פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה
במאמר זה
סיכום
תקציר
טיפות שומנים פלסטוגלובול הן תת-תא דינמי של כלורופלסטים צמחיים וציאנובקטריה. הם נמצאים בכל מקום בקרב מינים פוטוסינתטיים, ומאמינים שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהסתגלות ובשיפוץ של קרום התילקואיד בתנאי סביבה המשתנים במהירות. היכולת לבודד פלסטוגלובולים בעלי טוהר גבוה הקלה מאוד על מחקרם באמצעות מתודולוגיות פרוטאומיות, ליפידומיות ואחרות. עם plastoglobules של טוהר גבוה ותשואה, ניתן לחקור את הרכב השומנים והחלבונים שלהם, פעילות אנזימטית, טופולוגיה חלבון, בין מאפיינים מולקולריים אפשריים אחרים. מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר ויעיל לבידוד פלסטוגלובולים מכלורופלסטים של רקמת עלה צמחי ומציג וריאציות מתודולוגיות לבידוד של פלסטוגלובולים ומבני טיפות שומנים קשורים מעלי תירס, רקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, Eragrostis nindensis, והציאנובקטריום, סינכוציסטיס sp. PCC 6803. הבידוד מסתמך על הצפיפות הנמוכה של חלקיקים עשירים בשומנים אלה, מה שמקל על טיהורם על ידי ציפה בצפיפות סוכרוז. מתודולוגיה זו תוכיח את עצמה כבעלת ערך בחקר פלסטוגלובולים ממינים מגוונים.
מבוא
ההבנה הנוכחית של הרכב ותפקוד הפלסטוגלובול התפתחה באמצעות מחקרים פרוטאומיים וליפידומיים מפורטים 1,2,3,4,5. מחקרים כאלה נעזרו רבות בשיטת בידוד מהירה ויעילה המסתמכת על צפיפותם הנמוכה מאוד להפרדה יעילה באמצעות שיפועים של סוכרוז. שיטות ראשוניות לבידוד פלסטוגלובול הושגו ממינים כגון עץ האשור (Fagus sylvatica), מטאטא סקוטי (Sarothamnus scoparius), בצל (Allium cepa), תרד (Spinacia oleracea), פאנסי (ויולה טריקולור), פלפל (Capsicum annuum) ואפונה (Pisum sativum....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בידוד פלסטוגלובול גולמי
- מיצוי פלסטוגלובול גולמי מרקמת עלי תירס לא מתוחים
- רכשו שישה שתילי תירס בריאים כבני 3 שבועות וכמעט בשלב הצמיחה של V5, במשקל של כ-120 גרם.
- חותכים את כל העלים שבבסיס הגבעול, מטביעים אותם במהירות באמבט קרח, ומעבירים לחדר הקר.
- עובדים תחת מנורת בטיחות ירוקה, מוציאים את עלי התירס מאמבט הקרח וחותכים אותם לחתיכות קטנות יותר (כ-5X5 ס"מ) באמצעות מספריים.
- טחנו בעדינות אך ביסודיות מחצית מרקמת העלה החתוך בבלנדר מסחרי ב-350 מ"ל של חיץ השחזה (טבלה 1). התחילו לעצור את הבלנדר 5x-6x כדי לוודא שכל העלים נחתכים. אין להשתמש מעל רמה 7 בבלנדר.
- סנן את ההומוגנט דרך שכבה אחת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עם השלמת שלב 1 של הפרוטוקול, יש לראות בקלות כמות ניכרת של חומר טיפות פלסטוגלובול/שומנים שצף על השכבה העליונה של כרית הסוכרוז (או בסמוך לה) (איור 1B-C). ניתן לאסוף גם שברים אחרים בשלב זה. לדוגמה, thylakoids יהיה גלולה וניתן להשעות מחדש עם בינוני R 0.2 עבור ניתוחים הבאים. לאחר הצנטריפוגה הבאה, פלסטוגלובולים מטוהרים יתקבלו על פני השטח של שיפוע הסוכרוז או בסמוך לו, כפי שמוצג באיור 1A,C. בנסיבות מסוימות (למשל, קווים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי למזער את השינויים הפיזיולוגיים/ביוכימיים בחומר ולהגן על פיגמנטים מסוימים של פרניל ליפידים פוטו-לביליים ותרמו-לביליים שהם מרכיב עשיר של פלסטוגלובולים, חיוני לבצע את הבידוד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. כפי שצוין לעיל, הצעדים הראשונים מבוצעים בחדר הקירור תחת מנורת בטיחות באמצעות נורה פולטת ירוק. השלבים הבאים המבוצעים במעבדה הם תחת אורות מעומעמים ומשתמשים בקרח או בצנטריפוגה מקוררת. מסיבות דומות, הכללתם של מעכבי פרוטאזות טריות (ומעכבי פוספטאז אם יש עניין לחקור את ויסות הפוספו של חלבונים) היא קריטית (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי עניינים להצהיר.
תודות
המחקר בקבוצת המעבדה של לונדקוויסט נתמך על ידי מענקים מה-NSF (MCB-2034631) ו-USDA (MICL08607) ל-P.K.L. המחברים מודים לד"ר קארי הייזר (MSU) על התמיכה בפיתוח שיטת הבידוד של פלסטוגלובול ציאנובקטריאלי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| בטא-גליצרופוספט. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| סרום בקר אלבומין | Proliant ביולוגי | 68700 | |
| כימוסטטין | סיגמא אולדריץ' | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| תא לחץ צרפתי (דגם FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| מגנזיום כלוריד | סיגמא אולדריץ' | M8266 | |
| אינקובטור טלטול מולטיטרון | Infors HT | N/A | |
| פוספו-רמידון.2 ו | Sigma Aldrich | R7385 | |
| אשלגן הידרוקסיד | פישר כימיקלים | M16050 | |
| ביוכימיקלים מופחתים של ציסטאין | MP | 101444 | |
| נתרן פלואוריד | סיגמא אולדריץ' | S7920 | |
| נתרן אורתו-ונדאט | סיגמא אולדריץ' | 450243 | |
| נתרן פירופוספט · 10H2O | סיגמא אולדריץ' | 3850 | |
| סורביטול | סיגמא אולדריץ' | S3889 | |
| סוכרוז | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W נורת צינור גרו-לוקס פלואורסצנטית, 18 אינץ' | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL אולטרה-צנטריפוגה | בקמן קולטר | A95761 | |
| בלנדר Waring (1.2 ליטר) | VWR | 58977-227 | בלנדר מסחרי |
| Zea mays | N/A | N/A |
מקורות
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Ara....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
