טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון מבוססת ציטומטריה של זרימה בתפוקה גבוהה לזיהוי תרופות במולקולות קטנות המעכבות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים.

Abstract

פרוטוקול זה נועד לבסס שיטה לזיהוי אנטגוניסטים מולקולריים קטנים של הפעלת אינטגרין β2, תוך שימוש בנוגדנים המדווחים על שינויים קונפורמטיביים וציטומטריית זרימה בתפוקה גבוהה. השיטה יכולה לשמש גם כמדריך לשיטות סינון אחרות מבוססות נוגדנים בתפוקה גבוהה. אינטגרינים β2 הם מולקולות הידבקות ספציפיות לויקוציטים החיוניות לתגובות חיסוניות. נויטרופילים מסתמכים על הפעלת אינטגרין כדי לצאת מזרם הדם, לא רק כדי להילחם בזיהומים אלא גם כדי להיות מעורבים במחלות דלקתיות מרובות. שליטה בהפעלת אינטגרין β2 מציגה גישה בת קיימא לטיפול במחלות דלקתיות הקשורות לנויטרופילים. בפרוטוקול זה, נוגדן חד-שבטי, mAb24, אשר נקשר באופן ספציפי לכיסוי הראש בעל הזיקה הגבוהה של אינטגרינים β2, משמש לכימות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים ראשוניים מבודדים. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) משמש כגירוי להפעלת אינטגרינים β2 נויטרופילים. במחקר זה נעשה שימוש בציטומטר זרימה בתפוקה גבוהה המסוגל להריץ באופן אוטומטי דגימות לוחות של 384 בארות. ההשפעות של 320 כימיקלים על עיכוב אינטגרין β2 מוערכות תוך 3 שעות. באמצעות גישה זו ניתן לזהות מולקולות התוקפות ישירות לאינטגרינים β2 או מולקולות מטרה במסלול איתות ההפעלה מבפנים החוצה המופעל על ידי קולטן G המצומד לחלבון.

Introduction

מחלות דלקתיות רבות מאופיינות בחדירת נויטרופילים באתר של נפיחות או פציעה¹. כדי לחדור לרקמות אלה, נויטרופילים חייבים להשלים את מפל גיוס הנויטרופילים, הכולל מעצר לאנדותל, אקסטרווזיה על פני דופן כלי הדם, וגיוס לרקמה². נויטרופילים במחזור הדם זקוקים להפעלת אינטגרין β2 כדי להשלים מפל זה, במיוחד עבור שלב המעצר. לפיכך, תרופות מעכבות אינטגרין המפחיתות הידבקות נויטרופילים, אקסטרווציה וגיוס עשויות לטפל ביעילות במחלות דלקתיות ^3,4.

אינטגרינים β2 היו יעד למחלות דלקתיות בעבר. Efalizumab, נוגדן חד שבטי המכוון ישירות לאינטגרין αLβ2, פותח לטיפול בפסוריאזיס⁵. עם זאת, efalizumab נסוג בשל תופעת הלוואי הקטלנית שלה - leukoencephalopathy multifocal מתקדם כתוצאה הפעלה מחדש של וירוס JC ^6,7. טיפולים חדשים מבוססי אינטגרין אנטי דלקתיים צריכים לשקול שמירה על הפונקציות נוגדות הזיהום של לויקוציטים כדי למזער את תופעות הלוואי. תופעות הלוואי של efalizumab עשויות לנבוע ממחזור ממושך של נוגדנים חד שבטיים בזרם הדם, אשר עלול לעכב את תפקוד החיסון בטווח הארוך⁸. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי efalizumab מתווך αLβ2 crosslinking ואת הפנמה לא רצויה של אינטגרינים α4, מתן הסבר חלופי לתופעות הלוואי⁹. לכן, אנטגוניסטים קצרי מועד, מולקולות קטנות, עשויים להימנע מבעיה זו.

שיטה בעלת תפוקה גבוהה לסינון אנטגוניסטים אינטגרין של מולקולות קטנות β2 באמצעות נויטרופילים אנושיים מוצגת כאן. הפעלת אינטגרין β2 דורשת שינויים קונפורמטיביים של אקטודומיין האינטגרין כדי לקבל גישה ולהגדיל את זיקתו לליגנד שלו. במודל Switchblade הקנוני, אקטודומיין האינטגרין הסגור המכופף מתרחב תחילה לקונפורמציה מורחבת-סגורה ולאחר מכן פותח את כיסוי ראשו לקונפורמציה מורחבת-פתוחה המופעלת במלואה^10,11,12,13. יש גם מסלול חלופי שמתחיל מהכפוף-סגור לכפוף-פתוח ומורחב-פתוח, בסופו של דבר 14,15,16,17,18,19. הנוגדן הספציפי לקונפורמציה mAb24 נקשר לאפיטופ בתחום דמוי β2-I האנושי כאשר כיסוי הראש של האקטודומיין פתוח^20,21,22,23.

כאן, mAb24-APC משמש כדי לקבוע אם אינטגרינים β2 מופעלים. כדי להפעיל נויטרופילים ואינטגרין, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), פפטיד כימוטקטי קצר שמקורו בחיידקים שיכול להפעיל נויטרופילים β2 integrins²⁴, משמש כגירוי בפרוטוקול זה. כאשר fMLP נקשר ל-Fpr1 על נויטרופילים, מופעלים מפלים איתות במורד הזרם המערבים חלבוני G, פוספוליפאז Cβ ופוספואינוסיטיד 3-קינאז γ. אירועי איתות אלה גורמים בסופו של דבר להפעלת אינטגרין דרך מסלול האיתות מבפנים החוצה^18,25. מלבד אנטגוניסטים של מולקולות קטנות שנקשרים ישירות לאינטגרינים β2 ומונעים שינויים קונפורמטיביים של הפעלת אינטגרין²⁶, תרכובות שיכולות לעכב רכיבים במסלול איתות ההפעלה של אינטגרין β2 מבפנים החוצה יזוהו גם בשיטה זו. ציטומטרים אוטומטיים של זרימה מאפשרים סינון בתפוקה גבוהה. זיהוי אנטגוניסטים חדשים עשוי לא רק להעמיק את הבנתנו בפיזיולוגיה של אינטגרין, אלא גם לספק תובנה תרגומית לטיפול אנטי-דלקתי מבוסס אינטגרין.

Protocol

דגימות דם מלא הופרינו התקבלו מתורמים אנושיים בריאים שעברו ביטול זיהוי לאחר קבלת הסכמה מדעת, כפי שאושרה על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UConn Health, בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. התקבלה הסכמה מדעת מכל התורמים. קריטריוני ההכללה/אי-הכללה במחקר זה פותחו בקפידה כדי להבטיח את התאמת המשתתפים ולמזער סיכונים פוטנציאליים. המשתתפים הזכאים היו בגילאי 18 עד 65, מכל מוצא אתני, דוברי אנגלית שוטפת ומסוגלים לספק הסכמה מדעת. המשתתפים שהוחרגו כללו את אלה שאינם מסוגלים לספק הסכמה מדעת לעצמם, כגון אלה הזקוקים לנציג מוסמך על פי חוק, אנשים מתחת לגיל 18 או מעל גיל 65, אנשים כלואים ונשים בהריון. בנוסף, המשתתפים היו צריכים להיות חופשיים משימוש בתרופות אנטי דלקתיות וממצבים דלקתיים. זיהומים נוכחיים או מצבים דלקתיים כרוניים או חריפים מתמשכים היו גם קריטריונים לאי-הכללה. לבסוף, אנשים עם היסטוריה נוכחית או אחרונה של הידבקות ב- COVID-19 לא היו זכאים למחקר. קריטריונים אלה נועדו להבטיח את בטיחות המשתתפים והתאמתם תוך מזעור גורמים מבלבלים פוטנציאליים שיכולים להשפיע על תוצאות המחקר.

1. הכנת ריאגנטים

1. תווך נויטרופילים: הכינו את מדיום הנויטרופילים על ידי הוספת אלבומין בסרום אנושי 2% ל-RPMI-1640 ללא אדום פנול (ראו טבלת חומרים).
2. תמיסת fMLP: הכינו את תמיסת fMLP על ידי דילול שלה פי 100 מתמיסת האחסון fMLP dimethyl sulfoxide (DMSO) של 10 mM (ראו טבלת חומרים) עם RPMI 1640 ללא פנול אדום, והתוצאה היא תמיסת fMLP של 100 מיקרומטר.
3. תמיסת נוגדנים: לדלל 120 μL של נוגדן חד-שבטי מצומד אלופיקוציאנין (APC) mAb24 (mAb24-APC) (ראה טבלת חומרים), המדווח על קונפורמציה בעלת זיקה גבוהה של אינטגרין β2, ב-10 מ"ל של תווך נויטרופילים, ויוצר תמיסת mAb24-APC של 1.2 מיקרוגרם/מ"ל.
4. ספרייה מורכבת: לדלל את ספריית התרכובות הראשונית בריכוז של 10 mM עד 1 mM על ידי הוספת 5 μL של ספריית 10 mM (ראה טבלת חומרים) ל 45 μL של DMSO בלוחות 384 בארות באמצעות המטפל בנוזל. לאחר מכן, העבר 5 μL לכל באר של ספריית המתחם 1 mM לצלחת ריקה של 384 בארות באמצעות המטפל בנוזל.
5. כפי שמודגם באיור 1, ארבע עמודות (1, 2, 23, 24) הכילו רק DMSO אך לא תרכובות, ושימשו כבקרות חיוביות ושליליות בסינון. לדלל עוד יותר כל באר על ידי הוספת 45 μL של RPMI-1640 ללא פנול אדום, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 100 מיקרומטר עבור כל התרכובות.

2. בידוד נויטרופילים מדם אנושי

1. באמצעות פיפטה סרולוגית, שכבה בזהירות של 4 מ"ל דם מעל 8 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל (איור 2A).
2. צנטריפוגה הדם ב 550 × גרם במשך 30-50 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. להאט את הרוטור בהדרגה (גורם האטה של 1).
   הערה: ההפרדה המוצלחת של נויטרופילים (פס 2 באיור 2B) מתאי דם אדומים עשויה להשתנות בין תורמים. עבור רוב התורמים, צנטריפוגה של 30 דקות מספיקה. אולם עבור תורמים מסוימים, ייתכן שיידרשו 10-30 דקות נוספות של צנטריפוגה אם ההפרדה לא תצליח (איור 2C).
3. בזהירות להסיר את הפלזמה (הנוזל הצהוב על גבי) ואת התאים mononuclear (הרצועה העכורה העליונה; רצועת PBMC באיור 2B) באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
4. אספו נויטרופילים מהרצועה העכורה התחתונה (רצועת נויטרופילים באיור 2B) ובערך 3-4 מ"ל מתחת לנוזל השקוף לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). מערבבים בעדינות את תרחיף הנויטרופילים על ידי הפיכתו 2-3 פעמים.
5. צנטריפוגה את המתלה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C, ולאחר מכן בזהירות להסיר את supernatant על ידי decanting.
6. השהה מחדש בעדינות את הגלולה עם 5 מ"ל של PBS וצנטריפוגה אותו ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C.
7. הסר את supernatant על ידי decanting, ובזהירות לחסל כל שאריות supernatant סביב הפה צינור על דופן הצינור באמצעות שאיבת ואקום. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום נויטרופילים.
8. ספור את מספרי התאים באמצעות המוציטומטר. בדרך כלל, 1 עד 4 × 10⁷ נויטרופילים התקבלו מ 8 מ"ל של דם אנושי.
   הערה: ייתכן שיש זיהום תאי דם אדומים בתרחיף נויטרופילים. תאי דם אדומים אינם משפיעים באופן משמעותי על רוב הבדיקות ויכולים למנוע הפעלת נויטרופילים / פריימינג²⁷. תאי דם אדומים צריכים להיות lysed לפני ספירה כדי לקבל ריכוז נויטרופילים מדויק. הוסף 10 μL של תרחיף התא ל 891 μL של מים deionized עבור 10-30 s כדי lyse את תאי הדם האדומים, ולאחר מכן להוסיף 99 μL של 10× PBS כדי לאזן את הלחץ האוסמוטי, מניעת ליזה של נויטרופילים.
9. התאם את צפיפות התא ל- 6.25 × 10⁵ תאים/מ"ל על ידי הוספת תווך נויטרופילים.

3. הכנת צלחת 384-באר

1. בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, שלב 1 מ"ל של תמיסת הנוגדנים (1.2 מיקרוגרם/מ"ל mAb24-APC) עם 0.2 מ"ל של תווך נויטרופילים כדי ליצור תמיסת 1 מיקרוגרם/מ"ל mAb24-APC. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטר של התערובת הזו לבארות הבקרה השליליות בצלחת של 384 בארות (הבארות הכחולות באיור 1).
2. בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ערבבו 9 מ"ל של תמיסת הנוגדנים עם 21.6 מיקרוליטר של תמיסת fMLP (100 מיקרומטר) ו-1.7784 מ"ל של תווך נויטרופיל כדי ליצור תמיסה המכילה 1 מיקרוגרם/מ"ל mAb24-APC ו-200 ננומטר fMLP. לאחר מכן, הוסיפו 25 μL של תערובת זו לבארות הבקרה והבדיקה החיוביות בלוח של 384 בארות (הבארות האדומות והכחולות באיור 1).
3. מעבירים 5 μL מתמיסות התרכובת של 100 מיקרומטר מלוח ספריית התרכובת לצלחת 384 בארות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
4. צנטריפוגה את הנוזל למשך דקה אחת ב 500 × גרם, בטמפרטורת החדר.
   הערה: לצלחות צנטריפוגות נדרשים רוטור דלי נדנדה ודלי צלחות.

4. טיפול בתאים

1. הוסף 20 μL של תרחיף נויטרופילים לכל באר באמצעות פיפטה 16 ערוצים (טווח 5-50 μL, עבור כל עמודה של צלחת 384 באר). מערבבים בעדינות 5-10 פעמים באמצעות הפיפטה, תוך שמירה על מרווח זמן קבוע בין כל פיפטה.
   הערה: הריכוזים הסופיים בבארות הם כדלקמן: נויטרופילים 2.5 × 10⁵ תאים/מ"ל (כל הבארות); mAb24-APC 0.5 מיקרוגרם/מ"ל (כל הבארות); fMLP 100 ננומטר (בארות בקרה ובדיקה חיוביות); תרכובות 10 מיקרומטר (בארות בדיקה).
2. דוגרים על הצלחת על שייקר ב-300 סל"ד, בטמפרטורת החדר (RT), למשך 10 דקות.
3. תקן את התאים על ידי הוספת 3 μL של 16% paraformaldehyde (PFA) לכל באר באמצעות פיפטה 16 ערוצים (ריכוז PFA סופי ~ 0.91%). לאחר מכן, לדגור על קרח במשך 10 דקות.
   הערה: מומלץ לשמור על מרווח זמן עקבי בין עמודות שונות בעת הוספת נויטרופילים ו- PFA. זה מבטיח שלנויטרופילים בכל באר יהיה אותו זמן דגירה עם fMLP ו-mAb24-APC.

5. ציטומטריית זרימה

1. הפעל את ציטומטר הזרימה (ראה טבלת חומרים) וודא שגם המחשב המחובר למכשיר מופעל.
2. ודא שמיכל נוזל הנדן מלא, ומיכל הפסולת ריק ומחובר כראוי למכשיר.
3. טען את צלחת 384 הקידוח על מעמיס הדגימה של ציטומטר הזרימה. ודא שבאר A1 של הצלחת מיושרת עם סימן A1 על המעמיס.
4. פתח את התוכנה וצור ניסוי חדש. בחר 384 היטב ובחר את fluorophores הרצוי. לאחר מכן, לחץ על הגדרת לוחית, גרור כדי לבחור את כל הבארות ולאחר מכן לחץ על מדגם. הפעל את המתג "תפוקה גבוהה" ובחר גבוה בחלונית התעריפים.
   1. בתיבת עוצמת הקול, הזן 50. בחר דוגמאות בעמודות אי-זוגיות ולאחר מכן הפעל את המתג "תסיסה". לבסוף, תן שם לדוגמאות בחלונית הימנית.
5. לחץ על מגרש ושער. לאחר מכן, לחץ על כפתור החל (שני חצים על עיגול מלא ירוק), ולאחר מכן, לחץ על כפתור ההפעלה (צורת משולש). המתן מספר שניות כדי לצפות בכמה תאים מהבאר הראשונה ולאחר מכן לחץ על כפתור ההשהיה .
   1. התאם את מתחי FSC ו- SSC כדי להבטיח הדמיה נכונה של תאים במגרש. לחץ על רכישה ולאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה (צורת משולש) כדי להתחיל את הבדיקה.
6. ציטומטר הזרימה ידגום ברצף ~ 50 μL של 1000-3000 נויטרופילים מכל באר. זה ייקח בערך 3 שעות כדי להשלים את כל צלחת 384-באר.
7. לאחר השלמת כל הדגימות, יצא את קבצי ה- .fcs לשלב הבא.

6. ניתוח נתונים

1. פתח את התוכנה לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה (ראה טבלת חומרים). בחר וגרור את התיקיה המכילה את כל קבצי ה- .fcs לחלון התוכנה ולאחר מכן שחרר כדי לייבא את הנתונים לתוכנה.
2. לחץ פעמיים על דגימה אחת, שער נויטרופילים בודדים המבוססים על FSC ו- SSC^28,29,30 בחלון המוקפץ^, כפי שמוצג באיור 3. בחר את השורות המגודרות וגרור אותן לתיקיה ולאחר מכן שחרר כדי להחיל את ה- gating על כל הדגימות בתיקיה זו.
3. חשב וייצא את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית של APC (MFI) של נויטרופילים מכל באר באמצעות פונקציית עורך הטבלאות של התוכנה. לחץ על הוסף עמודה תחת הכרטיסייה עריכה . בחר חציון בכרטיסייה סטטיסטיקה , בחר את הנויטרופילים של האוכלוסייה המגודרת ובחר APC כפרמטר. לחץ על בסדר לחצן.
4. חזור לכרטיסייה "עורך טבלה", בחר כל הדגימות בכרטיסייה "קבוצה" ולחץ על הלחצן צור טבלה . יופיע חלון חדש המציג את הטבלה שנוצרה. שמור אותו כקובץ טקסט, CSV או Excel.
5. פתח את הטבלה המיוצאת, חשב את הערך הממוצע וסטיית התקן של APC MFI עבור דגימות הבקרה החיוביות והשליליות (איור 4).
6. חשב את גורם Z (Z') של הלוח באמצעות המשוואה:
   Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μ_p - μ_n),
   כאשר σ p ו- σ n הן סטיות התקן של הפקדים החיוביים והשליליים, בהתאמה, ו- μ_p ו- μ_n הם אמצעי הבקרה החיובית והשלילית, בהתאמה³¹.
   הערה: גורם Z מציין את ההפרדה בין התפלגות הבקרה החיובית והשלילית. Z' של 0 פירושו שאין הפרדה, ואילו Z' של 0.5 מציין הפרדה שווה. כפי שהוזכר במחקר קודם³¹, Z' > 0.5 מצביע על בדיקה מצוינת לסינון מורכב. Z' בטווח של 0.5 עד 0 מקובל, אך הוא עשוי לזהות רק פגיעות חזקות בבדיקה, מה שידרוש אימות נוסף בבדיקות משניות.
7. חשבו על תרכובות כ"מכה" לסינון כאשר APC MFI של נויטרופילים שטופלו בתרכובות נמוך מפי שלושה מסטיית התקן של MFI הבקרה החיובית שהופחתה מ-MFI הבקרה החיובית (P = 0.0013, המיוצג על-ידי הקו המקווקו באיור 4).

Results

נתונים מבדיקת לוחות 384 בארות מייצגת (איור 4) גילו כי לבקרות שליליות היה MFI של mAb24-APC של 3236 ± 110, בעוד שלבקרות חיוביות היה MFI של mAb24-APC של 7588 ± 858. מקדם Z' עבור צלחת זו הוא בערך 0.33, שהוא בטווח מקובל³¹. עם זאת, Z' דורש אימות נוסף במבחני משנה.

כדי לנרמל את הנתונים, כל הערכים שונו כדי להקצות ערך מרבי של 1 לממוצע החיובי וערך מינימלי של 0 לממוצע השלילי. גורם Z' יעבור תיקוף קפדני יותר בבדיקות משניות. הסף עבור לוח זה נקבע על 0.41, מה שאומר שדגימות עם MFI יחסי נמוך מ-0.41 ייחשבו כפגיעות המעכבות הפעלת אינטגרין β2 המושרה על ידי fMLP בנויטרופילים אנושיים. לא זוהו פגיעות מלוחית זו.

כדי לאשר את יעילות הפרוטוקול, נעשה שימוש ב- Nexinhib20, המעכב הפעלת אינטגרין β2 על ידי אנטגוניזם של פונקציית Rac-1, ו- lifitegrast, הנוגד אינטגרין αLβ2 ישירות^32,33. עם זאת, זמני הדגירה הותאמו לשעה אחת עבור Nexinhib20 וחצי שעה עבור lifitegrast. הנתונים שהתקבלו מניסויים אלה נורמלו באמצעות אותה שיטת קנה מידה שתוארה לעיל. נקודות הנתונים האלה שולבו עם תוצאות הלוחות ונותחו באופן קולקטיבי (איור 4).

איור 1: פריסת לוחות לסינון מורכב. תרשים סכמטי הממחיש את סידור תרכובות הסינון והבקרות בלוח 384 בארות. בארות בקרה שלילית מסומנות בכחול (עמודות 1 ו-23), ובארות בקרה חיובית מוצגות באדום (עמודות 2 ו-24). בארות הבדיקה מיוצגות בצבע בז' (עמודות 3 עד 22). חצים מציינים את הרצף לקריאת הלוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הפרדת נויטרופילים באמצעות מדיום שיפוע צפיפות. תמונות מייצגות המדגימות הפרדה מוצלחת ולא מוצלחת של נויטרופילים באמצעות מדיום שיפוע צפיפות. (A) בתחילה, 4 מ"ל דם מרובדים על 8 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות. (B) לאחר צנטריפוגה, שני פסים עכורים צריכים להיות גלויים: הרצועה העליונה המכילה בעיקר תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) והרצועה התחתונה המכילה בעיקר נויטרופילים עם כמה תאי דם אדומים (RBCs). רוב RBCs הם pelleted בתחתית. (C) הפרדה לא מוצלחת שבה RBCs אינם כדורים, ורצועת הנויטרופילים אינה נצפית. תידרש צנטריפוגה נוספת (10-30 דקות) כדי להפריד את רצועת הנויטרופילים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: גטינג של נויטרופילים באמצעות חלקות FSC/SSC. תרשימי פיזור קדמי מייצג (FSC) ופיזור צד (SSC) הממחישים את אסטרטגיית הגאטינג לזיהוי נויטרופילים. (A) נויטרופילים מגודרים בהתבסס על שטח הפיזור הקדמי (FSC-A) והפיזור הצידי (SSC-A) שנרשם על ידי ציטומטר הזרימה. (B) תאים בודדים מגודרים עוד יותר בהתבסס על הרוחב (FSC-W) והגובה (FSC-H) של הפיזור הקדמי, ו-(C) הרוחב (SSC-W) והגובה (SSC-H) של פיזור הצד. סקאלת הצבעים מייצגת את צפיפות התא, המשתנה מאדום לצהוב, ירוק וכחול ככל שהצפיפות פוחתת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תוצאות ההקרנה בצלחת מייצגת של 384 בארות. ההקרנה מתקבלת מצלחת מייצגת של 384 בארות, המדגימה מקדם Z של 0.3. בקרות שליליות וחיוביות מסומנות על ידי נקודות כחולות ואדומות, בהתאמה. דגימות בדיקה המטופלות בתרכובות שונות מיוצגות כנקודות בז '. הקו המקווקו מייצג את חיתוך עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI) לזיהוי פגיעות. אף אחת מהתרכובות שנבדקו לא זוהתה כאנטגוניסט אינטגרין β2, מכיוון שכל התרכובות שנבדקו הציגו ערכי MFI מעל קו החיתוך. תוצאות מניסויים עצמאיים שבדקו אנטגוניסטים ידועים של אינטגרין β2 עם זמני דגירה משתנים (Nexinhib20 למשך שעה אחת, lifitegrast במשך חצי שעה) מאוגדות להצגה באיור זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ההתחלה והסיום של גירוי נויטרופילים וצביעה נקבעים על ידי תוספת של נויטרופילים ו- PFA קיבוע. לכן, הבטחת מרווח זמן זהה בין צנרת נויטרופילים או PFA לתוך כל עמודה היא קריטית. זה מבטיח שהגירוי וזמן הצביעה של נויטרופילים מכל באר יישאר עקבי. בשל תוחלת החיים הקצרה של נויטרופילים, הניסוי כולו, החל מאיסוף דם מתורמים ועד להשלמת ציטומטריית זרימה, חייב להתבצע באותו היום. נויטרופילים רגישים מאוד לשינויי טמפרטורה ויכולים להיות מופעלים כאשר הם נחשפים לעליות טמפרטורה מהירות, כגון מעבר מ -4 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר או מטמפרטורת החדר ל -37 מעלות צלזיוס. בנוסף, בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו, הפעלת אינטגרין β2 נויטרופילים המושרה על-ידי fMLP אינה מתרחשת כאשר תאים מאוחסנים על קרח או בטמפרטורה של 4°C (הנתונים אינם מוצגים). לכן, לפני הקיבוע, דם שלם נויטרופילים צריך להישמר בטמפרטורת החדר או 20 ° C (במהלך שלב צנטריפוגה בידוד). אין להניח דם שלם ונויטרופילים על קרח.

הצביעה של mAb24 בבקרות שליליות אמורה להניב תוצאות נמוכות מאוד. אם נצפתה רמת צביעה גבוהה של mAb24 בניסוי, אנא בדוק את הדברים הבאים: (1) אם היה שינוי טמפרטורה משמעותי במהלך הניסוי לפני הקיבוע; (2) האם היה זיהום fMLP או אנדוטוקסין בתווך הנויטרופילים; (3) האם הטיפול בדגימות היה אגרסיבי מדי, כגון יצירת בועות במהלך פיפטציה וערבוב.

הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב- mAb24 כדי לדווח על פתיחת כיסוי הראש של אינטגרין β2. תיאורטית, KIM127, נוגדן חד-שבטי המדווח על הרחבה של אינטגרינים β2 34,35^, יכול לשמש בשילוב עם mAb24 כדי להעריך באופן מקיף קונפורמציה של β2 אינטגרין. עם זאת, יחס האות לרעש של צביעת KIM127 (פי 1.5 עד פי 2) אינו חיובי כמו זה של mAb24 (פי 5 עד פי 10), אשר בדרך כלל אינו מספק גורם Z' משביע רצון במבחן לוחות 384 בארות. בבדיקת צלחת 96 בארות, ניתן לשטוף דגימות לפני ביצוע ציטומטריית זרימה, תוך הפחתת אותות רקע מסיסים שמקורם בנוגדנים. לכן, ניתן לבצע את הבדיקה מבוססת KIM127 בבדיקת לוחות 96 בארות, שיש לה תפוקה נמוכה יותר בהשוואה לבדיקת לוחות 384 בארות.

מכיוון ששיטה זו משתמשת בעוצמה פלואורסצנטית כקריאה כדי להעריך את ההשפעה המעכבת אינטגרין של תרופות, תרופות פלואורסצנטיות מסוימות עלולות להפריע לתוצאות. בנוסף, נראה כי תרופות רעילות הגורמות למוות נויטרופילים בתוך תקופת הגירוי של 10 דקות ידווחו גם הן על עיכוב אינטגרין. תרופות המעכבות פירוק נויטרופילים ידכאו ביטוי כולל של אינטגרין β2. מעכבי דגרנולציה אלה יזוהו גם בבדיקה שלנו. לכן, יש צורך בסינון משני עם פקדים אחרים כדי לאשר את ההשפעות המעכבות של הלהיטים. מסכים משניים מוזכרים כאמצעי הן לאמת והן לקבוע את מנגנון הפעולה של להיטים. בנוסף לחזרה על בדיקות mAb24, ביטוי CD18 הכולל על פני התא יוערך באמצעות נוגדן CD18 אנטי אנושי pan. רמת אינטגרין β2 מופעל, כפי שנמדדה על ידי mAb24, תנורמל על ידי ביטוי CD18 הכולל. זה יאפשר לנו לקבוע אם מנגנון הפעולה של הסוכן כרוך באנטגוניזם הפעלת אינטגרין ו / או עיכוב הביטוי של CD18 על פני התא. יש לבצע בדיקת כדאיות גם במסך המשני כדי למנוע השפעות רעילות של הלהיטים.

לפרוטוקול זה יש מגבלות. ראשית, mAb24 מסוגל לזהות את התחום דמוי β2 I רק במקרים בהם האינטגרין נמצא במצב של זיקה גבוהה. לכן, הוא אינו יכול לזהות α/β אנטגוניסטים אלוסטריים דמויי I כגון lifitegrast באמצעות קשירת mAb24 פוחתת. Lifitegrast משרה יותר mAb24 מחייב³² ומראה ערך MFI מוגבר באופן חריג עם mAb24 (איור 4). עבור ערכים חריגים כאלה, ייתכן שיהיה צורך בבדיקות אחרות כדי לוודא אם פגיעות אלה הן α/β אנטגוניסטים אלוסטריים דמויי I כמו lifitegrast. שנית, גורם ה-Z לבדיקה זו אינו אופטימלי וניתן לשפר אותו באמצעות שימוש בפיפטינג ותסיסה אוטומטיים. למרבה הצער, במעבדה שלנו חסר הציוד הדרוש כדי לבחון השערה זו. שכפול או שכפול של בדיקות יועילו בזיהוי תוצאות חיוביות ושליליות שגויות במקרה שלא ניתן לשפר עוד יותר את גורם Z באמצעות השיטות לעיל. יתר על כן, זה עשוי להיות מועיל להאריך את זמן הדגירה כדי לזהות פגיעות נוספות, כפי שנצפה עם מעכב ההפעלה β2 אינטגרין הידוע Nexinhib20, אשר דורש שעה של דגירה כדי לייצר השפעות מעכבות. מחקר זה התמקד בזיהוי סוכנים מהירים. החוקרים צריכים לציין כי הם יכולים לשנות את זמן הדגירה כך שיתאים לצרכים הספציפיים שלהם.

למיטב ידיעתנו, זוהי שיטת הסינון הראשונה בתפוקה גבוהה עבור אנטגוניסטים של אינטגרין β2. גישה זו יכולה לשמש לזיהוי תרכובות מולקולות קטנות הנקשרות ישירות לאינטגרינים β2 ולמנוע שינויים קונפורמטיביים המובילים למצבי אינטגרין בינוניים/בעלי זיקה גבוהה, בדומה לאנטגוניסטים ללא תכונות "אגוניסטיות" שתוארו לאחרונה עבור אינטגרינים αIIbβ3 ו- α4β1²⁶. נויטרופילים הם קריטיים במחלות דלקתיות רבות, כגון פגיעה באיסכמיה של שריר הלב³⁶, אלח דם 37 ומחלות אוטואימוניות^38,39. תרופות במולקולות קטנות עשויות להציע גמישות רבה יותר בטיפול במחלות אלה בהשוואה לתרופות מבוססות נוגדנים. כניסות מהמסך שלנו יכולות לספק טיפולים פוטנציאליים למחלות דלקתיות.

השיטה הנוכחית היא מסך מבוסס נוגדנים פלואורסצנטיים, בתפוקה גבוהה. מכיוון שנוגדנים לכתב הפעלה זמינים גם עבור β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 ו- αL^{integrins 47,48,49,50,} ניתן להרחיב שיטה זו לזיהוי אנטגוניסטים לאינטגרינים אחרים. נוגדן רגיש קונפורמציה כמו HUTS-21, אשר נקשר לתחום ההיברידי β1 51,52,53, שימש במסך בתפוקה גבוהה כדי לזהות אנטגוניסטים אלוסטריים מאוחרים מאוד של אנטיגן-4 (VLA-4^, integrin α4β1)⁵⁴. ניתן גם לשנות ולהרחיב את שיטת הסינון הנוכחית כדי למצוא תרופות המעכבות או מקדמות ביטוי של קולטני פני שטח אחרים, כגון תרכובות המגבירות את ביטוי פני השטח של מווסת המוליכות הטרנסממברנלית של סיסטיק פיברוזיס (CFTR) על תאי סיסטיק פיברוזיס (CF). ב-CF, מוטציות מרובות מובילות לקיפול שגוי של CFTR, וכתוצאה מכך אין ביטוי של CFTR על קרום התא⁵⁵. תרופות בעלות מולקולות קטנות הוכחו כמחזירות את ביטוי CFTR⁵⁶. עבור שינויים בפרוטוקול, יש צורך להגדיל את זמן הדגירה של תרופות למספר שעות כדי לאפשר שינויים ביטוי חלבון להתרחש.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
פיפטות 16 ערוצים	Thermo	4661090N	מכשיר
384 בארות	צלחת גריינר		784201 חומרים
APC אנטי אנושי CD11a/CD18 (LFA-1) שיבוט נוגדנים: m24	BioLegend	363410	ריאגנטים
Bravo  פלטפורמה אוטומטית לטיפול בנוזלים	Agilent	16050-102	384 צנטריפוגה רב ערוצית
	Eppendorf	דגם 5810R	מכשיר
FlowJo	Becton, Dickinson & חברת	NA	Software
תמיסת אלבומין סרום אנושי (25%)	GeminiBio	800-120	ריאגנטים
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	ריאגנטים
Nexinhib20	Tocris	6089	ריאגנטים
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	ריאגנטים
פרפורמלדהיד 16% תמיסה	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי	15710	ריאגנטים
דליי צלחת	Eppendorf	UL155
שייקר צלחת אביזר	פישר	88-861-023	מכשיר
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (הקודם 1114683)	ריאגנטים
צלחות תרכובות ספרייה כימית של פרסטוויק (10 מ"מ)	ספריות כימיות של פרסטוויק	Ver19_384	1520 מולקולות קטנות, 98% תרופות מאושרות משווקות (אושרו על ידי ה-FDA, EMA, JAN וסוכנויות אחרות)
RPMI 1640 בינוני, ללא פנול אדום	Gibco	11-835-030	ריאגנטים
רוטור דלי נדנדה	Eppendorf	A-4-62	רוטור
ZE5 מנתח תאים	מעבדות Bio-Rad	דגם ZE5	מכשיר