Method Article

פיתוח והערכה של מודל חולדה של פגמים בסחוס בעובי מלא

DOI:

10.3791/64475

⸱

May 19th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מבסס מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות ומדידת התנהגות הכאב והשינויים ההיסטופתולוגיים הבאים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגמים בסחוס של מפרק הברך הנגרמים כתוצאה מטראומה הם פציעת מפרק ספורט נפוצה במרפאה, ופגמים אלה גורמים לכאבי מפרקים, לפגיעה בתנועה ובסופו של דבר לדלקת מפרקים ניוונית בברך (kOA). עם זאת, אין כמעט טיפול יעיל לפגמים בסחוס או אפילו kOA. מודלים של בעלי חיים חשובים לפיתוח תרופות טיפוליות, אך המודלים הקיימים לפגמים בסחוס אינם מספקים. עבודה זו ביססה מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות, והתנהגות הכאב והשינויים ההיסטופתולוגיים שלאחר מכן שימשו כניסויי קריאה. לאחר הניתוח, סף הנסיגה המכנית ירד, כונדרוציטים באתר הפגוע אבדו, ביטוי מטריצה metalloproteinase MMP13 הוגדל, ביטוי קולגן מסוג II ירד, בהתאם לשינויים הפתולוגיים שנצפו פגמים בסחוס האנושי. מתודולוגיה זו קלה ופשוטה לביצוע ומאפשרת התבוננות גסה מיד לאחר הפציעה. יתר על כן, מודל זה יכול לחקות בהצלחה פגמים בסחוס הקליני, ובכך לספק פלטפורמה לחקר התהליך הפתולוגי של פגמים בסחוס ופיתוח תרופות טיפוליות מתאימות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סחוס מפרקי הוא רקמה מובחנת וצפופה מאוד המורכבת מכונדרוציטים ומטריקס חוץ-תאי1. שכבת פני השטח של הסחוס המפרקי היא סוג של סחוס היאלין, בעל משטח חלק, חיכוך נמוך, חוזק וגמישות טובים, וסובלנות מאמץ מכנית מעולה2. המטריצה החוץ-תאית כוללת קולגן פרוטאוגליקן ומים, וקולגן מסוג II הוא המרכיב המבני העיקרי של הקולגן, שכן הוא מהווה כ-90% מכלל קולגן3. מכיוון שלא קיימים כלי דם או עצבים ברקמת הסחוס, אין לו יכולת לתקן את עצמו לאחר פציעה4. לכן, פגמים בסחוס שנגרמו כתוצאה מטראומה היו מאז ומתמיד מחלת מפרקים בלתי פתירה במרפאות; בנוסף, מחלה משותפת זו נוטה להכות צעירים, ואת השכיחות העולמית היא בעלייה 5,6. מפרק הברך הוא האתר השכיח ביותר של פגמים בסחוס, והפגמים כאן מלווים בכאבי מפרקים, תפקוד לקוי של המפרקים וניוון סחוס מפרקי, מה שמוביל בסופו של דבר לדלקת מפרקים ניוונית בברך (kOA)7. פגמים בסחוס במפרק הברך יוצרים עומס כלכלי ופיזיולוגי על המטופלים ומשפיעים קשות עלאיכות חייהם 8. מחלה זו מציבה אתגר קליני גדול ודחוף ללא פתרונות קרובים. כיום, ניתוח הוא עמוד התווך של הטיפול בפגמים בסחוס, אך תוצאותיו ארוכות הטווח אינן משביעות רצון9.

פגמים קליניים בסחוס מובילים בסופו של דבר ל-kOA, ולכן מודלים של בעלי חיים kOA משמשים בדרך כלל למחקר פתולוגי של פגמים בסחוס ופיתוח תרופות. הקמת מודלים של בעלי חיים חשובה להבנת התהליך הפתופיזיולוגי של תיקון פגמים בסחוס, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לצפות בהתחדשות הסחוס ובשינוי בין סחוס פיברוקרטי לסחוס היאלין10. עם זאת, מודלים נפוצים של kOA בבעלי חיים, כגון מודלים כירורגיים של טרנסקציה של הרצועה הצולבת הקדמית (ACLT), ערעור יציבות המניסקוס המדיאלי (DMM), כריתת שחלות (OVX) והולת', זקוקים בדרך כלל למודלים ארוכי טווח ומאפשרים רק הערכות פתולוגיות וכאב, מה שמציב מגבלות על יעילות פיתוח התרופות11. מלבד המודלים הניתוחיים, מודלים כימיים, כגון מונויודואצטט (MIA) והזרקת פפאין, גורמים גם הם לפגמים בסחוס, אך לא ניתן לנהל היטב את מידת הפגם, והתנאים רחוקים מהמציאות הקלינית11. התנגשות היא גישה נוספת למדל פגמים בסחוס בבעלי חיים גדולים יותר, אך שיטה זו תלויה בשימוש במכשירים ספציפיים ומיושמת לעיתים רחוקות12.

לסיכום, המודלים הקיימים של kOA אינם אידיאליים לחקר הפתוגנזה של פגמים בסחוס או לפיתוח תרופות חדשות, ויש צורך במודל ספציפי וסטנדרטי לפגמים בסחוס. מחקר זה ביסס מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך בחולדות. נערכו תצפית גסה, מבחני התנהגות כאב וניתוח היסטופתולוגי להערכת מודל. שלא כמו מודלים אחרים של בעלי חיים של kOA, למודל זה יש השפעה מועטה בלבד על מצבן הכללי של החולדות. גישת מידול זו נגישה, ניתנת לניהול טוב ותומכת בהבנת ההתקדמות מפגמים בסחוס ל- kOA ופיתוח טיפולים יעילים. מודל זה יכול לשמש גם לבדיקת טיפולים המונעים kOA על ידי ריפוי פגמים במפרקים טרום אוסטיאוארתריים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת התקנים הרפואיים והאתיקה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה סינית מסורתית, התואמת את החקיקה הסינית על שימוש וטיפול בחיות מעבדה. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD) זכרים בני 6 שבועות במשקל 150-180 גרם. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הקמת מודל פגמים בסחוס בעובי מלא בחולדות

  1. לאחר שבוע של התאקלמות בסביבה החדשה, חלקו את החולדות באופן אקראי ושווה לשתי קבוצות (n = 8 חולדות לקבוצה). החולדות בקבוצת הדמה יעברו את ניתוח הדמה, ואילו החולדות בקבוצת המודל יעברו את הניתוח הניסיוני הכולל קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך.
    הערה: כל כלוב חייב להיות מכוסה בריפוד קלחי תירס סטריליים (ראה טבלת חומרים) כדי להגן על אצבעות הרגליים של החולדות.
  2. הרדימו את החולדות על ידי הזרקה תוך צפקית (כלומר) של נתרן פנטוברביטלי (40 מ"ג/ק"ג). לאחר מכן, לחץ בעדינות על אצבעות הרגליים של החולדות כדי לאשר הרדמה נאותה. השתמשו במשחה וטרינרית על עיני החולדות כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
    הערה: את ניתוח בעלי החיים יש לבצע בחדר ניתוח ייעודי באמצעות כלי ניתוח אוטוקלאביים. על המפעילים ללבוש מעילי מעבדה נקיים, מסכות פנים, כיסויי ראש וכפפות סטריליות במהלך הניתוח. הניחו רפידות סטריליות על אזור הניתוח וחיקרו את כל הציוד לפני השימוש. לספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך.
  3. הניחו את החולדה על שולחן הניתוחים במצב שכיבה, גלחו את הגפיים האחוריות השמאלית והימנית, ונקו את אזור מפרק הברך עם סבון כירורגי, ולאחר מכן תמיסת פובידון-יוד חיטוי לסירוגין ואלכוהול שלוש פעמים בתנאים סטריליים. מניחים וילון סטרילי מעל החולדה, וחושפים את מפרק הברך שעבר חיטוי בלבד.
  4. בצע חתך של 1 ס"מ עם להב אזמל (מספר 11) באמצע מפרק ברך החולדה מלמעלה למטה, וחתך את קפסולת המפרק וגיד הירך הארבע ראשי לאורך הקצה המדיאלי של הפטלה לאחר הדיסקציה השטחית.
    הערה: גיד ה-Quadriceps femoris מחובר לפטלה ולקונדיל הירך במהלך כיפוף מפרק הברך13. החריץ שנראה בקופסית המפרק הוא החריץ הטרוכליארי של הירך, והקונדיל הפמורלי הדיסטלי יוצר את הקונדילים המדיאליים והצדיים.
  5. סובבו את הפטלה כלפי חוץ, וכופפו את השוקה והפיבולה בזווית של 90 מעלות כדי לחשוף באופן מלא את הטרוכליאה של קונדיל הירך. השתמש במקדח מעגלי בקוטר 1.6 מ"מ (ראה טבלת חומרים) אנכי למשטח הסחוס ב-4,000 סל"ד למשך 10 שניות כדי ליצור פגם סחוס אחד בעובי מלא בחריץ טרוכלארי הירך בעומק של 0.1 מ"מ.
    הערה: יש להשתמש במי מלח לסירוגין כדי למזער טראומה תרמית לרקמת העצם שמסביב במהלך הליך הקידוח.
  6. נגבו את מקום הניתוח בכדורי צמר גפן ספוגים בתמיסת מלח 0.9%, החליפו את הפטלה, השאירו את הברך במצב הארכה, ותפרו את החתך שכבה אחר שכבה בתפרים 4-0 שאינם נספגים (ראו טבלת חומרים).
    1. הניחו את בעלי החיים על כריות חימום עם שכיבה עצם החזה, עקבו אחריהם עד שהם מתעוררים, ואז החזירו אותם לכלובים שלהם. יש להזריק בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) תת עורית כל 8 שעות שלוש פעמים לאחר הניתוח לשיכוך כאבים.
  7. בדוק את ההתנהגות הקשורה לכאב של כל החולדות לאחר 3 ימים, 10 ימים ו -17 ימים לאחר הניתוח, כמתואר בסעיף 2.

2. סף משיכה מכני (MWT)

הערה: MWT של הפלנטר האחורי הדו-צדדי של חולדות נמדד בשיטה הקלאסית למדידת כאב נימה של פון פריי14.

  1. הניחו את החולדה בתא פלסטיק יחיד (17 ס"מ x 11 ס"מ x 13 ס"מ) על משטח רשת תיל (ראו טבלת חומרים), והניחו את בסיס רשת התיל 50 ס"מ מעל שולחן. מדוד את MWT לאחר 30 דקות של הסתגלות.
  2. לחצו על חוט הלהט של פון פריי (ראו טבלת חומרים) בניצב על המשטח הפלנטרי של כפה אחורית של כל חולדה, וכופפו את המברשת במשך כ-2 שניות, תוך הימנעות מהחלק העבה ביותר של מרכז הכף האחורית.
  3. הגדילו בהדרגה את משקל הגירוי מ-4 גרם הנמוך ביותר עד לתגובה חיובית (נסיגת כפות או ליקוק כפות).
    הערה: המרווח בין כל גירוי צריך להיות יותר מדקה. MWT מוגדר כשלוש תגובות חיוביות בחמישה גירויים; רשום את משקל הגירוי בגרמים.
  4. חשב את הערכים הממוצעים עבור קבוצות דמה ומודל על פי משקל הגירוי המינימלי שנרשם בגרמים.

3. ניתוח היסטופתולוגי ואימונוהיסטוכימי

  1. בגיל 17 ו-56 ימים לאחר הניתוח, הרדימו את החולדות עם 40 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל (כלומר), והקריבו את כל החולדות על ידי לקיחת דם מהלב. בודדו את הברכיים על ידי חיתוך העצם באמצע עצם הירך ובאמצע השוקה, ונתחו את רקמת השריר שמסביב. הסר את מפרקי הברך לניתוח היסטולוגי.
  2. תקן את מפרקי הברך ב 20 מ"ל של תמיסת 10% paraformaldehyde במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן decalcize אותם עם 20 מ"ל של 10% EDTA פתרון בשייקר אורביטלי במשך 8 שבועות ב 4 ° C. שנה את פתרון EDTA מדי יום.
  3. חתוך את מפרק הברך כך שיתאים לגודל קופסת ההטבעה. הטמיעו את מפרקי הברך המיובשים ב-100% פרפין15.
  4. הניחו את מפרקי הברכיים המשובצים בפרפין על מחזיק המיקרוטום, התאימו את הזווית וקצצו את דגימת הפרפין עם להב עד שהמשטח שטוח.
  5. קובעים את עובי פרוסות הפרפין ל-3 מיקרומטר, ומשטחים את הפרוסות באמבט מים ב-40°C.
  6. הדביקו את הפרוסות על מגלשות זכוכית, הכניסו אותן למכונת אפייה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים) עד לייבוש ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר.
  7. טלטול והתייבשות: הכניסו את הפרוסות לתנור בטמפרטורה של 60°C למשך 4 שעות, ולאחר מכן הכניסו את הפרוסות ברצף ל-100% קסילן (שלוש פעמים), 100% אתנול (פעמיים), 95% אתנול, 80% אתנול ו-75% אתנול למשך 5 דקות בכל פעם.
  8. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
    1. Dewax, rehydrate, ולשטוף את הפרוסות עם מים מזוקקים כפול במשך 2 דקות.
    2. מכתימים את הפרוסות ב-0.5% המטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך 3 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות המטוקסילין על משטחי הפרוסה.
    3. טובלים את הפרוסות באלכוהול חומצה הידרוכלורית 1% למשך 3 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    4. משרים את הפרוסות במי אמוניה 1% למשך 10 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    5. מכתימים את הפרוסות באאוסין (ראו טבלת חומרים) למשך דקה אחת, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות אאוזין על משטחי הפרוסה.
    6. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
    7. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי (ראו טבלת חומרים) לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.
  9. ספרנין O/Fast Freen (SO) צביעה
    1. Dewax, rehydrate, ולשטוף את הפרוסות עם מים מזוקקים כפול במשך 2 דקות.
    2. צבעו את הפרוסות ב-0.05% Fast Green (ראו טבלת חומרים) במשך 3 דקות, ושטפו את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שלא יהיו שאריות Fast Green על פני הפרוסות.
    3. טובלים את הפרוסות בתמיסת חומצה אצטית 1% למשך 10 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    4. מכתימים את הפרוסות ב-2.5% SO (ראו טבלת חומרים) למשך 2 דקות, ולאחר מכן שוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות SO על משטחי הפרוסה.
    5. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
    6. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.
  10. צביעה בצבע כחול טולוידין (שחפת)
    1. Dewax, rehydrate, ולשטוף את הפרוסות עם מים מזוקקים כפול במשך 2 דקות.
    2. טובלים את הפרוסות בתמיסת 1% שחפת (ראו טבלת חומרים) למשך 2 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות כחולות טולוידין על פני הפרוסות.
    3. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
    4. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.
  11. צביעת מסון
    1. Dewax, rehydrate, ולשטוף את הפרוסות עם מים מזוקקים כפול במשך 2 דקות.
    2. מוסיפים תמיסת Bouin (ראו טבלת חומרים) טיפה לפרוסות, מכתימים אותן ב-37°C למשך שעתיים ושוטפים אותן במים מזוקקים פעמיים עד שהצבע הצהוב על פני השטח של הפרוסות נעלם.
    3. מכתימים את הפרוסות בכחול שמיימי (ראו טבלת חומרים) למשך 3 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות כחולות על משטחי הפרוסה.
    4. מכתימים את הפרוסות בהמטוקסילין למשך 3 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות המטוקסילין על משטחי הפרוסה.
    5. טובלים את הפרוסות באתנול חומצי במשך 5 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    6. מכתימים את הפרוסות בפונסו פוקסין (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות פונסו פוקסין על משטחי הפרוסה.
    7. טובלים את הפרוסות בחומצה פוסהומוליבדית (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות, לאחר מכן טובלים אותן בתמיסת שחפת למשך 5 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים עד שאין שאריות שחפת על פני הפרוסות.
    8. טובלים את הפרוסות בתמיסת חומצה חלשה למשך 2 דקות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    9. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
    10. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.
  12. התבוננו בכל הפרוסות תחת מיקרוסקופ במצב כפול סמיות כדי לקבוע את מידת ניוון הסחוס המפרקי על פי שיטת הניקוד של מנקין16.
  13. אימונוהיסטוכימיה
    1. יש ללחלח את הפרוסות באופן שגרתי, ולשטוף את הפרוסות עם PBS למשך 2 דקות.
    2. לטבול את הפרוסות בתמיסת נתרן ציטראט, ומניחים את הפרוסות בתנור ב 60 ° C במשך 4 שעות כדי לתקן את האנטיגן. שטפו את הפרוסות עם PBS שלוש פעמים במשך 3 דקות כל אחת.
    3. טבלו את הפרוסות בתמיסת טריטון X-100 0.3% למשך 10 דקות, ושטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    4. חסום את פעילות הפרוקסידז האנדוגני על ידי הוספת תמיסת 3%H 2 O2 במתנול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    5. יש לדגור על החלקים עם סרום עיזים 5% ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסום כל קשירה לא ספציפית. שטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    6. הוסיפו 100 μL של נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PBS (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; ו-anti-MMP13, 1:100; ראו טבלת חומרים) לכל פרוסה, ודגרו עליהם למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. שטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    7. יש לדגור על כל פרוסה עם 100 מיקרוליטר של נוגדן משני בדילול PBS (1:100) (אנטי-ארנב עז או אנטי-עכבר עזים, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. שטפו את הפרוסות פעמיים עם PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    8. הוסף 100 μL של 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB, ראה את טבלת החומרים) פתרון עבודה לכל פרוסה.
    9. להתבונן ולתעד את זמן המראה של צבע חום תחת מיקרוסקופ; התגובה הכרומוגנית הופכת את אתרי האפיטופ לחום17. טפל בשאר הדגימות עם אותו זמן תגובה מוקלט.
    10. לאחר שהפרוסות הופכות לשחומות, שטפו את הפרוסות פעמיים במים מזוקקים פעמיים במשך 3 דקות בכל פעם.
    11. מכתימים מחדש את הפרוסות בהמטוקסילין למשך דקה, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    12. טובלים את הפרוסות בחומצה הידרוכלורית במשך 3 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    13. משרים את הפרוסות במי אמוניה 1% למשך 10 שניות, ושוטפים את הפרוסות במים מזוקקים פעמיים למשך 2 דקות.
    14. טבלו את הפרוסות ב-95% אתנול, 100% אתנול ו-100% קסילן (שלוש פעמים) ברציפות במשך דקה אחת בכל פעם.
    15. הוסיפו טיפה של שרף נייטרלי לכל פרוסה, ואטמו אותה בכיסוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, מודל חולדה של FTCD הוקם על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכליר הירך ואיתור התנהגות הכאב והשינויים ההיסטופתולוגיים הבאים. כפי שניתן לראות באיור 1, 3 ימים לאחר המידול, בהשוואה לקבוצת הדמה, ה-MWT של חולדות בקבוצת המודל הופחת באופן משמעותי, מה שמרמז על שיכוך יתר שנגרם על-ידי ה-FTCD. לאחר 17 יום לאחר הדוגמנות, סף הנסיגה המכנית של החולדות בקבוצת המודל נותר ברמה נמוכה, מה שמצביע על כך שהרגישות לכאב יכולה להימשך לפחות 17 יום. תוצאות הצביעה ההיסטופתולוגית הראו כי בקבוצת הדמה, מבנה הסחוס המפרקי ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר מודל של בעלי חיים לחיקוי פגמים בסחוס קליני על-ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות (איור משלים 1). לאחר פגיעה בסחוס, ההתרגשות או ההיענות של nociceptors היקפי משופר, אשר יכול לגרום לירידה בסף הכאב ואת שיפור ההיענות לגירוי18. במחקרים פרה-קליניים, מידול פגמים בסחוס במינים שונים של בעלי חיים תמיד גרם לכאב19. מחקרים קליניים הראו גם כי ציוני סולם הכאב האנלוגי החזותי (VAS) של חולים עם פציעות סחוס נמוכים משמעותית מאלה של אנשים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעי הטבע של ג'ג'יאנג (מענק מספר LQ20H270009), הקרן למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 82074464 ו-82104890), הקרן למדעי הרפואה הסינית המסורתית של ג'ג'יאנג (מספרי מענקים 2020ZA039, 2020ZA096 ו-2022ZB137) ופרויקט מדע וטכנולוגיה של בריאות רפואית של ועדת הבריאות המחוזית של ג'ג'יאנג (מענק מספר 2016KYA196).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3, 3 '-דיאמינובנזידין האנגג'ואו ז'נגבו ביוטכנולוגיה ושות', בע"מZLI-9019הצבע
לנוגדנים אנטי-קולגן IIIנובוסNB600-594נוגדן ראשוני לנוגדנים IHC
אנטי-קולגן IIAbcam (UK)34712נוגדן ראשוני לנוגדני IHC
Anti-Collagen I נובוסNB600-408נוגדן ראשוני לתמיסת IHC
BouinShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381הצבע עבור מאסון מכתים
Celestite כחולשנחאי Yuanye טכנולוגיה ושות', בע"מR20381הצבע לצביעת מאסון
ריפודי קלחי תירס  Xiaohe טכנולוגיה ושות', בע"מ מצעים לבעלי חיים 
EosinSigma-Aldrich861006הצבע לצביעת HE
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252הצבע
לנוגדנים נגד עכבר עזZSGQ-BIO (בייג'ינג, סין)PV-9002נוגדן משני
לנוגדנים נגד ארנב IHC עזZSGQ-BIO (בייג'ינג, סין)PV-9001נוגדן משני
להמטוקסיליןסיגמא-אולדריץ'H3163הצבע לצביעת HE
MassonShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381הצבע לצביעת מאסון
MicrodrillRwd Life Science Co., Ltd78001ציוד לניתוח
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (דנברס, MA, ארה"ב)69926נוגדן ראשוני למרכז
הטמעת רקמות מודולריThermo Fisher Scientific (ארה"ב)EC 350לייצר גושי פרפין
שרף ניטרליהאנגג'ואו ז'נגבו ביוטכנולוגיה ושות', בע"מחותם ZLI-9555לתפר IHC
בלתי נספגHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.4-0ציוד לניתוח
פנטוברביטל נתרן האנגג'ואו ז'נגבו ביוטכנולוגיה ושות', בע"מWBBTN5G
חומצה פוספומוליבדיתשנחאי Yuanye טכנולוגיה ושות', בע"מR20381הצבע עבור מאסון מכתים
Ponceau פוקסיןשנחאי Yuanye Technology Co., Ltd.R20381הצבע לצביעת מאסון
מיקרוטומים סיבוביים והזזהתרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)HM325קטעי פרפין מדויקים
Safranin-OSigma-AldrichS2255הצבע להב אזמל מכתים SO
שנחאי Lianhui ציוד רפואי ושות', בע"מ11ציוד לניתוח
תמיסת נתרן ציטראט (20x)האנגג'ואו האוק ביוטכנולוגיה ושות', בע"מHK1222אחזור אנטיגן עבור
חולדות IHC Sprague Dawley (SD)  שנחאי סלייק בעלי חיים ניסיוניים ושות', בע"מSD
Experimental Animal Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (יפן)מעבד חדירת ואקום
Toluidine BlueSigma-Aldrich89640הצבע לצביעת שחפת
נימה Von FreyUGO Basile (איטליה) 37450-275ציוד לבדיקת MWT
פלטפורמת רשת תיל שנחאי Yuyan מכשירים ושות', בע"מציוד לבדיקת MWT
מכתים IHC מכתים SO IHC IHC מורדמת מבעלי חיים 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065(2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245(2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288(2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639(2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37(2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422(2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cartilage DefectsFull Thickness CartilageRat ModelKnee Joint InjuryFemoral CondylePain BehaviorHistopathological StainingChondrocyte LossType II CollagenMatrix Metalloproteinase MMP13

Related Articles