביבתם המקומית. מודל זה אומת בניסוי בניסויים במבחנה ובניסויים מחוץ לגוף, שם הוכח בבירור כי אוסטאוציטים רגישים למדי למכניקה 1,2,3,4,5,6 וגם מבטאים ציטוקינים, המכוונים את התנהגותם של אוסטאובלסטים בוני עצם 7 ואוסטאוקלסטים 8,9,10, 11,12.

איתות סידן הוא שליח שני בכל מקום שהוקם כדמות מרכזית ויעד ניסוי אמין במכניוביולוגיה של אוסטאוציטים 13,14,15,16. לאיתות סידן יש יתרון בכך שהוא נחקר באופן נרחב בביולוגיה של התא17, מה שאומר שיש הרבה ידוע על ההשפעות שלו במורד הזרם ועל הכלים הפלואורסצנטיים המתאימים הזמינים לתצפית ניסויית. ניתוחים במבחנה השתמשו באיתות סידן כאמצעי לזיהוי הפעלה מכנית של אוסטאוציטים ואפיון התנהגות איתות דינמית 5,18,19. יש לציין כי תצפית על איתות סידן בקו תאי אוסטאוציטים סיפקה ראיות חותכות לכך שהפעלת נוזלים בחיבורי האינטגרין לאורך תהליך התא היא ככל הנראה הצורה העיקרית של הפעלת זרימת נוזלים20. מחקר זה הוא אחד מני רבים המציגים את התועלת של איתות סידן. הוא מושרה באופן אמין עם הפעלה מכנית של אוסטאוציטים ובכך משמש כמטרה רבת עוצמה לחקירת מכנוביולוגיה של אוסטאוציטים.

התמרה מכנית של אוסטאוציטים in vivo תלויה מאוד במיקרו-סביבה המיידית שלהם. חלבונים קושרי מטריצה (למשל, פרוטאוגליקנים, אינטגרינים) מספקים חיבורים פונקציונליים בין ממברנות התאים האוסטאוציטים בסידור שהוא קריטי להפעלת נוזלים של התא21,22. בעוד שניתוחים דו-ממדיים (2D) במבחנה מועילים, הם מוגבלים בכך שהם אינם משלבים את התכונות התלת מימדיות הקריטיות (3D) הללו. תכשירים מחוץ לגוף של איתות סידן אוסטאוציטים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית שפכו מעט אור על האופן שבו אוסטאוציטים מגיבים תוך שמירה על המטריצה שמסביב שלמה13,16. עם זאת, הסרת אספקת הדם מהעצם נחשבת כמשנה את החומרים המזינים ואת דינמיקת הנוזלים של המערכת הלקונו-תעלית. חקירה של מכאנוביולוגיה של אוסטאוציטים דורשת חקירה in vivo של איתות אוסטאוציטים המושרה על ידי עומס.

חקירה in vivo של תאים משובצים בעצם עוכבה במידה רבה על ידי המגבלות של טכניקות הדמיה מסורתיות, כגון שדה בהיר ומיקרוסקופיה קונפוקלית. אוסטאוציטים ממוקמים במטריצה מינרלית23 המורכבת מהידרוקסיאפטיט, קולגן מסוג 1 וחלבונים אחרים שאינם קולגניים המגבילים את הנגישות האופטית24 והופכים את החקירה in vivo למאתגרת מבחינה טכנית. עם זאת, ההתקדמות האחרונה בהדמיה פלואורסצנטית לא ליניארית ומדווחי סידן מקודדים גנטית מציגים את ההזדמנות להתגבר על אתגרים אלה.

כאן, אנו מדווחים על גישה חדשה עם היכולת לדמות אוסטאוציטים in vivo כדי למדוד איתות סידן ברזולוציה של רמת התא25. זה מושג על ידי שימוש בסמן פלואורסצנטי דינמי באמצעות אינדיקטור סידן מקודד גנטית בפעם הראשונה באוסטאוציטים של עכברים. עכברים עם ביטוי ממוקד אוסטאוציטים מונע DMP1-Cre של GCaMP6f מציגים פלואורסצנטיות גלויה באוסטאוציטים בכל קליפת המוח הדיאפיזיאלית של מטטרסלים של עכברים17,26. אנו משתמשים במערכת כיפוף תלת-נקודתית על מנת ליישם רמות פיזיולוגיות של עוצמת מתח בין 250-2,000 με27. טכניקה זו מאפשרת הדמיה in vivo של דינמיקת איתות סידן אוסטאוציטים במהלך העמסה מכנית של העצם כולה ויכולה להיות שימושית לכל מי שמבקש להבין מכאנוביולוגיה של אוסטאוציטים. שיטה זו תתאים לחוקרים המבקשים להרחיב את עבודתם מניתוחים במבחנה ליישומי in vivo, במיוחד תוך שמירה על ניתוחים מולקולריים מבוססי תפקוד (כלומר, חקירת פעילות תאית באמצעות איתות סידן) בניגוד למחקרי פנוטיפ רחבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קורנל.

1. הכנת חומרים וציוד

  1. תכנן ובנה את מכשיר הטעינה המטטרסלית לשימוש עם מיקרוסקופ מולטיפוטון עילי.
    הערה: פרטים על מפרטי הרכיבים ופעולת ההתקן מתוארים בתיעוד המשלים של מחקר קודם25. בקצרה, הרכיבים העיקריים מורכבים ממפעיל בסדרה עם תא עומס ותושבת טעינה, אמבט מים וסיכת נקודת משען. ניתן להשיג את המפעיל ותא העומס באופן מסחרי והם אמורים להיות מסוגלים להכיל עומסים של עד 300 גרם. אמבט המים, סיכת נקודת המשען ותושבת העומס צריכים להיות בנויים מטיטניום או נירוסטה. ניתן לייצר אותם בבית או באופן מסחרי באמצעות הדפסת מתכת תלת מימדית.
  2. כייל את ערכי גודל המתח לתזוזה של המפעיל מראש עבור קבוצות עכברים בודדות (כלומר, מין, טיפול, גנוטיפ). זה נעשה באמצעות מיפוי מתח פני השטח בהליך שתואר במחקר קודם25.
  3. השתמש בעכברים עם רקע C57BL/6, בגילאי 16-18 שבועות, המבטאים מבנים של אינדיקטור סידן פלואורסצנטי באוסטאוציטים. ביטוי ממוקד של אוסטאוציטים מושג על ידי הכלאה של עכברי GCaMP6f ו-Dmp1-Cre המופעלים על ידי פלוקס. הפרטים של אסטרטגיות רבייה וספקים של עכברים מייסדים מתוארים במחקר שפורסם בעבר25.
  4. עקר את כל הכלים הכירורגיים, תושבת העומס, אמבט המים וסיכת נקודת המשען באמצעות חיטוי (57.2 מעלות צלזיוס, 15 psi, 3-4 דקות). חיטוי מטרות מיקרוסקופ עם 100% אתנול.
  5. הפעל רכיבים אלקטרוניים, כולל מקור לייזר, מיקרוסקופ, תא עומס ומפעיל. אפשר 15-20 דקות לכל רכיב להתחמם לפני הדמיה תוך-חיונית.
    1. ודא שרכיבי המפעיל ותא העומס מחוברים ומופעלים בהתקן הבקרה. צור את תוכנת הבקרה עם מגוון פלטפורמות, כולל Matlab, LabView ו-Python, בהתאם להעדפות המשתמש. קוד ה-Matlab העיקרי המשמש במחקר זה נקרא Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (בתוך תיקיית MT3 Loading Device Control Software.zip קובץ משלים 1).
      הערה: רוב מערכות המיקרוסקופ הדו-פוטוני הזמינות מסחרית מגיעות עם תוכנת הדמיה חזקה. המאפיינים העיקריים הנדרשים לשיטה זו הם היכולת לכוון לייזר לעירור המתאים ל-GCaMP6f (920 ננומטר), היכולת להתאים את עוצמת הספק הלייזר ואיסוף סדרות זמן בתדר של לפחות 6 הרץ. לפני הניסוי, יש לאשר חיבור לייזר לתוכנת ההדמיה וסידור נתיב האור המתאים להדמיה דו-פוטונית. זה מאושר בדרכים שונות בהתאם להגדרת ההדמיה. בדרך כלל, יש מחוון אור.

2. ניתוח

  1. הכינו שלב כירורגי ועקרו את פני השטח עם 70% אתנול. ודא כי נעשה שימוש בטכניקות אספטיות לאורך כל ההליכים הכירורגיים. שמור על רמת הניקיון הנדרשת לפרוטוקול זה, מכיוון שמדובר בהליך סופני.
  2. להרדים את העכבר עם איזופלורן מאודה מעורבב עם אוויר או חמצן ברמה רפואית בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה. בצע הרדמה ראשונית בתא אינדוקציה של מכרסמים עם 3%-5% איזופלורן. שמור על הרדמה של 1%-2.5% איזופלורן בקונוס האף להליכי הדמיה כירורגיים ותוך חיוניים.
  3. הנח מכשיר חימום מתחת או ליד העכבר כדי לסייע בשמירה על טמפרטורת גוף הליבה ההומאוסטטית. עקוב אחר טמפרטורת הגוף של העכבר, קצב הלב וריווי החמצן לאורך כל הניתוח. שמרו על קצב הנשימה בין 60-80 נשימות לדקה ושמרו עליו על ידי התאמת מינון האיזופלורן.
  4. הנח את העכבר במצב שכיבה. אשר את עומק ההרדמה לפני החתך באמצעות צביטה בבוהן. זהה את המיקום בין המטטרסל השני והשלישי. בצע חתך אזמל דרך הדרמיס בין המטטרסל השני והשלישי, החל מהקצה הדיסטלי והתקדם באופן קרוב לאורך העצמות (~5 מ"מ).
    הערה: המטטרסלים דיסטליים לעצמות הקרסול בכפה ועוקבים ישירות קרוב לפלנגות הדיסטליות. הם מורכבים ממטטרסלים (מדיאליים לרוחביים) I, II, III, IV ו-V. המטטרסל השלישי מרוכז באמצע ההיבט הוולארי של הכפה האחורית.
  5. בעזרת מלקחיים, פתח את אתר הניתוח על ידי משיכת העור לכיוון הקצוות המדיאליים/רוחביים. כרתו את הגידים המאריכים באמצעות מספריים ישרים של Vannas כדי לחשוף את המטטרסל השלישי.
  6. הכנס את סיכת נקודת המשען המרכזית של מכשיר הטעינה של המטטרסל מתחת למטטרסל השלישי.
    1. בתחילה, הכנס את הסיכה לחלל הקטן בקצה הדיסטלי שבו המטטרסל השלישי פוגש את הפלנגה הפרוקסימלית ולאחר מכן הזז את הסיכה קרוב עד שהיא נחה באמצע הפיר של המטטרסל השלישי.
    2. הקפד במיוחד להבטיח ממשק ישיר בין העצם לסיכה, למעט כל שריר ופנים. זה קריטי להדמיה יציבה במהלך פרוטוקולי טעינה.
  7. החזק את הקרסול עם מלקחיים והנח את כף הרגל לתוך אמבט המים המלא בפוספט (DPBS) של Dulbecco (8-10 מ"ל). אבטח את הכפה במקומה עם תושבת הטעינה וחבר את התושבת לסידור המפעיל/תא העומס. הכנה וסידור כירורגי שהושלם בתוך המכשיר מוצג באיור 1.

3. הדמיה

הערה: למערך המיקרוסקופיה השלם של שני פוטונים המשמש בפרוטוקול זה יש שתי חבילות תוכנה: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 עבור הלייזר (איור 2) ו- ThorImageLS4.0 עבור המיקרוסקופ (איור 3). כדי לצלם על שני הפוטונים, לחץ על Live (איור 3, כפתור הפעלה כחול). בעת ביצוע ניסוי להדמיה ושמירת נתונים, לחץ על לכידה (איור 3, הכרטיסייה בחלק העליון, ליד הגדרת לכידה). אלה ספציפיים לציוד ולספקים המשמשים בניסוי זה, אך חלופות רבות עם המפרט הדרוש הנמצא בפרוטוקול זה (אורכי גל עירור, גודל חלון ניתן לצפייה, קצב לכידת תמונה וכו') יעבדו גם כן.

  1. הרם בזהירות רבה את מערך התקן הטעינה עם העכבר והנח אותו על פלטפורמת המיקרוסקופ.
  2. התחל עם מטרת הגדלה נמוכה במצב אפיפלואורסצנטי (איור 3, תפריט נפתח בחלק העליון עם בחירות Multiphoton או Fluorescence Setup) כדי לאתר ולמרכז את אמצע הדיאפיזה של העצם.
  3. לאחר איתור אזור מעניין, עבור להגדלה אובייקטיבית גבוהה יותר של טבילה במים (20x-40x) והעביר את האופטיקה לשני פוטונים (איור 3, תפריט נפתח למעלה עם בחירות Multiphoton או Fluorescence Setup).
    הערה: שדה הראייה המומלץ הוא לפחות 250 מיקרומטר x 250 מיקרומטר לפעילות סלולרית וניתן להשיג אותו באמצעות זום אופטי או דיגיטלי בהתאם למערכת ההדמיה.
    1. צפיפות הפיקסלים המינימלית המתאימה היא 512 פיקסלים x 512 פיקסלים. כדי להגדיר את צפיפות הפיקסלים, השתמש בהגדרות Galvo/Resonance Area Control (איור 3).
    2. בעת מציאת ההחזר על ההשקעה, הימנעו מפוטו-הלבנה על ידי הפחתת ההספק באמצעות אפשרות בקרת ההספק (איור 3,) והגדלת ה-PMT ampלהגברה בהגדרות בקרת סורק Galvo/תהודה (איור 3).
    3. זהה את פני העצם במצב דו-פוטוני על ידי חיפוש האוטו-פלואורסצנטי הסיבי periosteum בתעלה הירוקה המשתמשת במסנן פס פס שמרכזו 525 ננומטר.
      הערה: האוטו-פלואורסצנציה נראית ביותר עם אורך גל העירור ב-1,000 ננומטר אך זמינה גם בעירור של 920 ננומטר (איור 3, בקרת לייזר רב-פוטונית). ציון דרך זה חשוב לקביעת העומק היחסי של ה-ROI לקליפת המוח המטטרסלית בעת התבוננות באוסטאוציטים. יש לציין כי במהלך ניסויים בסדרות זמן, העומק המדויק של המטוס המצולם אינו נרשם, אם כי הוא נוטה לנוע בין 15-30 מיקרומטר. אם רוצים מדידות עומק מדויקות, יהיה צורך לבצע ערימת z.
  4. הפעל סיבוב טעינת מבחן כדי להבטיח שההכנה והמיקום הכירורגיים בתוך מכשיר הטעינה היו יעילים בהשגת שדה ROI יציב (כלומר, ללא תזוזה של מישור z). בקצרה, הפעל מחזור העמסה כדי להעריך את יציבות התכשיר הכירורגי. בצע טעינה על ידי הפעלת הקטע הפעל את סרוו והעבר בקוד Matlab.
    1. החל עומס טרה קטן. ודא כי פרוטוקולי טעינת גלי ההברסין המתאימים מוכנים מבעוד מועד. הזן פרמטרי טעינה מתאימים שהתקבלו במהלך הכיול בסעיף 1.2. בצע טעינה על ידי הפעלת הקטע הפעל את סרוו והעבר בקוד Matlab.
    2. אם יש תנועה נראית לעין של התאים על המסך, הנובעת ממיקרו-תנועה של העצם בתגובה לטעינה או נשימה, בחר החזר ROI שונה לאורך כיווני y או z כדי להבטיח שהוא נמצא ישירות מעל סיכת נקודת המשען המרכזית. אם התנועה נמשכת, כוונן את המיקום הכירורגי של הסיכה באופן ידני מתחת למטטרסל השלישי.
      הערה: אזור עניין טוב (ROI) הוא אזור שבו התאים אינם נעים פנימה והחוצה מהמישור/מיקוד. ניתן לכוונן את התנועה בכיווני x ו-y לעיבוד שלאחר שימוש בתוסף התאמת התבניות ב-ImageJ.
  5. בצע הדמיית z-stack או t-series עם טעינה בהתאם לתכנון הניסוי כדי לתעד אירועי איתות מורפומטריים או דינמיים המושרים על ידי עומס, בהתאמה.
    1. הגדר את אורך גל העירור עבור מחוון הפלואורסצנט (למשל, 920 ננומטר עבור GCaMP6f). עבור z-stack, השתמש ברזולוציה נמוכה מספיק כדי ללכוד תכונות של האוסטאוציטים, כגון צעדים של 0.25-1 מיקרומטר. עבור סדרה t, השתמש בהגדרות כדי לדגום לפחות פי 6 מקצב הטעינה. עבור קצב טעינה של 1 הרץ, הדמיה ב-6 פריימים לשנייה (FPS) מייצגת את קצב הלכידה המינימלי המתאים (איור 3, בקרת סורק Galvo/תהודה).
    2. לטעינה והדמיה חיה, אסוף נתוני בסיס לא טעונים בכל סיבוב. במחקר זה, עדיפות 60 שניות של הדמיה לא טעונה ואחריה 60 שניות של טעינה והדמיה. תכנן את פרוטוקולי הטעינה וההדמיה בהתאם. כדי לאסוף נתונים, לחץ על לכידה (איור 3, הכרטיסייה בחלק העליון, ליד הגדרת לכידה).
      1. תקופת העקשן לתגובת איתות סידן מלאה בתאי העצם מוערכת בכ-15 דקות28. המתן לפחות כל כך הרבה זמן בין התקפי טעינה רציפים בעת איסוף נתוני איתות דינמיים.
      2. לאורך כל הניסוי, אל תשאירו את החיה ללא השגחה כדי להבטיח שהיא לא תתעורר באופן בלתי צפוי מההרדמה או תחווה מצוקה ללא אפשרות להתערבות.
        הערה: המתת חסד בסוף ההליך צריכה להתבצע באמצעות פריקת צוואר הרחם או אמצעים מתאימים אחרים בהתאם לשיטות שאושרו על ידי IACUC. זהו פרוטוקול שאינו הישרדותי, כלומר כל בעלי החיים מורדמים לאחר ההדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מדווחים על מתודולוגיה לחקר איתות סידן באוסטאוציטים משובצים in vivo באמצעות הכנה כירורגית חריפה והדמיה פלואורסצנטית מרובת פוטונים. ניתן לצפות באות פלואורסצנטי ירוק ממדדי סידן מקודדים גנטית באוסטאוציטים באמצעות ביטוי DMP1-Cre. איור 4 הוא תמונה חד-מישורית של אוסטאוציטים משובצים. שימו לב שכל התאים מסומנים ומבטאים פלואורסצנטיות ירוקה בסיסית, מה שמקל על מציאת מועמדים לתצפית ניסויית. גופי התאים נראים בבירור, ומדי פעם ניתן להבחין בתהליכים תאיים. מניסיוננו, תאי רירית העצם אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קשה לחקור אוסטאוציטים באופן ניסיוני בגלל מיקומם המוטבע במטריצת הרקמה הקשה, אליה הם מתדרדרים במהירות או מתבדלים עם הסרת נישה זו. חקר אוסטאוציטים דרש כושר המצאה עצום במהלך שלושת העשורים האחרונים, כגון יצירת קווים דמויי אוסטאוציטים29,30,31, קביעת פרוטוקולים לבידוד אוסטאוציטים ראשוניים32,33, ואפילו המאמצים להעמיס עצמות מנותחות זמן קצר לאחר ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#3 ידית אזמלמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72040-03אספקה כירורגית
20x מטרת טבילהבמים אולימפוסXLUMPLFLN20XWזהו יעד פי 20, אך ניתן להשתמש בו גם פי 40 לפרוטוקול זה. אנו ממליצים על טבילה במים מכיוון שצריך לטבול אותם באמבטיה במהלך ההדמיה, כך שמטרה באוויר הפתוח עלולה לגרום לקיצורים
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120תשובה הגיונית לבעיות גז הרדמה בחדר הניתוח, מסנן גז ההרדמה F/AIR תוכנן במיוחד להסרת גזי הרדמה פסולת כגון איזופלורן, Halothane, Enflurane וכו 'מסביבת חדר הניתוח.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit AM Bickford80000ערכה שלמה עם צינור ומתאמים לחיבור F/AIR להתקנה
B6J. Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJמעבדת ג'קסון28865עכברי GCaMP6f להכלאה עם עכברי Dmp1-Cre
B6N. FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJמעבדת ג'קסון23047עכברי Dmp1-Cre להכלאה עם עכברי GCaMP6f 
תא עומס דחיסהFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100, 1000 גרם, תא עומס מתח ודחיסה תת-מיניאטורי (הברגה מיניאטורית/מוטבעת), נטול עופרת RoHS, חומר - 17-4 PH S.S., M3x0.5-חוט, כבל פוליאסטר קלוע 34 Awg 4 מוליך,
5 רגל קורנינג 500 מ"ל DPBS (מי מלח חוצץ פוספט של Dulbecco), 1x [+] סידן, מגנזיוםVWR International21-030-CVאמבטיה מאוזנת יונית המכילה סידן טובל את המטטרסל במהלך ההדמיה
כלי איסוף שינייםאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעיאספקה כירורגית
אלכוהול אתילי טהור 200 הוכחה מגיב ACS >99.5%סיגמא אולדריץ'SIAL-459844-500MLמטרות עיקור
סיכת משעןFathomN/Aמיוצר על ידי סינטר לייזר תלת מימד ישיר של נירוסטה (סגסוגת PH1) מקבצי STL תלת מימדיים של SolidWorks. הספק המקורי היה GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, שנרכשה כעת על ידי FATHOM, המפרטים מסופקים במסמך שפורסם בעבר
ערכת פלט USB220 ברזולוציה גבוהה ובמהירותFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435משמש לחיבור תא עומס למחשב נייד
ImageJ 1.53t עם Java 1.8.0_172 (עבור Windows 64 סיביות)NIHN/Aהתקן כאן https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100% נוזל אדים בשאיפה
תושבת טעינהFathomN/Aמיוצר על ידי סינטר לייזר תלת מימד ישיר של נירוסטה (סגסוגת PH1) מקבצי STL תלת מימדיים של SolidWorks. הספק המקורי היה GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, שנרכשה כעת על ידי FATHOM, המפרטים מסופקים במסמך שפורסם בעבר
MATLAB R2019aMathWorksלהפעלת מכשיר הטעינה
Matrx VIP 3000 וופורייזר מילוי היטב איזופלורןבאטלר שיין בריאות בעלי חיים14309וופורייזר להרדמה
אוקסימטר דופק Nonin דגם 2500A Vet2500A Vet
Piezo servo בקרPI-USAE-625רכיב אלקטרוני המומלץ על ידי החברה לשימוש עם המפעיל
PiezoMove מפעיל piezo ליניארי בעל קשיחות גבוההPI-USAP-602.5SLמפעיל למכשיר הטעינה
להבי אזמל, מס' 10 לידית מס' 3, חבילה של 100אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה72044-10אספקה כירורגית
פינצטה מנירוסטה עם טיפים חדים ועדינים. אורך: 120 מ"ממדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים78326-42אספקה כירורגית
Thorlabs ברגמו מיקרוסקופ מולטיפוטוןThorLabsN/Aזוהי רק מערכת ההדמיה ואינה כוללת את הלייזר, אם כי ל-ThorLabs יש אפשרויות לייזר במידת הצורך
טיטניום-ספיר זיקית דיסקברי NX עם בקרת הספק כוללת (TPC)קוהרנטיN/Aלמערכת זו יש מבחינה טכנית שני לייזרים, גם לייזר מתכוונן וגם לייזר קבוע. עם זאת, עבור הפרוטוקול, יש צורך רק בכוונון. 
מספריים קפיציים של Vannas - 4 מ"מ חוד החניתFine Science Tools15018-10אספקה כירורגית
אמבט מיםFathomN/Aמיוצר על ידי סינטר לייזר תלת מימד ישיר של נירוסטה (סגסוגת PH1) מקבצי STL תלת מימדיים של SolidWorks. הספק המקורי היה GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, שנרכשה כעת על ידי FATHOM, המפרטים מסופקים במסמך שפורסם בעבר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
  2. Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).
  3. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).
  4. Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes. Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).
  5. Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).
  6. Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. Osteocyte signaling in bone. Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).
  7. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  8. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  9. Kennedy, O. D., et al. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations. Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).
  10. Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2. Bone. 27 (2), 241-247 (2000).
  11. David, V., et al. Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain. Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).
  12. Davies, C. M., et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system "Zetos": systems and culture preparation. European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).
  13. Adachi, T., et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).
  14. Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).
  15. Morrell, A. E., et al. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation. Bone Research. 6, 6(2018).
  16. Jing, D., et al. In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading. FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).
  17. Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  18. Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).
  19. Jing, D., et al. Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid. Bone. 53 (2), 531-540 (2013).
  20. Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).
  21. Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).
  22. McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix. The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).
  23. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  25. Lewis, K. J., et al. Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).
  26. Lu, Y., et al. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).
  27. Rubin, C. T., Lanyon, L. E. Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling. Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).
  28. Jacobs, C. R., et al. Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells. Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).
  29. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  30. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  31. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  32. vander Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  33. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  34. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bivo

מאמרים קשורים