במאמר זה נתאר את השיטה לביסוס מודל של תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח המבוסס על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי, אסטרוציטים ופריציטים. מודל רב-תאי זה מתאים למחקרים על תפקוד לקוי של יחידות נוירו-וסקולריות במהלך שבץ איסכמי במבחנה או לסינון מועמדים לתרופות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה
במאמר זה
סיכום
תקציר
שבץ איסכמי הוא גורם מרכזי למוות ולנכות ברחבי העולם עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. הנוירופתולוגיה של שבץ איסכמי מאופיינת על ידי הפרעה באספקת הדם למוח המובילה למוות תאי ותפקוד קוגניטיבי. במהלך ואחרי שבץ איסכמי, תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח (BBB) מקל על התקדמות הפציעה ותורם להחלמה לקויה של המטופל. המודלים הנוכחיים של BBB כוללים בעיקר מונוקולטורות אנדותל ותרביות כפולות עם אסטרוציטים או פריציטים.
מודלים כאלה חסרים את היכולת לחקות באופן מלא מיקרו-סביבה מוחית דינמית, החיונית לתקשורת בין תאים. בנוסף, מודלים נפוצים של BBB מכילים לעתים קרובות תאי אנדותל אנושיים מונצחים או תרביות תאים שמקורן בבעלי חיים (מכרסם, חזיר או בקר) המציבות מגבלות תרגום. מאמר זה מתאר מודל BBB חדשני המבוסס על הכנסה טובה המכיל רק תאים אנושיים ראשוניים (תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח, אסטרוציטים ופריסיטים של כלי דם במוח) המאפשרים לחקור פגיעה מוחית איסכמית במבחנה.
ההשפעות של מחסור בחמצן-גלוקוז (OGD) על שלמות המחסום הוערכו על ידי חדירות פסיבית, מדידות התנגדות חשמלית טרנסאנדותליאלית (TEER) והדמיה ישירה של תאים היפוקסיים. הפרוטוקול המוצג מציע יתרון מובהק בחיקוי הסביבה הבין-תאית של ה-BBB in vivo, ומשמש כמודל BBB מציאותי יותר במבחנה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות במסגרת פגיעה מוחית איסכמית.
מבוא
שבץ מוחי הוא אחד הגורמים המובילים למוות ולנכות ארוכת טווח ברחבי העולם1. שכיחות השבץ עולה במהירות עם הגיל, ומכפילה את עצמה כל 10 שנים לאחר גיל 552. שבץ איסכמי מתרחש כתוצאה מהפרעה בזרימת הדם במוח עקב אירועים טרומבוטיים ותסחיפיים, המקיפים יותר מ -80% מכלל מקרי השבץ3. גם כיום, קיימות אפשרויות טיפול מעטות יחסית למזעור מוות של רקמות בעקבות שבץ איסכמי. הטיפולים שכן קיימים הם תלויי זמן וכתוצאה מכך לא תמיד מובילים לתוצאות קליניות טובות. לכן, מחקר על מנגנונים תאיים מורכבים של שבץ איסכמי המשפיעים על התאוששות לאחר שבץ הוא נחוץ בדחיפות.
ה-BBB הוא ממשק דינמי להחלפת מולקולות בין הדם ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל התאים, החומרים, הציוד והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הגדרת מודל BBB של תרבית תאים משולשת
- זריעת פריציטים
- טפחו HBVP בבקבוקי תרבית T75 עם משטח פעיל להידבקות תאים בתוך אינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש. לאחר ההגעה למפגש, שאפו את מדיום הפריסיטים הישן ושטפו את התאים עם 5 מ"ל של תמיסת מלח חמה של דולבקו (DPBS). שאפו את ה- DPBS ונתקו את התאים מהבקבוקון באמצעות שילוב של 4 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA חמה ו-1 מ"ל של DPBS.
הערה: הימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ- P7. - לדגום את הבקבוקון במשך 5 דקות ב 37 מעלות....
- טפחו HBVP בבקבוקי תרבית T75 עם משטח פעיל להידבקות תאים בתוך אינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש. לאחר ההגעה למפגש, שאפו את מדיום הפריסיטים הישן ושטפו את התאים עם 5 מ"ל של תמיסת מלח חמה של דולבקו (DPBS). שאפו את ה- DPBS ונתקו את התאים מהבקבוקון באמצעות שילוב של 4 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA חמה ו-1 מ"ל של DPBS.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לבחון את ההשפעות של אסטרוציטים ופריסיטים על תפקוד המחסום של HBMEC, בנינו את מודל ה-BBB של תרבית תאים משולשת על תוספות תרביות תאים (איור 1A) יחד עם מונוקולטורה של HBMEC ושני מודלים של תרביות משותפות כפולות כבקרות (איור 1B). בקרות כפולות של תרבית משותפת כללו תרבית משותפת ללא מגע של HBMEC עם HA ותרבית משותפת של מגע של HBMEC עם HBVP. לאחר 6 ימים בתרבות משותפת, כל המערכות הניסיוניות היו נתונות ל- OGD במשך 4 שעות. שלמות המחסום של המונולייר האנדותל בתצורות BBB שצוי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה להקמת מודל BBB אמין של תרבית תאי אנדותל-פריציטים-אסטרוציטים לחקר תפקוד לקוי של BBB בהגדרה של שבץ איסכמי במבחנה. בהתחשב בכך pericytes הם השכנים הקרובים ביותר של תאי אנדותל in vivo, HBVP מצופים על החלק התחתון של מוסיף היטב מודלזה 16. למרות שתצורה זו חסרה את התקשורת הישירה בין תא לתא בין אסטרוציטים לתאי אנדותל, סידור זה מאפשר תקשורת עקיפה בין תא לתא בין סוגי תאים באמצעות גורמים מסיסים מופרשים. נוכחותם של אסטרוציטים ופריסיטים במערכת זו משפרת מאוד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים חשפו כי אין ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ו- DA047157.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 24 מ"מ Transwell עם 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליאסטר ממברנה הכנסת | קורנינג | 3450 | |
| 35 מ"מ זכוכית תחתונה כלים | MatTek מדעי החיים (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| אסטרוציטים בינוניים | מדע תא | 1801 | |
| גורם התקשרות | (פישר סיינטיפיק) | 4Z0-201 | |
| BD 60 מ"ל מזרק | BD | 309653 | |
| BrainPhys הדמיה מדיום אופטימלי | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| מדיום קלאסי שלם עם סרום ו-CultureBoost | 4Z0-500 | מערכות | |
| תאים קורנינג 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה PP (תחתית חרוטית עם מכסה CentriStar | VWR | 430829 | |
| קורנינג 75 ס"מ&2; צוואר משומר בצורת U לא מטופל בקבוק תרבית תאים | קורנינג | 431464U | |
| קורנינג CellBIND 96 בארות שטוח שקוף תחתון שחור פוליסטירן מיקרופלטות | קורנינג | 3340 | |
| ספירות תאים תא שקופיות | תרמו פישר סיינטיפיק | C10228 | |
| רוזנת II FL מונה תאים אוטומטי | תרמו פישר סיינטיפיק | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| דקון CiDehol 70 תמיסת אלכוהול איזופרופיל | פישר סיינטיפיק | 04-355-71 | |
| צלחות פטרי חד פעמיות | VWR | 25384-088 | |
| DMEM בינוני (ללא גלוקוז, ללא גלוטמין, ללא פנול אדום) | ThermoFisher | A14430-01 | בינוני ללא גלוקוז |
| DPBS (ללא סידן, ללא מגנזיום) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM צמיחת תאי אנדותל מדיום בסיסי, ללא פנול אדום, 500 מ"ל | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 מד וולט/אוהם אפיתל (TEER) עם אלקטרודות STX2 | World Precison Instruments | NC9792051 | מד וולטו אפיתליאלי |
| פלואורסצאין איזותיוציאנט וכו'; דקסטרן (משקל 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| פלואורסצאין איזותיוציאנט&ndash– דקסטרן (משקל 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס | FV3000 | |
| מיכל גז (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, טריהידראט - תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל במים | ThermoFisher | H3570 | |
| אסטרוציטים אנושיים | מדע תא | 1800 | |
| פריציטים כלי דם במוח אנושי | תא מדעי תא | 1200 | |
| תא חממת היפוקסיה | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT מגיב היפוקסיה ירוק | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי | ACBRI 376 | מערכות | |
| תאים פלטפורמת נדנדה שייקר, כפול | VWR | 10860-658 | |
| מד זרימה יחיד | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | התקנים מולקולריים | 75886-128 | |
| מסנן מזרק, 25 מ"מ, 0.22 μ m, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP צלחות בארות מרובות (6 בארות) | צלוחיות תרבית רקמות MidSci | TP92406 | |
| TPP צלוחיות T-75 צלוחיות | MidSci | TP90075 | עם משטח פעיל להדבקת תאים |
| טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure מים מזוקקים | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator-Oko | Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
מקורות
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38(2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
