הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

Moirangthem Kiran Singh; Linda J. Kenney

doi:10.3791/64382

מאמר שיטה

הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

DOI:

10.3791/64382

⸱

10 בפברואר 2023

Moirangthem Kiran Singh¹ , Linda J. Kenney¹

¹Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מספק פרוטוקול פשוט וברור לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר הרחבת קוד גנטי (GCE) ספציפי ותמונה של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות הפרשה מסוג שלוש (T3SSs) מאפשרות לחיידקים גראם-שליליים להזריק סוללה של חלבוני אפקט ישירות לתוך הציטוזול של תאי המאכסן האיקריוטיים. עם כניסתם, חלבוני ההשפעה המוזרקים מווסתים בשיתוף פעולה מסלולי איתות אאוקריוטים ומתכנתים מחדש תפקודים תאיים, מה שמאפשר כניסה והישרדות של חיידקים. ניטור ולוקליזציה של חלבוני השפעה מופרשים אלה בהקשר של זיהומים מספק טביעת רגל להגדרת הממשק הדינמי של אינטראקציות מארח-פתוגן. עם זאת, תיוג והדמיה של חלבוני חיידקים בתאים מארחים מבלי לשבש את המבנה / תפקוד שלהם הוא מאתגר מבחינה טכנית.

בניית חלבוני היתוך פלואורסצנטיים אינה פותרת בעיה זו, מכיוון שחלבוני ההיתוך תוקעים את מנגנון ההפרשה ולכן אינם מופרשים. כדי להתגבר על מכשולים אלה, השתמשנו לאחרונה בשיטה לתיוג פלואורסצנטי ספציפי לאתר של חיידקים המופרשים אפקטורים, כמו גם חלבונים אחרים שקשה לתייג, באמצעות הרחבת קוד גנטי (GCE). מאמר זה מספק פרוטוקול מלא שלב אחר שלב לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר GCE ספציפי, ואחריו הוראות להדמיית לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)

ממצאים אחרונים מצביעים על כך ששילוב של חומצות אמינו לא קנוניות (ncAAs) באמצעות GCE, ואחריו תיוג ביו-אורתוגונלי עם צבעים המכילים טטרזין, היא טכניקה בת קיימא לתיוג סלקטיבי והדמיה של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים וניתוח תמונה לאחר מכן בפונדקאי. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול פשוט וברור שיכול לשמש חוקרים המעוניינים לבצע הדמיה ברזולוציית על באמצעות GCE כדי לחקור תהליכים ביולוגיים שונים בחיידקים ווירוסים, כמו גם אינטראקציות מארח-פתוגן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים חיידקיים נחשבים זה מכבר לסכנה חמורה לבריאות האדם. פתוגנים משתמשים במערכות הגנה מפותחות, חזקות מאוד ומורכבות, כמו גם במגוון גורמי אלימות חיידקיים (המכונים חלבוני אפקטור) כדי להתחמק מתגובות החיסון של המאכסן וליצור זיהומים ^1,2. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מערכות אלה ותפקידם של חלבוני השפעה בודדים עדיין אינם ידועים במידה רבה בשל המחסור בגישות מתאימות למעקב ישיר אחר רכיבי החלבון החיוניים והמשפיעים בתאים המארחים במהלך הפתוגנזה.

דוגמה אופיינית אחת היא Salmonella enterica serovar Typhimurium, אשר גורם דלקת גסטרואנטריטיס חריפה. סלמונלה טיפימוריום משתמש במערכות הפרשה מסוג שלוש (T3SS) כדי להזריק מגוון חלבונים משפיעים ישירות לתאים מארחים. ברגע שהסלמונלה נכנסת לתא המארח, היא שוכנת בתא הקשור לקרום חומצי, המכונה VACUOLE המכיל סלמונלה (SCV)^3,4. ה- pH החומצי של ה- SCV מפעיל את האי T3SS המקודד לסלמונלה פתוגניות 2 (SPI-2) ומעביר מטח של 20 חלבוני השפעה או יותר על פני הממברנה החללית לתוך הציטוזול המארח 5,6,7,8. בתוך הפונדקאי, קוקטיילים מורכבים אלה של חלבוני אפקט מתמרנים באופן מתאם את מסלולי האיתות של תאי המארח, וכתוצאה מכך נוצרים מבנים צינוריים דינמיים ומורכבים ביותר המשתרעים מה- SCV לאורך מיקרוטובולים, המכונים חוטים המושרים על ידי סלמונלה (SIFs), המאפשרים לסלמונלה לשרוד ולשכפל בתוך תאי המאכסן 9,10,11.

שיטות לדמיין, לעקוב ולנטר לוקליזציה של גורמים חיידקיים, ולבחון את הסחר והאינטראקציות שלהם בתוך תאים מארחים, מספקות תובנה קריטית לגבי המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה החיידקית. תיוג ולוקליזציה של חלבוני אפקט T3SS המופרשים בסלמונלה בתוך תאי המאכסן הוכיחו את עצמם כאתגר טכנולוגי^12,13; עם זאת, התפתחותם של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית שינתה את יכולתנו לחקור ולדמיין חלבונים בתוך מערכות חיות. עם זאת, גודלם של חלבונים פלואורסצנטיים (~25-30 kDa)15 דומה לעתים קרובות או אפילו גדול מזה של החלבון המעניין (POI; למשל, ^13.65 kDa עבור SsaP, 37.4 kDa עבור SifA). למעשה, סימון חלבון פלואורסצנטי של אפקטורים חוסם לעתים קרובות את הפרשת האפקט המסומן ותוקע את T3SS¹⁴.

יתר על כן, חלבונים פלואורסצנטיים הם פחות יציבים ופולטים מספר נמוך של פוטונים לפני הלבנה, מה שמגביל את השימוש בהם בטכניקות מיקרוסקופיות ברזולוציה סופר 16,17,18^, במיוחד במיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבציה (PALM), STORM ומיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED). בעוד התכונות הפוטופיזיקליות של צבעים פלואורסצנטיים אורגניים עדיפות על אלה של חלבונים פלואורסצנטיים, שיטות/טכניקות כגון CLIP/SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 ו-HA-Tags ^24,25 דורשות תוספת חלבון או נספח פפטידי שעלול לפגוע במבנה-תפקוד של חלבון המשפיע המעניין על ידי הפרעה לשינוי או סחר לאחר תרגום. שיטה חלופית הממזערת את שינוי החלבונים הדרוש כוללת שילוב של ncAAs לתוך POI במהלך תרגום באמצעות GCE. ncAAs הם פלואורסצנטיים או ניתן להפוך פלואורסצנטי באמצעות כימיה קליק 12,13,26,27,28.

באמצעות GCE, ncAAs עם קבוצות ביו-אורתוגונליות זעירות, פונקציונליות (כגון אזיד, ציקלופרופן או קבוצת ציקלואוקטיין) יכולות להיות מוצגות כמעט בכל מקום בחלבון המטרה. באסטרטגיה זו, קודון יליד מוחלף עם קודון נדיר כגון קודון עצירה ענברי (TAG) במיקום מוגדר בגן של POI. החלבון המהונדס מתבטא לאחר מכן בתאים לצד זוג אמינואציל-tRNA סינתאז/tRNA אורתוגונלי. האתר הפעיל tRNA synthetase מתוכנן לקבל רק ncAA מסוים אחד, אשר לאחר מכן מחובר באופן קוולנטי לקצה 3' של tRNA המזהה את קודון הענבר. ה-ncAA פשוט מוכנס למדיום הגידול, אבל הוא חייב להיקלט על ידי התא ולהגיע לציטוזול שבו האמינואציל-tRNA סינטטאז (aaRS) יכול לקשר אותו ל-tRNA האורתוגונלי; לאחר מכן הוא משולב בנקודת העניין במיקום שצוין (ראה איור 1)¹². לפיכך, GCE מאפשר שילוב ספציפי לאתר של שפע של קבוצות תגובתיות ביו-אורתוגונליות כגון קטון, אזיד, אלקין, ציקלואוקטיין, טרנסציקלוקטן, טטרזין, נורבונן, α, אמיד β בלתי רווי וביציקלו [6.1.0]-nonyne לתוך POI, ובכך עשוי להתגבר על המגבלות של שיטות סימון חלבונים קונבנציונליות 12,26,27,28.

מגמות חדשות בטכניקות הדמיה ברזולוציית על פתחו דרכים חדשות לחקור מבנים ביולוגיים ברמה המולקולרית. בפרט, STORM, טכניקה של מולקולה יחידה, מבוססת לוקליזציה, ברזולוציית על, הפכה לכלי רב ערך לדמיין מבנים תאיים עד ~20-30 ננומטר והוא מסוגל לחקור תהליכים ביולוגיים מולקולה אחת בכל פעם, ובכך לגלות את תפקידן של מולקולות תוך תאיות שעדיין אינן ידועות במחקרים מסורתיים ממוצעים¹³ . טכניקות של מולקולה בודדת וסופר-רזולוציה דורשות תג קטן עם פלואורופורים אורגניים בהירים הניתנים לצילום לקבלת הרזולוציה הטובה ביותר. לאחרונה הדגמנו כי GCE יכול לשמש לשילוב בדיקות מתאימות להדמיה ברזולוציית על¹².

שתיים מהבחירות הטובות ביותר לסימון חלבונים בתאים הן bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) ו-trans-cyclooctene-lysine (TCO; מוצג באיור 1), אשר עשוי להיות מקודד גנטית באמצעות גרסה של זוג tRNA/synthetase (כאן נקרא tRNA^Pyl/PylRS ^AF), כאשר Pyl מייצג pyrrolysine, ו-AF מייצג מוטציה כפולה מתוכננת באופן רציונלי (Y306A, Y384F) שמקורה ב-Methanosarcina mazei המקודד באופן טבעי פירוליזין¹²^, 29,30,31. באמצעות תגובת SPIEDAC (ראשי תיבות של Diels-Alder cycloaddition - Diels-Alder cycloaddition) המקודמת על ידי זן, חומצות אמינו אלה מגיבות באופן כימוסלקטי עם מצומדות טטרזין (איור 1)12,30,31. תגובות ציקלואידיות כאלה מהירות במיוחד ותואמות תאים חיים; הם עשויים גם להיות פלואורוגניים, אם פלואורופור מתאים הוא פונקציונלי עם tetrazine moiety^12,26,32. מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לניטור הדינמיקה של אפקטורים חיידקיים המועברים לתאים מארחים באמצעות GCE, ולאחר מכן לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות dSTORM. התוצאות מצביעות על כך ששילוב של ncAA באמצעות GCE, ואחריו תגובת קליק עם צבעים נושאי טטרזין פלואורוגניים, מייצג שיטה רב-תכליתית לתיוג סלקטיבי, הדמיה של חלבונים מופרשים ולאחר מכן לוקליזציה תת-תאית בפונדקאי. עם זאת, ניתן להתאים או להחליף את כל המרכיבים והנהלים המפורטים כאן, כך שניתן יהיה להתאים את מערכת GCE לחקר שאלות ביולוגיות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית פלסמיד

שכפל את הגן המבטא את נקודת העניין לפלסמיד ביטוי (לדוגמה, pET28a-sseJ 10TAG) המבטא את נקודת העניין ב- E. coli BL21 (DE3). צעד זה מאפשר לקבוע כי המוטנטים מתפקדים.
לצורך הדמיה של אפקטים המופרשים בסלמונלה בתאים מארחים, בנו פלסמיד ביטוי (pWSK29-sseJ-HA) המבטא את נקודת העניין SseJ תחת שליטת המקדם המקורי שלו, כפי שתואר בדוחות קודמים ^7,12,24. באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר, להחליף את הקודון של פנילאלנין-10 עם קודון ענבר (TAG) ב SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), הבטחת מוטיב AAT-TAG-ACT^33,34.
בנוסף לפלסמידים לעיל, לצורך שילוב גנטי של trans-cyclooct-2-en-L-lysine (TCO*A) לתוך POI, השתמש בביטוי נוסף plasmid (pEVOL-PylRS-AF)³¹ המכיל את צמד tRNA/synthetase המפותח (tRNA^Pyl/PylRS ^AF ) גנים המקודדים בפלסמיד pEVOL.
הערה: תיאורים מפורטים של פרוטוקולי הפלסמיד והשיבוט מתוארים בדוח הקודם^30,31.
השתמש בערכות להכנת פלסמיד זמינות מסחרית כדי להשיג DNA פלסמיד באיכות גבוהה. עבור DNA מטוהר, היחס האופטימלי של 260/280 הוא ~ 1.8. בדוק את טוהר ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%, במידת הצורך.

2. הכנת תרבית חיידקים

השגת טרנספורמנטים כפולים כדי לבדוק שהמוטציה מתפקדת באי-קולי
1. קח תאים מוכשרים BL21 מתוך -80 ° C והפשיר על קרח במשך כ 20-30 דקות.
2. יש לערבב 1-5 μL של כל פלסמיד (~50 ng של pEVOL-PylRS-AF ו-pET28a-sseJ 10TAG) עם 200 μL של תאי BL21 בעלי כשירות כימית בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מערבבים את התאים המוסמכים ואת תערובת פלסמיד בעדינות; יש לדגור במשך 30 דקות על קרח.
3. הלם חום את צינור המיקרוצנטריפוגה באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. מחזירים את הצינורות לקרח למשך 2 דקות.
4. הוסף 1 מ"ל של מדיום LB חם לצינור מיקרוצנטריפוגה במהירות להעביר את התערובת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C בשייקר במהירות 250 סל"ד למשך שעה אחת. צלחת חלק או את כל התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר LB המכילות אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור את הצלחות לילה ב 37 °C (77 °F).
  הערה: בפרוטוקול זה, 35 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול וקנמיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל שימשו לבחירת pEVOL-PylRS-AF ו-pET28a-sseJ 10TAG, בהתאמה. בשלב הטרנספורמציה, הערך את השינוי המוצלח באמצעות בקרות שליליות וחיוביות.
העברת המוטציה לסלמונלה לצורך הדמיה של אפקטורים המופרשים בסלמונלה בתאים מארחים:
1. הוסף 2-3 μL כל אחד של pEVOL-PylRS-AF ו- pWSK29-sseJ 10TAG ל- 40-60 μL של זן סלמונלה טיפימוריום 14028s בצינור מיקרוצנטריפוגה צונן. מערבבים את התערובת בעדינות עם פיפטה.
2. מעבירים את תערובת האלקטרופורציה לקובט צונן (מרווח אלקטרודות של 0.2 ס"מ); הגדר את הגדרות אלקטרופורציה ל 2.5 קילו וולט, 200 Ω, 25 מיקרופרנהייט. מניחים את הקובט בתוך תא האלקטרופורציה. ודא כי אלקטרודת התא עושה מגע חזק עם cuvette micro pulser.
3. לחצו לחיצה ממושכת על כפתור הדופק עד שהוא יצפצף.
4. מיד להוסיף 1 מ"ל של בינוני LB חם לתוך cuvette. מעבירים את כל התוכן לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. לדגור על התאים ב 37 ° C עם רעד ב 250 סל"ד במשך 1 שעות.
5. צלחת חלק או את כל תערובת אלקטרופורציה של סלמונלה על צלחת אגר LB המכילה אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור את הצלחות לילה ב 37 °C (77 °F).
  הערה: בפרוטוקול זה, 35μg/mL chloramphenicol ו- 100 μg/mL ampicillin שימשו לבחירת pEVOL-PylRS-AFו- pWSK29-sseJ 10TAG, בהתאמה.
הכנת תרבות
1. יש לחסן מושבה אחת של סלמונלה או אי קולי ב-5 מ"ל של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. יש לגדול לילה ב-37°C, לרעוד ב-250 סל"ד.

3. ביטוי ותיוג פלואורסצנטי של חלבונים נושאי ncAA

ביטוי חלבונים נושאי ncAA באי-קולי
1. מעבירים 100 מיקרוליטר של תרבית ראשונית ל-5 מ"ל של LB בינוני (דילול 1:50) המכיל 35 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול וקנמיצין 50 מק"ג/מ"ל, ולאחר מכן דגירה ב-37°C עם טלטול ב-250 סל"ד עד OD₆₀₀ מגיע ל-0.4–0.6.
2. הכן 1 mM TCO*A פתרון מלאי (10 מ"ל; טבלה 1).
3. כאשר התרביות מגיעות ל-OD₆₀₀ = 0.4-0.6, החלף את מדיית ה-LB ב-LB טרי המכיל 1 mM TCO*A, 35 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול ו-50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין.
  הערה: לחלופין, ניתן להכין פתרון TCO*A Stock כמתואר בשלב 5.4.2.
4. יש להשרות ביטוי חלבון בנוכחות 1 mM IPTG, 0.2% ארבינוז ולנער במשך הלילה ב-34°C, 250 סל"ד. קצרו את תאי החיידקים באמצעות צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 11,000 × גרם. מוציאים את הסופרנאטנט ומקפיאים את הגלולה בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף.
5. עבור ניסוי בקרה, חזור על אותו ניסוי אך בטא את החלבונים נושאי ncAA בהיעדר ncAA. עבור תיוג פלואורסצנטי במבחנה של חלבונים נושאי ncAA ב- E. coli, בצע את ההליך המפורט המתואר בשלב 3.3.
ביטוי חלבונים נושאי ncAA בסלמונלה
1. מעבירים 100 מיקרוליטר של תרבית ראשונית ל-5 מ"ל של LB בינוני (דילול 1:50) המכיל 35 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול ו-100 מק"ג/מ"ל אמפיצילין, ולאחר מכן דגירה ב-37°C עם טלטול ב-250 סל"ד עד OD₆₀₀ מגיע ל-0.6.
2. הכן מדיום N-מינימלי שונה (MgM, pH 5.6) כמתואר בטבלה 1.
3. החלף את מדיום LB בתווך N-מינימלי שונה (MgM) בתוספת 1 mM TCO*A (טבלה 1). לגדל את החיידקים ב 34 ° C במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף 0.2% arabinose, 25 מ"ג / מ"ל chloramphenicol, ו 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין, ולגדל את התאים במשך 6 שעות נוספות, רועד ב 250 סל"ד.
4. לאחר 6 שעות, שטפו את החיידקים 4x במרווח של 30 דקות, עם מדיה טרייה של MgM (pH 5.6) (טבלה 1) ללא ncAA. בשלבי הכביסה, יש להשתמש ב-972 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
5. צנטריפוגו את החיידקים, השהו מחדש במאגר PBS 1x, ודגרו במשך שעה אחת ב -4 מעלות צלזיוס בחושך כדי להסיר עודפי ncAAs. לאחר שעה, צנטריפוגו את החיידקים בטמפרטורה של 3,000 × גרם, 4°C למשך 15 דקות ואחסנו לשימוש נוסף.
6. עבור ניסוי בקרה, חזור על אותו ניסוי על ידי ביטוי חלבונים נושאי ncAA בהיעדר ncAA.
תיוג פלואורסצנטי במבחנה של חלבונים נושאי ncAA בסלמונלה טיפימוריום
1. השהיה מחדש של תאי סלמונלה המבטאים SseJ-F10TCO-HA בהיעדר או נוכחות של TCO*A (משלב 3.2) ב-1x PBS. כוונן את OD₆₀₀ ל- 4 ב- PBS. לדגור על התאים עם 20 מיקרומטר Janelia Fluor 646-tetrazine (JF646-Tz) או 20 μM BDP-Fl-tetrazine (5 mM תמיסות מלאי DMSO) ב 37 ° C בחושך ולנער במשך 1-2 שעות ב 250 סל"ד.
2. יש לשטוף את התאים 3-4x עם PBS המכיל 5% DMSO ו-0.2% F-127 פלורוני, להשהות מחדש ב-PBS המכיל 5% DMSO, ולדגור למשך הלילה ב-4°C בחושך. שטפו שוב פעמיים עם 1x PBS. בשלבי הכביסה, יש להשתמש ב-972 × גרם, למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. דמיינו את התאים מיד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או קבעו אותם עם 1.5% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
4. שטפו את התאים הקבועים 2x עם PBS ולבסוף ב 50 mM NH₄Cl ב PBS במשך 15 דקות כדי להסיר עודף PFA. השהה מחדש את התאים ב- PBS ואחסן ב- 4 ° C למשך לא יותר מ 3-4 ימים. דמיינו את החיידקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כמתואר בסעיף 6.

4. אפיון ביוכימי של חלבונים נושאי ncAA

ליזה של תאים
1. השהה מחדש את התאים מסעיף 3.1 במאגר ליזיס (טבלה 1) ודגר בטמפרטורת החדר במשך יותר מ-30 דקות. מצננים את התערובת על קרח במשך 15 דקות.
  הערה: שמור על היחס בין מאגר הליזה למשקל התא ביחס של 1:10.
2. סוניק את התאים המרחפים מחדש בעודם על קרח. פולס במשך 30 שניות בהגדרה 7 לפחות 6x, במרווחים של דקה, באמצעות סוניק (ראה טבלת חומרים).
3. סובב את הליזט התא ב 20,500 × גרם, 4 ° C במשך 15 דקות (שמירה על 4 ° C הוא קריטי). מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי ומשליכים את הכדורית.
ניתוח SDS-PAGE
1. הכינו צבע טעינה 5x SDS (טבלה 1). הוסף 5 μL של מאגר טעינת ג'ל SDS ל- 13 μL של ליזט תאים. נטרל את החלבונים עם מאגר דגימה של נתרן דודציל סולפט (SDS) בצינור של 2 מ"ל ב-95°C למשך 10 דקות, צנטריפוגה את התערובת ב-2,000 × גרם למשך 50 שניות, והעמיסה על ג'ל פוליאקרילאמיד SDS 12%.
2. הרכיבו את קלטת הג'ל, הניחו אותה במנגנון אלקטרופורזה ג'ל וחברו את מכשיר האלקטרופורזה לספק כוח חשמלי. יוצקים את מאגר הריצה, טוענים את סמני המשקל המולקולרי ודגימות החלבון, ומפעילים את הג'ל במתח של 100 וולט, עד שהברומופנול מגיע לתחתית ג'ל הפתרון.
  הערה: התחל את הניתוח מיד, מכיוון שליזטים המאוחסנים ב -20 ° C נוטים לאבד איכות לאחר כל מחזור הקפאה-הפשרה.
3. מכתימים את הג'ל בכתם חלבון כחול Coomassie.

5. תיוג ביו-אורתוגונלי של אפקט סלמונלה מופרש SseJ-F10TCO-HA בתאי HeLa

תרבית ותחזוקת תאי HeLa בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ ו-95% לחות במדיום עיט מעובד (DMEM) בעל גלוקוז גבוה (4.5 גרם לליטר), בתוספת FBS של 10% (v/v) בנוסף לפניצילין-סטרפטומיצין (1x).
תרבית חיידקים יום אחד לפני ההדבקה. יש לחסן מושבה אחת של סלמונלה 14028 המכילה pEVOL-PylRS-AF ו-pWSK29-sseJ 10TAG ב-5 מ"ל של מרק LB סטנדרטי המכיל אנטיביוטיקה למשך הלילה ב-37°C, תוך טלטול ב-250 סל"ד.
זרע תאי HeLa 1 יום לפני ההדבקה. קח בקבוק תרבית רקמה (T-75) המכיל תאי HeLa ב ~ 80% מפגש, כפי שנקבע על ידי בדיקה מיקרוסקופית של צפיפות התא. לשטוף את התאים עם PBS חם. נתק את התאים עם 3 מ"ל חם 0.25% טריפסין/EDTA למשך 5 דקות ב-37°C, 5% CO₂.
1. להרוות את טריפסין באמצעות 2 מ"ל של DMEM (+ 10% FBS). להעביר את כל התוכן של הבקבוק לתוך צינור 15 מ"ל לאחר השעיה מחדש של התאים. סובבו את התאים במהירות של 1,000 × למשך 5 דקות. הוציאו את הסופרנאטנט מהשפופר. יש להשהות מחדש את כדורית תאי HeLa במצע גידול שחומם מראש.
2. השתמש בהמוציטומטר כדי לבחון את התרחיף ולספור את התאים הנוכחים. הכינו מלאי תאים מדולל ב 1 × 10⁵תאים / מ"ל. זרע 0.5 × 10⁵ תאי HeLa לכל באר ב 500 μL של DMEM + 10% FBS מדיום צמיחה בשקופית תא שמונה בארות. שמור את תא החלקה באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂, 95% לחות במשך 24 שעות.
זיהום חיידקי
1. תת-תרבית סלמונלה 14028s המכילה pEVOL-PylRS-AF ו-pWSK29-sseJ 10TAG, על ידי דילול 100 מיקרוליטר של תרבית חיידקים בלילה (משלב 5.2) ל-3 מ"ל של LB בינוני (דילול 1:30) המכיל 35 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול ו-100 מק"ג/מ"ל אמפיצילין, ולאחר מכן דגירה ב-37°C עם טלטול ב-250 סל"ד למשך 5-7 שעות.
  הערה: במהלך שלב זה, התרביות מגיעות לשלב המעריכי המאוחר, והחיידקים פולשניים מאוד.
2. הכן 100 mM TCO*A פתרון מלאי ומדיה מלאה (טבלה 1).
3. כדי ליזום את זיהום תאי HeLa, הוציאו את תאי HeLa מהאינקובטור ושטפו את התאים עם DPBS שחומם מראש לפני הוספת 500 μL של DMEM טרי (+10% FBS) לכל באר. הניחו את החלקת התא בחזרה באינקובטור_{CO 2} עד לתחילת הזיהום.
4. לאחר 5-7 שעות של דגירה, לדלל את תרבית הסלמונלה ל OD₆₀₀ = 0.2 ב 1 מ"ל של מדיום גידול DMEM (~ 3 × 10⁸ cfu/mL). הוסף את הכמויות הדרושות של חיסון הסלמונלה בכל באר של שקופית התא כך שריבוי הזיהום (MOI) הוא 100.
5. לדגור על התאים הנגועים באינקובטור CO₂ למשך 30 דקות. שטפו את התאים 3x עם DPBS שחומם מראש כדי להסיר סלמונלה חוץ-תאית. הגדר נקודת זמן זו ל- 0 שעות לאחר ההדבקה. הוסף 500 μL של מדיום שלם (טבלה 1) המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין למשך שעה אחת. לאחר 1 שעה, לשטוף את התאים 3x עם DPBS. הוסף 500 μL של המדיום השלם (משלב 5.4.2; טבלה 1) בתוספת 0.2% ארבינוז, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין לכל באר של שקופית התא.
6. בניסוי ביקורת, בצע זיהומים דומים של תאי HeLa ללא TCO*A.
7. לדגור על שקופית התא במשך 10 שעות באינקובטור CO₂ .
לחץ על תיוג מבוסס כימיה בתאים חיים
1. המשך לתייג את התאים הנגועים בחיידקים. חממו מראש את המדיום המלא ללא TCO*A (טבלה 1).
2. לאחר 10 שעות לאחר ההדבקה, החלף את המדיום המלא בתווך שלם טרי ללא TCO*A ושטוף את תאי HeLa 4x במרווח של 30 דקות כל אחד עם DPBS שחומם מראש, ולאחר מכן מדיום שלם טרי (ללא TCO*A).
3. הכן תמיסת מלאי dye-tetrazine 0.5 mM ב- DMSO.
  הערה: לתיוג משפיעי סלמונלה המופרשים בתאי המאכסן, מוצגים שני פרוטוקולים. עבור פרוטוקול 1, הכינו את תערובת הצבע על ידי דילול מלאי JF646-Tz ב-1x PBS המכיל 1% קזאין נתרן מלח מחלב בקר, כך שתמיסת העבודה הסופית היא 2 מיקרומטר. לפרוטוקול 2, הכינו מדיום מלא וחם (ללא FBS ו-TCO*A) והוסיפו 2μM JF646-Tz. הפכו את תערובת הצבע לטרייה עבור כל סבב תיוג. עבדו בחושך במידת האפשר (עמעמו את האורות במכסה המנוע ו/או בחדר).
4. לאחר 12 שעות לאחר ההדבקה, לשאוף את התווך מן התאים. שטפו את התא עם DPBS שחומם מראש 2x או 3x. בקבוצה אחת של בארות, הוסף 500 μL של תערובת תמיסת הצבע המתוארת בפרוטוקול 1, ובקבוצה אחרת של בארות של אותה שקופית תא, הוסף 500 μL של תערובת תמיסת הצבע המתוארת בפרוטוקול 2 המוזכר בשלב 5.5.3 ואת ההערה שאחריו. הניחו את החלקת התא בחזרה לתוך אינקובטור CO 2 למשך 1.5-2 שעות.
5. לאחר 13.5-14 שעות לאחר ההדבקה, שטפו את תאי HeLa 2x עם DPBS שחומם מראש. הוסף 500 μL של DMEM טרי (בתוספת FBS). הניחו את המגלשה התאית בחזרה באינקובטור למשך 30 דקות. שטפו את התאים עם DPBS שחומם מראש ואחריו DMEM טרי 4x על פני מרווח של 30 דקות.
6. ב 16 שעות לאחר ההדבקה, לתקן את תאי HeLa עם PFA על ידי הוספת 200 μL של 4% PFA בכל באר ודגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. יש לשאוף מה-PFA, לשטוף 3x עם PBS ולאחסן את התאים ב-PBS בטמפרטורה של 4°C בחושך.
  הערה: PFA הוא כימיקל רעיל ביותר. יש להימנע משאיפה, כמו גם ממגע עור ועין. יש ללבוש ציוד מגן בעת הטיפול. כדי למנוע מהדגימה המסומנת להיחשף לאור, כבו את האור במכסה המנוע של תרבית התא.
Immunostaining של חלבונים המתויגים HA
1. יש לשאוף מה-PBS ולשטוף פעם אחת בתמיסת חסימה (טבלה 1).
2. דגרו על תאי HeLa קבועים עם תמיסת נוגדנים ראשונית מבוססת PBS (טבלה 1) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. השתמש בנוגדן ראשוני נגד HA של ארנב כדי להכתים SseJ המופרש (דילול 1:500).
3. לאחר שעה, שטפו בעדינות את התאים 2x עם 0.5 מ"ל של 0.1% Tween-20/1x PBS. במהלך השטיפות עם תמיסת Tween/PBS, יש לדגור על התאים 3x עם 0.5 מ"ל של 0.1% Tween20/1x PBS למשך 5 דקות.
4. לדלל נוגדן משני חמור נגד ארנב 555 1:500 בתמיסת נוגדנים משנית ולדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
5. לאחר שעה אחת, שטפו בעדינות את התאים 2x עם 0.5 מ"ל של 0.1% Tween-20/1x PBS ודגרו 2x עם 0.5 מ"ל של 0.1% Tween20/1x PBS למשך 5 דקות.
6. לשטוף את התאים 3x עם 0.5 מ"ל של 1x PBS ולאחסן אותם ב 4 ° C בחושך.
  הערה: תאים קבועים ניתן לאחסן במשך כמה שבועות PBS ב 4 ° C. Immunostaining צריך להתבצע ברגע האחרון.

6. הדמיה קונפוקלית

השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי, כגון דיסק מסתובב (SD) או מיקרוסקופ STED.
1. התאם את הגדרות רכישת התמונה, כגון מצב סריקה (XYZ), מהירות סריקה (400 הרץ), רזולוציה (512 x 512), הגדלה (100x) וערימת Z.
2. השתמש במסנני העירור/פליטה הנכונים עבור DAPI, BDP-Tz וטטרזין JF646.
  הערה: עבור פרוטוקול זה, הדמיה קונפוקלית בוצעה על מערכת מיקרוסקופ STED המצוידת בלייזר אור לבן פועם, המאפשר בחירה של עירור בטווח של 470-670 ננומטר ולייזר דיודה UV 405 ננומטר לעירור ב 405 ננומטר, 488 ננומטר, ו 647 ננומטר. טווחי הפליטה המתאימים הוגדרו באמצעות מפצל אלומה אקוסטית-אופטית מובנה בשילוב עם זיהוי ספקטרלי מבוסס מנסרה של המערכת הקונפוקלית בריבוי פסים.
3. השג את התמונות באמצעות מטרה של טבילת שמן 100×/1.4.

7. הדמיה ברזולוציית על (dSTORM)

הפעל את המיקרוסקופ 3 שעות לפני ההדמיה כדי לאפשר שיווי משקל תרמי (סביר יותר שסחף יתרחש אם ההדמיה מתחילה לפני כן). קררו את המצלמה לטמפרטורה של -70°C.
בינתיים, הכינו מאגר הדמיה חדש של GLOX-BME (טבלה 1).
הביאו את התאים למיקרוסקופ. הניחו את תא ההדמיה על במת המיקרוסקופ במחזיק הדגימה. במחזיק, ודא שהדגימה שטוחה ומאובטחת. שנה את התווך בבאר עם 0.4 מ"ל של חיץ הדמיה GLOX-BME טרי.
הגדר את קו הלייזר הנכון ואת ערכות הסינון. הפחת את עוצמת הלייזר ל~ 1 mW כדי לזהות תא HeLa מעניין. כוונן את מישור המוקד ואת זווית קרן הלייזר תוך הארת הדגימה בצפיפות לייזר נמוכה של 647 ננומטר (במקרה זה, מוצעת זווית משופעת תלולה [HILO], מכיוון ש- HILO מעלה את האות לרקע [SBR]). כוונן את זווית ההארה של HILO.
הערה: בפרוטוקול זה, הדמיה ברזולוציית על של SseJ נרכשה בערוץ Alexa Fluor 647 באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך (ראה טבלת חומרים), המצויד במטרה TIRF (יעד טבילת שמן 100x Apo TIRF, NA 1.49). פלואורסצנטיות זוהתה באמצעות מצלמת EMCCD, אשר נשלטה באמצעות μManager.
הגדר את רווח קדם-המגבר ל- 3 והפעל את העברת המסגרות ב- μManager. הגדר EM-gain ל - 200 לרגישות גבוהה יותר במדידות dSTORM, כפי שתואר בדוח קודם³⁵.
לפני הדמיה dSTORM, צלם תמונה מוגבלת עקיפה ייחוס של מבנה המטרה. העבר את הפלואורופורים למצב כהה על ידי הפעלת הלייזר לעוצמתו המרבית.
הערה: מולקולות בודדות ומהבהבות במהירות של פלואורופורים JF646 נצפו כאשר פלואורופורים JF646 השתנו למצב כהה בעיקר על ידי הארה רציפה של אור עירור 647 ננומטר, כפי שתואר קודם לכן³⁶.
התאימו את עוצמת הלייזר לרמה מתאימה בה מופרדים אירועי מצמוץ במרחב ובזמן, כוונו את זמן החשיפה ל-30 מילישניות והתחילו ברכישה. לרכוש 10,000-30,000 מסגרות.
הערה: יש לבצע שינויים בחוזק הלייזר כדי למטב את המצמוץ. שקול להגביר את עוצמת הלייזר אם זוהו אירועים רבים מדי (חלקיקים מהבהבים חופפים). האורך האידיאלי תלוי באיכות המדגם, אך ~ 10,000 מסגרות צריכות להציג תכונות ברורות.

8. שחזור תמונה של dSTORM

השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה.
הערה: ThunderSTORM, אחת מתוכניות רבות לשחזור תמונות בקוד פתוח הזמינות, מתוארת בקצרה להלן.
פתח את ImageJ וייבא את הנתונים הגולמיים. פתח את תוסף ThunderSTORM והגדר את הגדרת המצלמה המתאימה להתקן.
עבור אל הפעל ניתוח והגדר את ההגדרות המתאימות, כגון סינון תמונות (הפרש של מסננים ממוצעים), שיטות לוקליזציה (מקסימום מקומי) ולוקליזציה תת-פיקסלים של מולקולות (PSF גאוסיאנית משולבת). לחץ על אישור כדי להתחיל בשחזור תמונה.
הערה: במידת הצורך, הוראות מפורטות להגדרת הפרמטרים ב- ThunderSTORM כבר תוארו³⁷.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נייר פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת GCE לתיוג פלואורסצנטי ספציפי לאתר ולהדמיה של אפקטורים המופרשים מסלמונלה, כפי שמתואר באיור 1. המבנה הכימי של קבוצת ה-ncAA הנושאת טרנס-ציקלואוקטן ביו-אורתוגונלי (TCO) והצבע הפלואורסצנטי מוצגים באיור 1A. תיוג SseJ הושג על-ידי שילוב גנטי של ncAAs ביו-אורתוגונליים בקודון עצירה ענברי (ראו איור 1B) באמצעות זוגות אמינואציל-tRNA סינתטאז/tRNA אורתוגונליים באמצעות<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה המתוארת כאן שימשה למעקב אחר המיקום המדויק של חלבוני אפקט המוזרקים לתא המארח על ידי החיידק T3SS לאחר ההדבקה. T3SSs משמשים פתוגנים תוך תאיים כגון סלמונלה, שיגלה וירסיניה, כדי להעביר רכיבים אלימים לתוך הפונדקאי. הפיתוח של טכנולוגיות הדמיה ברזולוציית על איפשר לדמיין גורמי אלימות ברזולוציה בלתי נתפסת בעבר 12,13,24. עם זאת, אילוצי התוויה מסוימים מנעו חקירה מעמיקה יותר, מכיוון שאיחוי חלבונים פוטואקטיביי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות סטארט-אפ מהשלוחה הרפואית של אוניברסיטת טקסס, גלווסטון, טקסס, ופרס טקסס סטאר ל- L.J.K. אנו מודים לפרופ' אדוארד למקה (המעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית, היידלברג, גרמניה) על פלסמיד pEVOL-PylRS-AF. התמונות באיור 1 נוצרו באמצעות BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10x Tris/Glycine SDS מאגר ריצה	BIO-RAD	1610732
אמוניום כלוריד	פישר סיינטיפיק	A661-500
אמוניום סולפט	פישר סיינטיפיק	BP212R-1
אמפיצילין נתרן	סיגמא-אולדריץ'	A0166	5 גרם
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
ארבינוז	סיגמא-אולדריץ'	A3256	500 גרם
אוונטי J-26XP (צנטריפוגה בעלת ביצועים גבוהים)	בקמן קולטר
Bacto-Agar	BD Diagnostics, פרנקלין לייקס, ארה"ב	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (ארה"ב)	2.14E+02
β-מרקפטואתנול	Millipore	444203	250 מ"ל
ברומופנול כחול	סיגמא-אולדריץ	B8026
BSA	סיגמא-אולדריץ'	A4503	500 גרם
קזאין	סיגמא-אולדריץ'	C8654
קטלאז	סיגמא-אולדריץ'	C9322
כלורמפניקול	סיגמא-אולדריץ'	C1919
קליק חומצת אמינו / טרנס-ציקלוקט-2-en – L - ליזין (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	גודל: 500 מ"ג
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ ספקטרופוטומטר	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* משמש לשמירה על תאי HeLa
DMEM**	Gibco	11965-092	**משמש לזיהום חיידקי בנוכחות ncAA, ראה סעיף 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 גרם
חמור נגד ארנב Alexa fluoro555 נוגדן משני	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (מדיסון, ויסקונסין)
מצלמת EMCCD	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 מ"ל (PCR נקי)	Eppendorf, המבורג, גרמניה	30123.328
סרום בקר עוברי (FBS)	מסנני מזרק פישר	10082147
פישרברנד - סטרילי (PVDF 0.22 ומיקרו; m)	Fischer Scientific	97203	חבילה של 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 מ"ל
Gibco L-Glutamine (200 מ"מ), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
גלוקוז אוקסידאז	סיגמא-אולדריץ'	G7141-50KU
גליצרול	פישר Scientific	BF229-4
תאי HeLa	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 מ"ל
חומצה הידרוקלורית	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			עיבוד וניתוח תמונה: http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	כתם על בסיס קומאסי
איזופרופיל ובטא;-D-1-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 גרם
LB Broth	BD Difco	244620	500 גרם
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μ מנהל (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 גרם
מיקרו פולסר	קובטה BIO-RAD	165-2086	0.2 ס"מ פער אלקטרודות של 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask צלוחיות תרבית תאים	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 גרם
Paraformaldehhyde (PFA)	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 מ"ל
pEVOL-PylRS-AF			לבניית פלסמיד ומפה ראה הפניות הבאות 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
ערכת מיני הכנה של פלסמיד	Qiagen	27106
פלסמיד pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
פלסמיד pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789. מפה וקטורית של PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	דרגת חלבון, תמיסה 10%
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Fischer	Scientific P285-500
אשלגן גופרתי	Acros
מעכב פרוטאז סט קוקטיילים I - Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
נוגדן ראשוני נגד HA ארנב	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
נתרן דודציל סולפט (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
נתרן הידרוקסיד	פישר סיינטיפיק	SS255-1
נתרן פירובט (100 מ"מ), 100x	Corning	25-060-C1	100 מ"ל
Sonic Dismembrator דגם 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (מערכת Leica TCS SP8 STED 3X)	Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	ג'ן-דיפו	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 מ"ל
שקופיות תא תרבית רקמות X-well	SARSTEDT	94.6190.802

' אורגני 424220250

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116(2015).
Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311(2019).
Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335(2017).
Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789(2021).
Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050(2020).
Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12(2005).
Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292(2000).
Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811(2020).
Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715(2021).
Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261(2019).
Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

3 dSTORM Salmonella

הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים