תרבית חוץ גופית היא שיטת זיהוי ישירה לנוכחות חיידקים חיים. פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבית של מגוון סוגי Borrelia spirochetes, כולל אלה של Borrelia burgdorferi sensu lato complex, קדחת התקפית של מיני Borrelia ו- Borrelia miyamotoi. מינים אלה הם חסונים וגדלים לאט, אך ניתן לתרבית אותם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטות גידול של Spirochetes מ Borrelia burgdorferi Sensu Lato קומפלקס קדחת התקפית Borrelia
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הבורליה מורכבת משלוש קבוצות של מינים, אלה של קבוצת ליים בורליוזיס (LB), הידועה גם בשם B. burgdorferi sensu lato (s.l.) ולאחרונה סווגה מחדש לבורליאלה, קבוצת קדחת התקפית (RF) Borrelia, וקבוצה שלישית של ספירוצ'טים הקשורים לזוחלים. שיטות מבוססות תרבית נותרו תקן הזהב לזיהוי מעבדה של זיהומים חיידקיים הן למחקר והן לעבודה קלינית, שכן תרבית של פתוגנים מנוזלי גוף או רקמות מזהה ישירות פתוגנים משכפלים ומספקת חומר מקור למחקר. Borrelia ו- Borreliella spirochetes הם מהירים וגדלים לאט, ולכן אינם מתורבתים בדרך כלל למטרות קליניות; עם זאת, התרבות נחוצה למחקר. פרוטוקול זה מדגים את המתודולוגיה והמתכונים הדרושים לתרבית מוצלחת של ספירוצ'טות LB ו- RF, כולל כל המינים המוכרים מקומפלקס B. burgdorferi s.l. כולל B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis ו-B. miyamotoi. המדיום הבסיסי לגידול ספירוצ'טות LB ו- RF הוא מדיום ברבור-סטונר-קלי (BSK-II או BSK-H), התומך באופן אמין בצמיחת ספירוצ'טות בתרבויות מבוססות. כדי להיות מסוגל לגדל מבודד בורליה מבודד חדש מדגימות שמקורן בקרציות או פונדקאי שבהן מספר הספירוצ'ט הראשוני נמוך בחיסון, עדיף מדיום קלי-פטנקופר שונה (MKP). מדיום זה תומך גם בצמיחה של B. miyamotoi. ההצלחה של טיפוח של spirochetes RF תלוי גם באופן קריטי באיכות המרכיבים.
מבוא
בורליה (שם מדעי: Borrelia) הוא סוג של חיידק ספירוצ'טה הכולל שלושה סוגים עיקריים: קבוצת ליים בורליוזיס (LB), קבוצת קדחת התקפית (RF), וקבוצה פחות מאופיינת המוגבלת לכאורה לזוחלים. טקסונומיה של בורליה נמצאת בשטף עם הופעתן של מתודולוגיות מולקולריות המאפשרות השוואה בין גנום לפרוטאום, כפי שנכון לגבי רוב הקבוצות הטקסונומיות האחרות 1,2,3,4,5,6,7. קבוצת LB (המכונה גם קבוצת מחלת ליים) נקראת באופן מסורתי Borrelia burgdorferi sensu l....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקרים שכללו דגימות שהתקבלו מנבדקים אנושיים אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של האוניברסיטה ו / או המתקן הרפואי הרלוונטיים, והסכמה מדעת בכתב התקבלה מהמשתתפים לפני איסוף הדגימות. כל המחקרים שכללו דגימות שנלקחו מבעלי חיים אושרו ונערכו תחת הנחיות הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים. במידת הצורך, התקבלו אישורים לדיגום סביבתי.
הערה: הצלחת התרבות תלויה באופן קריטי באיכות המרכיבים. מדיום BSK מסחרי זמין ותומך בצמיחה של B. burgdorferi טהור מותאם מעבדה ומינים קרובים שבהם ניתן להשתמש בחיסון במינון גבוה כדי לזרוע את התרבית. עבור בידוד זנים מחומר ביולוגי ראשוני, מדיום טרי הוא מועדף ולעתים קרובות הכרחי.
Borrel....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מדיה תרבותית Borrelia BSK ו- MKP, וריאנטים, הם מדיה תרבותית עשירה עם מרכיבים שצריך להכין ולעקר ברצף. כאשר מכינים אותו נכון, מדיום BSK צריך להיות אדום-כתום ושקוף (איור 1). עכירות ומשקעים הנמשכים לאחר ההתחממות מצביעים על מרכיבים בעייתיים, ייצור בינוני או זיהום; מדיום כזה הוא הטוב ביותר לזרוק. אם מוסיפים ג'לטין ל- BSK ועם MKP, המדיום יהיה ג'לטיני בקירור; עם ההתחממות, הוא יהיה נוזלי, אם כי צמיג מעט.
צמיחתן של תרביות בורליה טהורות לא תשנה את עכירות המ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תרבית המעבדה של חיידקים היא קרש קפיצה למחקר. היתרון העמוק שמעניקה היכולת לתרבות בא לידי ביטוי במאבק, במשך יותר ממאה שנה שהגיע לשיאו רק לאחרונה בהצלחה, לתרבות Treponema pallidum, הספירוכטה שהיא הסוכן האטיולוגי של עגבת44. גם ספירוצ'טות בורליה מאתגרות את התרבות, אך התרבות אפשרית 23,24,34,44,45,46,47,48,49.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה והקרן הקנדית למחלות ליים (AB ו- VL), מועצת המחקר השבדית (SB, M-LF ו- IN), TAČR GAMA 2 פרויקט - "תמיכה באימות פוטנציאל יישום 2.0 במרכז הביולוגי CAS" (TP01010022) (MG ו- NR), ועל ידי מענק ממשרד הבריאות של הרפובליקה הצ'כית NV19-05-00191 (MG ו- NR). אנו מודים ל-S. Vranjes (2021, מעבדת Rudenko) עבור התמונה באיור 4 ול-J. Thomas-Ebbett (2021, מעבדת לויד) עבור התמונות באיור 5. אנו מודים לכל החוקרים שתרמו לתחום ומתנצלים בפני אלה שלא יכולנו לצטט את עבודתם בשל מגבלות מקום.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות 1.7 מ"ל | VWR | 87003-294 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 0.2 ומיקרו; m מסנן מזרק סטרילי | VWR | 28145-501 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 10 ומיקרו; L קצה פיפטה מחסום | נפטון | BT10XLS3 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 10 מ"ל פיפטות סרולוגיות | פריט סטנדרטי Celltreat | 229011B | - כל ספק יעשה |
| 1000 ומיקרו; קצה פיפטה מחסום L | נפטון | BT1000.96 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| צינור 15 מ"ל | Celltreat | 188261 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 20 ומיקרו; L קצה פיפטה מחסום | נפטון | BT20 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| מזרק סטרילי 20 מ"ל | BD | 309661 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 200 ומיקרו; L קצה פיפטה מחסום | נפטון | BT200 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 25 מ"ל צינורות תרבית כובע בורג | פישר סיינטיפיק | 14-933C | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות | Celltreat | 229025B | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 3 מ"ל מזרק סטרילי | BD | 309657 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| 35% BSA | סיגמא | A-7409 | מקור חשוב - ראה הערה |
| 5 מ"ל פיפטות סרולוגיות | פריט סטנדרטי Celltreat | 229006B | - כל ספק יעשה |
| צינור 50 מ"ל | Celltreat | 229421 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| צינורות זכוכית MKP 6.5 מ"ל | Schott | Schott Nr. 26 135 115 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| Amikacine | Sigma | PHR1654 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| Amphotericin B | Sigma | A9528-100MG | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| פריט סטנדרטי Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole | Sigma | PHR1126-1G | - כל ספק יעשה |
| מרק BBL Brucella | BD | 211088 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| קבינט בטיחות ביולוגית | Labconco | 302419100 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| צינורות איסוף דם (חלק עליון צהוב - ACD) | פישר סיינטיפיק | BD צינורות איסוף דם מזכוכית ואקוטיינר עם חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| BSK-H בינוני [עם סרום ארנב 6%] | Darlynn biologicals | BB83-500 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| צנטריפוגה | אפנדורף | דגם 5430 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| חומצת לימון TrisodiumSaltDihydrate | Sigma | C-8532 100 גרם | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| CMRL | Gibco BRL | 21540 500 מ"ל | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| CMRL-1066 | Gibco | 21-510-018 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| צינורות קריוגניים (Nalgene) | פישר Scientific | 5000-0020 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| פטרי עמוק עם טבעת ערימה 100 מ"מ ופעמים; 25 מ"מ | Sigma | P7741 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| חממה דיגיטלית | VWR | דגם 1545 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| מסננים לעיקור מסננים | Millipore 0.22μ m GPExpressPLUS ממברנה | SCGPU05RE | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| ג'לטין | Difco BD | 214340 500 גרם | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| צינורות תרבית זכוכית | פישר סיינטיפיק | 99449-20 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| גלוקוז | סיגמא | G-7021 1 ק"ג | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| גליצרול | סיגמא | G5516 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| Hemafuge (Hematocrit & צנטריפוגה המטולוגיה חיסונית ) | Labwissen | דגם 3220 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| HEPES | Sigma | H-3784 100 גרם | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| N-acetylglucoseamine | Sigma | A-3286 25 גרם | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| Neopeptone | Difco BD | 211681 500 גרם | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| נויבאואר המטוציטומטר | סיגמא | Z359629 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| מיקרוסקופ ניגודיות פאזה | לייץ | - כל ספק יעשה | |
| פריט סטנדרטי של פוספומיצין | סיגמא | P5396-1G | - כל ספק יעשה |
| פוספומיצין | סיגמא | P5396 | - כל ספק יעשה |
| Pipetboy | Integra | - כל ספק יעשה | |
| Precision Standard Balance | OHAUS | דגם TS200S | - כל פריט סטנדרטי הספק יעשה |
| חומצה פירובית (מלח Na) | Sigma | P-8574 25 גרם | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| סרום ארנב | גיבקו | 16-120-032 | המקור חשוב |
| סרום לארנבים | סיגמא | R-4505 100 מ"ל | מקור חשוב |
| Rifampicin | Sigma | R3501-1G | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| נתרן ביקרבונט | Sigma | S-5761 500 גרם | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| Sufametaxazole | סיגמא | PHR1126 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| TC Yeastolate | Difco BD | 255752 פריט סטנדרטי 100 גרם | - כל ספק יעשה |
| העברת פיפטות | VWR | 470225-044 | פריט סטנדרטי - כל ספק יעשה |
| Trimethoprim | Sigma | PHR1056 | - כל ספק יעשה |
מקורות
- Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
- Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
