מאמר שיטה

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

DOI:

10.3791/64490

⸱

21 באוקטובר 2022

 ,  , 
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שכפול DNA אאוקריוטי הוא תהליך מוסדר מאוד המבטיח כי התוכנית הגנטית של התא משוכפלת כראוי לפני הפרדת הכרומוזומים. מכיוון שפגמים בסינתזת דנ"א עומדים בבסיס סידור מחדש של כרומוזומים, ניטור שכפול הדנ"א הפך לחיוני להבנת הבסיס לחוסר יציבות הגנום. Saccharomyces cerevisiae הוא מודל קלאסי לחקר ויסות מחזור התא, אך עדיין קשה לקבוע פרמטרים מרכזיים של שכפול DNA, כגון חלק התאים בשלב S או משך שלב S. פרוטוקול זה משתמש בפולסים קצרים ולא רעילים של 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (EdU), אנלוגי של תימידין, בתאי שמרים מהונדסים מסוג TK-hENT1, ולאחר מכן זיהויו על ידי תגובת קליק כדי לאפשר הדמיה וכימות של שכפול DNA ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה הן ברמת התא הבודד והן ברמת האוכלוסייה על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה. שיטה זו עשויה לזהות פגמים שהתעלמו מהם בעבר בשלב S ובהתקדמות מחזור התא של מוטנטים של שמרים, ובכך לאפשר אפיון של שחקנים חדשים החיוניים להבטחת יציבות הגנום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יציבות הגנום באמצעות חלוקה מיטוטית מובטחת על ידי העברת קבוצה שלמה ושווה של כרומוזומים לשני אבות התאים המיוצרים. זה מסתמך על השלמה מדויקת של סדרה של אירועים המתרחשים בזמן נתון בכל שלב של מחזור התא. ב- G 1, מקורות השכפול מורשים עם גיוסם של מספר גורמי רישוי, כולל Cdc61. בשלב S, שכפול גנום שלם מתחיל ממקורות שכפול פעילים מרובים ומבוצע על ידי מכונות שכפול המתאספות במוקדים הנראים לעין מיקרוסקופית בשם מפעלי שכפול2. בשלב M, כרומטידים אחיות משוכפלים מחוברים ודו-כיווניים על הציר המיטוטי כדי לאפשר את הפרדתם לקטבים המנוגדים של התא המיטוטי3. הרגולציה, ההשלמה הנכונה ומשך הזמן של כל שלב הם המפתח להבטחת יציבות הגנום. ואכן, יציאה מוקדמת מכל אחד מהשלבים הללו מובילה לחוסר יציבות גנומית. לדוגמה, G 1 קצר יותר המושרה על ידי מחיקה של מעכב CDK שמרים ניצנים Sic1 או על ידי ביטוי יתר של ציקלינים G1 ישנה את שלב Sהבא 4,5,6. כתוצאה מכך, הסרת הרגולציה הזו, הקשורה או לא ללחץ שכפול, גורמת לשברים בכרומוזומים, לסידור מחדש ולהפרדה שגויה 4,5,6. לכן, ניטור משך שלב S, ובאופן רחב יותר, משך השלבים האחרים של מחזור התא עשוי להיות חיוני כדי לזהות את הפגמים המתרחשים במוטציות שונות ובתנאי עקה שונים.

שיטה מסורתית למדידת משך הפאזה של מחזור התא כוללת ציטומטריה פשוטה של זרימת תוכן DNA (איור 1A) ומסתמכת על אלגוריתם מתאים (זמין ברוב תוכנות הציטומטריה) המשמש להפרדת האוכלוסייה לשברי פאזה G1, S ו- G2 + M מהפסגות 1C ו- 2C. לאחר מכן השברים מוכפלים בזמן הכפלת האוכלוסייה7. עם זאת, שיטה זו נותנת רק ערכים משוערים, דורשת התפלגות גודל תא הומוגנית בתוך שבר נתון, ואינה ישימה לתרביות מסונכרנות. כדי לחקור את משך שלב ה-S בתאי יונקים, פותחו מספר אנלוגים של תימידין ונעשה בהם שימוש נרחב, כולל EdU. ספיגתם מהמדיום החוץ-תאי והזרחון על ידי תימידין קינאז (להלן TK) הופכים אותם לזמינים עבור פולימראזות DNA כדי לשלב אותם באתרים של סינתזת DNA (שכפול, רקומבינציה, תיקון). כדי לעקוף את היעדר הגן TK בתאי Saccharomyces cerevisiae, הונדסו זני שמרים כדי לאפשר ביטוי יציב ומכונן של נגיף ההרפס סימפלקס TK8 וטרנספורטר נוקלאוזיד שיווי משקל אנושי (hENT1)9. לאחר ששולב בדנ"א, EdU מזוהה באמצעות תגובת קליק סלקטיבית, אשר מצמידה כימית את מואטיות האלקין שלו לפלואורוכרומים10 שעברו שינוי אזיד.

מאמר זה מספק שני פרוטוקולים מקיפים ממוטבים לתיוג פולסים של תאים מהונדסים אסינכרוניים וסינכרוניים מסוג TK-hENT1 עם EdU על מנת להמחיש ולמדוד במדויק את משך ודינמיקת שכפול הדנ"א, כמו גם את משך השלבים האחרים של מחזור התא, עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה הן ברמת התא הבודד והן ברמת האוכלוסייה על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. S . cerevisiae תרבית תאים

הערה: זני השמרים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 1

הערה: ניתן לנטר את משך שלב ה-S בדרכים שונות. בהתאם לשאלה שיש להתייחס אליה, ניתן לגדל את התאים באופן אסינכרוני או סינכרוני לאחר מעצר G1 .

  1. מתאי S. cerevisiae הגדלים באופן אסינכרוני
    הערה: שיטה זו מאפשרת לקבוע את אחוז התאים בשלב S באוכלוסיית תאים הגדלה באופן אסינכרוני. על ידי קביעת זמן ההכפלה, ניתן לבצע אקסטרפולציה של משך שלב S (והשלבים האחרים).
    1. חיסון תאי S. cerevisiae ב-10 מ"ל של מדיום סינתטי שלם (SC) בריכוז תאים נמוך (5 × 104 תאים /מ"ל) לתרבית לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב-130 סל"ד.
      הערה: הריכוז נמדד באמצעות מונה תאים. כדי לחשב ביעילות את זמני ההכפלה, מומלץ לחסן את התרבית מתרבית לילה שעדיין נמצאת בשלב האקספוננציאלי (כלומר, באופן אידיאלי מתחת ל-2 × 107 תאים למ"ל). גידול תאים בתווך עשיר (YPD) אינו מומלץ, מכיוון שזיהוי EdU אינו יעיל.
    2. למחרת, דללו את התאים ב-20 מ"ל של מדיום SC טרי בריכוז הסופי של 5 × 105 תאים /מ"ל.
    3. תרבית את התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באמבט מים רועד עם רעידות אופקיות ב-120 סל"ד.
    4. מדוד את ריכוז התא כל שעה עד שהוא מגיע 1 × 107 תאים / מ"ל.
      הערה: שלב זה מאפשר לבצע ייצוג גרפי של ריכוז התא לאורך זמן. הנוסחה המשמשת לחישוב זמני ההכפלה מוסברת במקרא של טבלה 2.
    5. המשך במקביל לשלב 2 לתיוג EdU כאשר ריכוז התאים הוא בערך 2 × 10 6-5 × 106 תאים למ "ל.
  2. מתאי S. cerevisiae מסונכרנים G1
    הערה: שיטה זו מאפשרת לקבוע מתי שלב S מתחיל ומסתיים באמצעות ציטומטריה של זרימה ו/או ניתוחי מיקרוסקופיה.
    1. חיסון תאי S. cerevisiae ב-10 מ"ל של SC בינוני בריכוז תאים נמוך (5 × 104 תאים /מ"ל) לתרבית לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב-130 סל"ד.
      הערה: ראה את ההערות לאחר שלב 1.1.1.
    2. למחרת, יש לדלל את התאים ב-20 מ"ל של מדיום SC טרי בריכוז סופי של 2 × 106-3 × 106 תאים/מ"ל.
    3. יש להוסיף 40 μL של 1 מ"ג/מ"ל α-פקטור מדולל במים.
    4. תרבית את התאים ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב 130 סל"ד במשך שעה אחת.
    5. יש להוסיף שוב 40 μL של 1 מ"ג/מ"ל α-פקטור מדולל במים.
    6. תרבית את התאים ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב 130 סל"ד במשך שעה אחת.
    7. דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לעקוב אחר מעצר G1 . המשך אם יותר מ-90% מהתאים מציגים shmoo והאחרים הם תאים מעוגלים ולא מעוגלים.
      הערה: בהתאם לרקע שבו נעשה שימוש, מומלץ לנתק את התאים לפני ההדמיה של shmoo. עבור רקע W303, ניתן לנתק 2x, במשך 2 שניות בכל פעם, באמפליטודה של 40-50.
    8. צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 1,500 × גרם. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    9. יש לתלות את התאים ב-20 מ"ל של מדיום SC.
    10. חזור על שלבים 1.2.8-1.2.9 פעם אחת.
      הערה: גורם α נשטף עם שלבים אלה, והתאים משתחררים במחזור התאים. לחלופין, ניתן לשטוף את גורם α על ידי סינון תאי השמרים באמצעות מסנן ניטרוצלולוז בגודל 1.2 מיקרומטר באמצעות משפך המוצב על בקבוקון צדדי המחובר למשאבת ואקום.
    11. אסוף 1 מ"ל של תאים 2x כל 5 דקות והמשך לשלב 2 לתיוג EdU.
      הערה: תייג את התאים רק מאחד משני הצינורות עם EdU. התאים שאינם מסומנים בפולסים משמשים להבחנה בין תאים חיוביים ל-EdU לבין תאים שליליים ל-EdU בגרף דו-כיווני פרופידיום יודיד (PI)-EdU.
    12. יש להוסיף 400 μL של 1 מ"ג/מ"ל גורם α מדולל במים 30 דקות לאחר השחרור.
      הערה: מינון גבוה זה של גורם α נדרש כדי לעצור את התאים בשלב G1 של מחזור התאים הבא וכדי למנוע מהתאים להיכנס מחדש לשלב S הבא.

2. תיוג EdU

  1. העבר 1 מ"ל של תרבית תאים לצינור מיקרופוגה של 2.0 מ"ל המכיל 1 μL של 10 mM EdU. מערבבים היטב על ידי היפוך.
    הערה: כדי להפלות את התאים החיוביים ל-EdU מהתאים השליליים ל-EdU ב-FACS דו-כיווני PI-EdU, העבירו עוד 1 מ"ל של תרבית תאים לצינור מיקרופוגה של 2.0 מ"ל המכיל 1 μL של DMSO.
  2. דגירה במשך 3-5 דקות ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה באמבט מים רועדים.
    הערה: שלוש דקות מספיקות לזיהוי EdU באמצעות מיקרוסקופ; נדרשות 5 דקות לזיהוי EdU אופטימלי על ציטומטר זרימה.
  3. עצור את התגובה עם תוספת של 100 μL של 100% אתנול.
    1. עצור את התגובה עם תוספת של 100 μL של 20% paraformaldehyde אם מדידת גודל התא נדרש.
      הערה: אם יש לשמור על הארכיטקטורה הגרעינית של התאים המיטוטיים ללא פגע לצורך ניתוחים נוספים בעקבות תגובת הקליק, אנו ממליצים לתקן תאים עם 2% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר (RT) במקום לשים את התאים על קרח, מכיוון שהאחרון גורם לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים.
    2. השאירו את התאים למשך 20 דקות ב-RT תחת תסיסה קלה על נדנדה במהירות משתנה של 20 הטיות לדקה כדי לתקן את התאים לפני תוספת של 100 μL של 100% אתנול.

3. קיבוע תאים וחדירה

  1. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה ואקום.
  2. יש להשעות את כדור התא ב-500 μL של 70% אתנול. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
  3. השאירו למשך ≥1 שעות ב-RT ב-20 הטיות לדקה על נדנדה במהירות משתנה כדי לחדור לתאים.
    הערה: תאים הגדלים במדיום SC אינם פולטים היטב מכיוון שהם נוטים להידבק לדפנות המיקרופוגה. תוספת של אתנול משפרת את הכדורים ומפחיתה את אובדן התאים. ניתן לאחסן את התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה או לתקופות ארוכות יותר בטמפרטורה של 20°C-.
  4. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
  5. לשטוף את התאים 2x עם 500 μL של 10% אתנול PBS.
    הערה: השטיפות חיוניות להסרת EdU לא מקורב מהתאים.

4. תגובת קליק-איט

  1. לניתוח ציטומטריה
    1. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    2. יש להשהות את הכדור ב-200 מיקרו-ליטר של PBS המכיל 0.1 מ"ג/מ"ל RNase A ו-0.2 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K.
    3. דגירה במשך 1-2 שעות ב 50 °C עם רעידות מדי פעם (או לילה ב 37 °C).
    4. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    5. לשטוף את התאים עם 500 μL של PBS.
    6. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    7. יש להשעות את גלולת התא ב-200 μL של PBS + 1% אלבומין בסרום בקר (BSA). דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
      הערה: אין צורך בזמנים ארוכים יותר והם אפילו מזיקים ליעילות של תגובות קליק.
    8. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    9. השהה את הכדור ב 300 μL של PBS + 1% BSA.
    10. פזרו את התאים בין שני צינורות: 200 μL בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל עבור תגובת קליק ו-100 μL בצינור מיקרוצנטריפוגה נוסף של 1.5 מ"ל עבור צביעה ירוקה של Sytox.
    11. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    12. לצביעת כתמים ירוקים של סיסטוקס
      הערה: אנו ממליצים בחום לקחת אליקוט לצביעת Sytox Green (ללא קליק) על מנת לקבל פרופילי התייחסות לתוכן DNA באיכות גבוהה. ואכן, תגובת הקליק מרווה מאוד פלואורסצנציה אינטרקלנטית, כולל הפלואורסצנציה של Sytox Green ו-PI. כתוצאה מכך, תגובת הקליק עלולה לעוות את הקריאה של תוכן הדנ"א.
      1. יש להשעות את כדור התא ב-100 μL של PBS.
      2. העבר 10-30 μL (בהתאם לריכוז התא) לצינור ציטומטר זרימה המכיל 300 μL של 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ו- 0.5 μM Sytox Green.
      3. סוניקט 2x, עבור 2 שניות בכל פעם, באמפליטודה של 40-50.
      4. השאירו בחושך עד לעיבוד הדגימות על ציטומטר זרימה.
        הערה: ניתן לשמור את התאים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.
    13. עבור תגובת הלחיצה
      1. הכינו חיץ צבע אזיד טרי על ידי ערבוב הריאגנטים בסדר הבא (כמות לצינור אחד): 36 μL של PBS, 2 μL של 0.2 M CuSO4, 0.2 μL של 2 mM Cy5 Azide, ו 2 μL של 1 M חומצה אסקורבית.
        הערה: ניתן להכין תערובת מאסטר של חיץ צבע אזיד. יש לערבב את הריאגנטים באותו סדר כמו זה שהוזכר לעיל.
      2. השהה את גלולת התא עם 40 μL של תערובת צבע אזיד טרייה. דגירה ב-RT בחושך למשך 60 דקות.
      3. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
      4. לשטוף את התאים 3x עם 300 μL של 10% אתנול PBS.
        הערה: השטיפות חיוניות לסילוק כל אזיד EdU-Cy5 המסיס.
      5. יש לתלות את התאים ב-100 μL של 50 מיקרוגרם/מ"ל PI ב-PBS. השאירו למשך 10 דקות בחושך.
      6. העבר 10-30 μL של תרחיף התא (בהתאם לריכוז התא) לצינור ציטומטר זרימה המכיל 300 μL של 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.
      7. סוניקט 2x, עבור 2 שניות בכל פעם, באמפליטודה של 40-50.
      8. השאירו בחושך עד לעיבוד הדגימות על ציטומטר.
        הערה: ניתן לשמור את התאים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.
    14. קרא את הדוגמאות הירוקות של Sytox באמצעות לייזר כחול עירור בגודל 488 ננומטר ומסנן 530/30 BP. ראה איור 1A לקבלת תוצאות אופייניות. קרא את דגימות PI-EdU הדו-ערכיות על מתווה נקודה באמצעות לייזר כחול עירור ב-488 ננומטר ומסנן 615/20 BP עבור ה-PI (ציר x) ולייזר אדום עירור ב-640 ננומטר ומסנן 660/20 BP (ציר y). ראו איור 1B לקבלת תוצאות אופייניות.
      הערה: איור 1C מייצג את תוצאת ה-FACS הדו-כיוונית האופיינית ל-PI-EdU עבור תאים שליליים ל-EdU. זה מאפשר אפליה של תאים שליליים EdU מן התאים חיוביים EdU.
  2. לניתוח מיקרוסקופיה
    1. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    2. להשעות את הכדור ב 200 μL של PBS + 1% BSA. דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
    3. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    4. הכינו חיץ צבע אזיד טרי על ידי ערבוב הריאגנטים בסדר הבא (כמות לצינור אחד): 36 μL של PBS, 2 μL של 0.2 M CuSO4, 0.2 μL של 2 mM Dy-530 אזיד, 2 μL של 1 M חומצה אסקורבית.
      הערה: ניתן להכין תערובת ראשית של חיץ צבע אזיד טרי על ידי ערבוב הריאגנטים בסדר הנ"ל.
    5. השהה את הכדור עם 40 μL של חיץ צבע אזיד טרי. דגירה ב-RT בחושך למשך 60 דקות.
    6. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    7. לשטוף את התאים 2x עם 300 μL של 10% אתנול PBS.
      הערה: השטיפות חיוניות לסילוק כל אזיד Dy-530 מסיס.
    8. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    9. יש להשעות את התאים ב-100 μL של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ב-PBS. משאירים למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    10. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    11. יש לשטוף עם 300 μL של PBS כדי להסיר עודפי DAPI.
    12. גלולו את התאים במשך 2 דקות ב-10,000 × גרם במיקרופוגה. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ואקום.
    13. השהה את הכדור עם 10-50 μL של PBS בהתאם לריכוז התא.
    14. סוניקט 2x, עבור 2 שניות בכל פעם, באמפליטודה של 40-50.
      הערה: ניתן לשמור את התאים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.
    15. פיפטה 1.7 μL של התאים על מיקרוסקופ זכוכית להחליק ולכסות עם כיסוי נקי.
    16. התבונן מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנני DAPI ו- TexasRed או Cy3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לקבוע את משך שלב S, ובאופן רחב יותר, את משך הזמן של G 1 ו- G2 + M (שלב פרוטוקול 1.1), S. cerevisiae W303 תאים מסוג בר (WT, טבלה 1) גודלו באופן אסינכרוני במדיום SC במשך 7 שעות. בכל שעה, ריכוז התאים היה במעקב כדי לקבוע את זמן ההכפלה (איור 2B). בתנאי גידול אלה, זמן ההכפלה המחושב היה 120 דקות ± 13 דקות ב-25 מעלות צלזיוס (טבלה 2). כאשר התאים היו בפאזה המעריכית (2 × 10 6-5 × 106 תאים למ"ל), אליקוטשל תאים היה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שמרים הם אורגניזם מודל ראשוני לחקר מחזור התא, אך האפיון של שלב ה-S שלו נפגע זה מכבר בשל חוסר יכולתו לשלב נוקלאוזידים אקסוגניים, כגון BrdU, המשמשים כעקבות של שכפול DNA. הצטיידות שמרים בביטוי גבוה של הרפס סימפלקס תימידין קינאז (TK) ותוספת של טרנספורטר נוקלאוזיד אנושי (hENT) פתרו במידה רבה את הבעיה הזו15,16. EdU הוא רב-תכליתי יותר מ-BrdU מכיוון שהזיהוי שלו עם אזיד פלואורסצנטי קטן וכימיה של קליק מקובל על תאי שמרים מחלחלים וניתוח FACS, בניגוד לנוגדנים נגד BrdU

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לסוכנות הלאומית דה לה רשרש (ANR) ולאגודה לסרטן (ARC) על מלגות הדוקטורט ל- J.d.D.B.T. ול- Agence Nationale pour la Recherche (ANR) לתמיכה כספית (מענק ANR-18-CE12-0018-01). ציטומטריה ומיקרוסקופיה בוצעו במתקן ההדמיה BioCampus MRI במונפלייה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
&אלפא;-פקטור GenescriptRP01002
אלבומין סרום בקר (BSA)Euromedex04-100--812-E
נחושת גופרתיתסיגמאC1297
DAPIסיגמאD9542
די-סולפו-ציאנין5 אזיד (Cy5 אזיד)InterchimFP-JV6320אלטרנטיבה ל-Alexa647-azide
Dy-530 azideDyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)קרבוסינת'NE08701
אתנול אבסולוטיקרלו ארבה ריאגנטיםP013A10D16או שווה ערך
L-אסקורביסיגמאA4544
פרופידיום יודידסיגמאP4864
פרוטאינאז KEuromedexEU0090
רנאזSIGMAR5000
Sytox ירוקInvitrogenS-7020
<חזק>ציוד
מונה תאיםOLSCASY
זרימה ציטומטרAgilentNovoSampler Pro
רעידות אינקובטורInfors444-4230או שווה ערך
מי רעידות bathJulaboSW22או שווה ערך
SonicatorSonicsVibra cell
מיקרוסקופיה בשדה רחבLeicaTHUNDER Imagerאו שווה ערך

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120(2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EdUDNASytox Green

מאמרים קשורים