הדמיה אוטופלואורסצנטית להערכת פיזיולוגיה של אצות אדומות

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיה אוטופלואורסצנטית שלב אחר שלב והערכה של שינויים בחלבון פיקובילין באצות אדומות בהתבסס על אנליזה ספקטרלית. זוהי שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת הסתגלות התאית לבתי גידול קיצוניים, כאשר רק חומר נדיר זמין ותאים גדלים לאט, או בכלל לא, בתנאי מעבדה.

תקציר

אצות אדומות (Rhodophyta) מכילות חלבוני פיקובילין ומאכלסות בתי גידול באור עמום, אולם חלקן (למשל, כמה מיני Chroothece ) יכולות להתפתח גם בשמש מלאה. רוב הרודופיטים הם אדומים, אולם חלקם יכולים להיראות כחלחלים, בהתאם לחלקם של חלבוני ביליבואין כחולים ואדומים (פיקוציאנין ופיקואריתרין). חלבוני פיקובילין שונים יכולים ללכוד אור באורכי גל שונים ולהעביר אותו לכלורופיל a, מה שמאפשר פוטוסינתזה בתנאי אור שונים מאוד. פיגמנטים אלה מגיבים לשינויים בבתי גידול באור, והאוטופלואורסצנטיות שלהם יכולה לסייע בחקר תהליכים ביולוגיים. באמצעות Chroothece mobilis כאורגניזם מודל ומצב סריקת למבדה ספקטרלי במיקרוסקופ קונפוקלי, ההתאמה של פיגמנטים פוטוסינתטיים לאורות מונוכרומטיים שונים נחקרה ברמה התאית כדי לנחש את תנאי הגידול האופטימליים של המין. התוצאות הראו כי גם כאשר הזן הנחקר בודד ממערה, הוא הסתגל לעוצמות אור עמומות ובינוניות כאחד. השיטה המוצגת שימושית במיוחד לחקר אורגניזמים פוטוסינתטיים שאינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה, וזה בדרך כלל המקרה עבור אלה החיים בבתי גידול קיצוניים.

מבוא

אצות אדומות, כמו הסוג Chroothece, יכולות לגדול בבתי גידול קיצוניים, שם הן נאלצות להתמודד לעתים קרובות עם שינויים סביבתיים ניכרים¹. שיטפונות ובצורות שכיחים באזורים צחיחים למחצה שבהם ניתן למצוא סוג זה, וכמה מינים דווחו בנחלים, צוקים, מערות או אפילו מים תרמיים². עם זאת, רוב הזמן, משתנים ביולוגיים, כגון תחרות או מרעה, דוחקים מינים לתנאים לא אופטימליים לגידולם. מכיוון שאורגניזמים אלה לעתים קרובות קשים לתרבית ואינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה, מגבלה עיקרית אחת היא גודל הדגימה הזמין. לכן, חשוב מאוד לעקוב אחר שיטות לא הרסניות או שיטות הכוללות מניפולציה מדגם מינימלי ^3,4.

ניתן לעקוב אחר הכישורים הפיזיולוגיים הדרושים כדי לשרוד בסביבות קשות אלה על ידי מעקב אחר שינויים במערכות הפוטוסינתטיות שלהם. מנגנונים מטבוליים, יעילות פוטוסינתטית ורגישות לתנאי אור או תרבית יכולים להתגלות על ידי פרופילי פליטה פלואורסצנטיים של פיגמנטים, עקב שינויים מדויקים בהעברת האנרגיה שלהם או בלכידה 5,6,7,8.

Autofluorescence של תרכובות תאיות יכול לשמש סמן עבור cytodiagnosis או כאינדיקטור טבעי של מצב הסלולר או מטבוליזם בתגובה אותות חיצוניים ופנימיים באמצעות שינויים פליטה⁹. ניתן להשתמש בו גם כדי להבחין בין קבוצות שונות מבחינה טקסונומית של אורגניזמים פוטוסינתטיים¹⁰. בהתאם למיקום הפילוגנטי של מיקרואורגניזמים פוטוטרופיים, ניתן למצוא תכונות פלואורסצנטיות שונות in vivo. לכן, זיהוי טקסונומי המבוסס על מאפייני in vivo של פלואורסצנטיות פוטוטרופית (כולל ספיגה פלואורסצנטית וספקטרום פליטה) נוסה במספר הזדמנויות^11,12. בגלל הגיוון בפיגמנטים הנלווים בין פיטופלנקטון טקסה, ניתן להשתמש בהבדלים באורכי הגל שבהם מגורה פלואורסצנטיות כלורופיל A (Chl a), או הבדלים בספקטרום הפליטה, כדי להסיק טקסונומיה¹³. ספקטרום העירור והפליטה הפלואורסצנטי in vivo של דגימות אלה מסתמך לא רק על פילה של אצות, אלא גם על הסתגלות פוטוסיסטם¹⁴. יעילות העברת האנרגיה ל- Chl a, או היחס בין Chl a לפיגמנטים אביזרים, ותכולת הפיגמנט התאית רגישים לתנאי גידול⁵.

לאצות אדומות, במיוחד Chroothece, יש מספר פיגמנטים פלואורסצנטיים נלווים - חלבוני פיקובילין וקרוטנואידים; הראשון מתרכז בפיקוביליזומים המחוברים לתילקואידים של כלורופלסטים. חלבוני פיקובילין (פיקוציאנין, פיקואריתרין ואלופיקוציאנין) יכולים ללכוד אור באורכי גל שונים ולהעבירו ל-Chl a, מה שמאפשר פוטוסינתזה בתנאי אור ותרבות שונים מאוד¹⁵. לדוגמה, מיני Chroothece יכולים לגדול בתוך מערות או כמעט להופיע בנחלים גירניים מלוחים מעט².

אורות מונוכרומטיים משפיעים על הגדילה והרכב הפיגמנטים של אורגניזמים פוטוסינתטיים, ונחקרו כדי למנוע או לשלוט בגדילה של אורגניזמים פוטוסינתטיים במערות. Mulec et al. הראו כי תאורה מועשרת באדום מקדמת צמיחה של ציאנובקטריה, אצות וצמחים¹⁶. מחקרים קודמים דיווחו גם כי אור ירוק משפיע על הרכב הפיגמנטים של ציאנובקטריה¹⁷, בעוד שאחרים גילו כי אור ירוק מונע את צמיחתם של רוב האורגניזמים הפוטוסינתטיים וחלק מהציאנובקטריה מציגים ירידה בתילקואידים ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת חלשה יותר¹⁸.

כדי להבין את יכולתו של Chroothece כאורגניזם מודל להתגבר על תנאים קשים, תאים בתרבית נחשפו לעוצמות אור הולכות וגדלות ולאור מונוכרומטי (ירוק או אדום)¹⁵, כדי לראות כיצד הוא מתמודד עם התנאים העמומים של מערות (שבהן האור האדום שולט). הפרוטוקול המוצג כאן משחזר את ההשפעה של המשתנים הנ"ל על חלבוני הפיקובילין של Chroothece ברמה התאית באמצעות אוטופלואורסצנטיות משלו.

כיום, פלואורסצנטיות משמשת בדרך כלל ככלי לחקר התגובות הפיזיולוגיות של צמחים וסקולריים, מיקרו-אצות, מאקרו-אצות וציאנובקטריה^13,14,16. מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי ספקטרלי הוא כלי מעולה למחקרי in vivo להערכת הפיזיולוגיה של דגימות פוטוסינתטיות ברמת התא הבודד 10,17,18,19,20^, על ידי הימנעות מבעיות הקשורות לקצב הגידול הנמוך במעבדה ולקשיים בהשגת מספיק ביומסה למיצוי ולשיטות הביוכימיות הנלוות⁸ . לאחר טיפול בתאים בתנאי תרבית שונים במשך שבועיים, ניתן למדוד את פרופיל סריקת הלמבדה in vivo. למרות שישנם מספר פרסומים בהם נעשה שימוש באורכי גל שונים של עירור על ידי הדמיה קונפוקלית 3,4,10,17, ניתן לזהות את רוב חלבוני הפיקובילין ו- Chl a באמצעות קו עירור אורך גל של 561 ננומטר^, וטווח הפליטה שזוהה נע בין 570 ל -⁷⁶⁰ ננומטר. קריטריונים אלה התבססו על ניתוח שבוצע בעבר 10 עם פיגמנטים טהורים מסחריים (טבלה 1) על ידי הדמיה קונפוקלית והתוצאות שהתקבלו במינים שונים של אצות^20,21,22.

פיגמנטים	λflmax (NM)	λ exc (NM)
		351	364	458	476	488	514	543	633
צ'ל א	660.9-678.1	69.9 ± 1.8	18.1 ± 0.2	1.8 ± 0.05	2.2 ± 0.08	19.7 ± 0.7	6.0 ± 0.3	4.2 ± 0.16	80.7 ± 1.5
R-PE	569.2-583.3	5.9 ± 0.6	5.9 ± 0.16	17.1 ± 0.04	67.9 ± 0.3	100.0 ± 0	90.0 ± 0.3	992.2 ± 0.08	-
	652.1-668.6	-	-	1.5 ± 0.01	3.7 ± 0.04	42.9 ± 0.5	8.7 ± 0.16	11.1 ± 0.16	18.2 ± 0.2
C-PC	636.2-676.4	2.3 ± 0.04	1.0 ± 0.01	0.6 ± 0.004	0.7 ± 0.008	2.2 ± 0.08	2.2 ± 0.04	3.3 ± 0.16	54.1 ± 0.9
APC-XL	667.3-683.8	19.8 ± 1.5	9.6 ± 0.98	1.0 ± 0.04	1.2 ± 0.08	5.9 ± 0.7	4.6 ± 0.5	37.3 ± 3.5	91.9 ± 2.3

טבלה 1: מידע הפיגמנט הטהור המשמש להפעלת ניתוח סריקת למדא. טבלה זו מציגה שיאי פליטה וכתפיים/פס פלואורסצנטי מקסימלי של פלואורוכרומים/פיגמנטים שונים על ידי ספקטרופוטומטריה של הדמיה קונפוקלית עבור כל אורכי גל העירור, ואחוז פליטת האור על ידי פיגמנטים/פלואורוכרומים. הערכים חושבו לפי הנוסחה: = MFI*100/255. כל ערך הוא הממוצע ± SE (ממוצע ± שגיאת תקן מהממוצע). פיגמנטים טהורים שימשו לכיול מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי כדלקמן ^1,2,10. כלורופיל a התקבל מ-Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) מ-Porphyra tenera, ו-C-phycocyanin (C-PE) מ-Spirulina sp. כל המינים הומסו במים מזוקקים מסוננים. Allophycocyanin-XL (APC-XL) התקבל מ Mastigocladus laminosus, אשר היה מומס אמוניום סולפט (60%) ופוספט אשלגן (pH = 7) כדי להשיג ריכוז של 38 mM. הסריקות בוצעו עם 400 μL מכל תמיסת פיגמנט (ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל) באמצעות תא תחתון מזכוכית מכוסה 8 היטב.

המחקר של אורך גל עירור יחיד הוא קירוב ראשון שימושי למדי. במקרה זה, עם זאת, יש צורך להבהיר את התרומה היחסית של קומפלקסים שונים אות פלואורסצנטי, אשר מומלץ לבצע יחס פלואורסצנטי או ניתוח ספקטרום במספר אורכי גל, בין שיטות אחרות.

פרוטוקול

מין האצות Chroothece mobilis שימש במחקר הנוכחי. המין התקבל מאוסף התרביות Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

איור 1: סקירה כללית של המחקר. Chroothece mobilis מודגר בתנאי בית גידול קיצוניים, כגון אורות מונוכרומטיים שונים, במשך שבועיים. ההשפעה על הפיזיולוגיה של Chroothece מוערכת על ידי autofluorescence של החלבונים הכלולים phycobilisome ו photosystems באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת מדגם

1. הכינו את החיסון של Chroothece mobilis מתרבות האגר של האוסף על ידי העברתו למדיום הנוזלי SWES (טבלה 2).
   הערה: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = מדיום מי ים²³.
2. שמור על כל התרביות במשך שבועיים עם פוטופריוד בהיר / כהה 16: 8 ב 20 ° C בתנאים של עוצמת אור לבן נמוכה (LL: 80 μM/m²/s) וללא רעידות, עד לקבלת צפיפות התאים הרצויה (ראה שלב 1.3).
   הערה: תנאי אור הגידול הם עוצמת אור של 80 מיקרומטר/מ"ר²/s (קרינה פוטוסינתטית פעילה, PAR). תנאים אלה משמשים כתנאי תאורה חלשה (בקרה). הרכב מדיום SWES מובא בטבלה 2.
3. לבצע חיסונים לניסויים השונים בשלב התרבית המעריכית עם צפיפות תאים של 5 x 10³ תאים / מ"ל בצלחת 24 בארות, באמצעות 1 מ"ל לכל באר.
   הערה: בצע ספירת תאים עם תא נויבאואר²⁴, ודלל את התרבית עם SWES בעת הצורך.

SWES הרכב בינוני
רכיב	ריכוז
KNO3	1.98 מ"מ
K2HPO4	115 מיקרומטר
מגסו4	81 מיקרומטר
ZnSO4, 7H2O	17 נאנומטר
MnSO4, 7H2O	45 נאנומטר
ח 3BO3, 4H2O	3.1 מ"מ
Co(NO3)2	17 מ"מ
Na 2 MoO4, 6H2O	21 נאנומטר
CuSO4, 2H2O	0.1 נאנומטר
פס'4, 5ח2O	13 מיקרומטר
EDTA, 7H2O	11 מיקרומטר
ויטמין B12	5 מיקרוגרם
תמצית קרקע	30 מ"ל
מי נהר מסוננים	455 מ"ל

טבלה 2: הרכב בינוני SWES.

2. שחזור תנאי בית גידול קיצוניים של אצות: אפקט אור מונוכרומטי ירוק ואדום

1. הוסף 1 מ"ל של תרבית תאים מתרבית המלאי שהוכנה בצפיפות התאים הנ"ל (שלב 1.2) כדי לחסן כל באר של צלחת 24 בארות.
2. שמור את תרבית התא מכוסה במשך 2 שבועות כדי לשחזר את אפקט האור מונוכרומטי.
   1. השתמש בפילטר הירוק המאפשר לאור ירוק לעבור בין 470 ל -570 ננומטר עם שיא באורך גל של 506 ננומטר (על פי מפרט היצרן; ראה טבלת חומרים) ולחשוף אותו לתרבית²⁵.
   2. השתמש במסנן האדום המאפשר אור אדום בין 590 ל- 720 ננומטר ומגיע לשיא של 678 ננומטר (לפי מפרט היצרן; ראה טבלת חומרים) כדי לחשוף אותו לתרבית²⁵.
      הערה: עוצמת האור הלבן הנמוכה (LL: 80 μM/m²/s; ראה טבלת חומרים) משמשת כבקרת עוצמת האור כדי להשוות את ההשפעות המתקבלות. יחידות עוצמת האור המשמשות הן מיקרומול לשנייה ומטר מרובע (μmol ^{m-2 s-1}) או צפיפות שטף פוטונים פוטוסינתטי (PPFD).

3. הדמיה אוטופלואורסצנטית

הערה: הגדרת תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים) מודגמת באיור 2.

1. הפעל את כל רכיבי מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי ההפוך (CLSM; ראה טבלת חומרים), כולל הלייזר.
2. הרכיבו את התאים מכל באר ניסויית של צלחת 24 בארות במצע גידול SWES לצלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ (ראו טבלת חומרים) לצורך הדמיה.
3. בחר את מטרת טבילת גליצרול NA 63x/1.30 והנח גליצרול מעל העדשה (ראה טבלת חומרים).
4. הניחו את צלחת הבאר על במת המיקרוסקופ וודאו שהדגימה אינה זזה במהלך רכישת התמונה.
5. מרכז את הדגימה בנתיב האור והתמקד במרכז התא על ידי בחירת המישור בעל עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר.
6. פתח את תוכנת רכישת התמונות ובחר xyλ מהרשימה הנפתחת במצב רכישה²⁶.
7. בחר את קו העירור של הלייזר ל- DPSS של 561 ננומטר, טווח דינמי של 8 סיביות ו- 1024 x 1024 פיקסלים.
   הערה: ודא שלמיקרוסקופ הקונפוקלי יש לייזר DPSS של 561 ננומטר או לייזר אור לבן (WLL).
8. אסוף את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית ברוחב הפס של 10 ננומטר ואת גודל שלב הלמבדה של 4 ננומטר בטווח של 570-760 ננומטר.
9. הגדר את חור הסיכה ביחידה אוורירית אחת והפעל את רכישת סריקת למדא.
10. חזור על תהליך זה פעמים רבות ככל האפשר בתחומי ראייה שונים כדי לאסוף כמות מקובלת של נתונים לניתוח סטטיסטי (בדרך כלל סטיית תקן נמוכה מ -10% ²²).
11. חזור על השלב האחרון בתנאים השונים (תחת אורות אדומים וירוקים) ושמור את הנתונים.
    הערה: השתמש באותן הגדרות רכישה עבור הדגימות והתנאים השונים כדי להשוות ולבצע את הניתוח הסטטיסטי.

איור 2: הגדרת תוכנה. ממשק משתמש של תוכנת הדמיה להגדרת פרמטרי סריקת lambda. (A) משמאל לימין, כדי לבחור את מצב הרכישה xyλ מהרשימה הנפתחת, המתאים לשלב 3.6 בפרוטוקול, ולבחור את סוג עדשת הטבילה הימנית, המתאים לשלב 3.3 בפרוטוקול. הקפד להסיר מסנן כלשהו מנתיב האור בשלב 3.9. (B) החלונית להגדרת פרמטרי סריקת lambda מתאימה לשלב 3.8 בפרוטוקול. (C) הפעל את סריקת lambda בשלב 3.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. פרמטרים להערכת הפיזיולוגיה של Chroothece

1. לאחר רכישת סריקת הלמדא, לחץ על חלון הכימות בחלק העליון של התוכנה (כפי שמוצג באיור 3) כדי להעריך את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי שנאסף. עבור אל חלון פתיחת הפרויקט ובחר קובץ xyλ אחד (איור 3).
2. בחר ניתוח פרופיל מחסנית בתוכנת ההדמיה.
3. הגדר אזור עניין (ROI) של 4 מיקרומטר² במרכז התא כדי לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI). יצא את הנתונים בתבנית CSV.
   הערה: חשוב להימנע מנוכחות פיקסלים שחורים (כדי להבטיח שהפיקסלים שנבחרו מכילים ערכים חיוביים) ולשמור תמיד על החזר השקעה באותו גודל.
4. חזור על תהליך זה עם תאים שונים בתנאים שונים כדי לייצר מספיק נתונים לביצוע ניתוח סטטיסטי.
5. פתחו את קובצי ה-CSV כדי לבחור את שיאי הפלואורסצנטיות השונים מחלבוני הפיקובילין והכלורופילים של כל ה-ROI שנמדדו.
   1. בחר את הנתונים הפלואורסצנטיים של phycoerythrin-phycocyanobilin (PE-PCB; 620 nm), C-phycocyanin (CPC; 648 nm), allophycocyanin (APC; 660 nm) ו- chlorophyll a (Chl a; 680 nm), בהתאמה, בקובץ csv.
6. צור טבלה חדשה עם כל ערכי הפלואורסצנטיות המרביים המתקבלים מכל שיא של פיקובילין וכלורופיל והתווה את הנתונים על גרף.
7. לבצע ניתוח סטטיסטי.
   1. לנתח אם הנתונים המתקבלים עונה על נורמליות הומוסדסטיות²⁷.
   2. המשך לניתוח מבחן t^27,28 אם התנאי הראשון מתקיים. אם לא, הפעל מבחן Mann-Whitney U²⁹.
   3. שקול את ההבדלים משמעותיים בערכי p <0.05.

איור 3: הערכת האוטופלואורסצנטיות של Chroothece. כדי לבצע את ניתוח הפלואורסצנטיות האוטומטית, הקפד לבחור את חלון הכימות וקובץ xyλ אחד בחלון הפרויקטים הפתוחים (שלב 4.1); בחר תצוגה חזותית של פרופיל מחסנית (שלב 4.2); בחר החזר השקעה של 4 מיקרומטר² במרכז התא ולחץ על כפתור הדוח כדי לייצא את נתוני סריקת Lambda בפורמט CSV (שלב 4.3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

כלורופיל A בולע בדרך כלל אורכי גל כחולים ואדומים של אור נראה, בעוד שחלבוני פיקובילין משתמשים באורכי גל ירוקים, צהובים וכתומים⁷. האוטופלואורסצנטיות של פיגמנטים אלה מאפשרת את הגישה הראשונה לחקר חלבוני פיקובילין והתנהגות כלורופיל בתנאי ניסוי ושדה.

על-ידי השוואת הנתונים המתקבלים והתווייתם בגרפים שונים, ניתן להבחין בשינויים משמעותיים בעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI) (איור 4). מחקר סטטיסטי נסתר של שיאי הפליטה השונים שהתקבלו בפרופילי סריקת למדא...

דיון

חלק מהאצות האדומות החד-תאיות או הקולוניאליות, כגון Chroothece, גדלות לאט במבחנה, אך מכילות תרכובות אוטופלואורסצנטיות מרובות שניתן לנתח באמצעות אנליזה ספקטרלית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, שם ניתן לזהות הבדלים בשיאי פליטת פיגמנטים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי ספקטרלי אפשר לנו לערוך מחקרי in vivo כדי להעריך את ההסתגלות או ההתאקלמות של אורגניזמים פוטוסינתטיים 8,10,17,18,19,20.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
&מיקרו;-צלחת 35 מ"מ, עידית תחתית זכוכית גבוהה		81158-24
לוחית באר שחורה	Ibidi	82406	תחתית שטוחה וברורה למיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה
חממת אצות	Panasonic	MLR-352-PE
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי	Leica Microsystems	SP8 TCS-Flask
	Fisher Scientific	15380591	ניתן לרכוש בחנות נוחות מקומית או בחנויות מקוונות.
מסנן ירוק	PNTA, מסנני LEE	-	ניתן לרכוש בחנות נוחות מקומית או בחנויות מקוונות.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	של עדשת טבילה גליצרול
. LAS X	Leica Microsystems	SP8	TCS-מקור
אור	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
פוטורדיומטר קוונטי	DeltaOhm	DO 9721-R
תוכנה	R צוות ליבה, 2020	4.0.2.	-
מסנן אדום	PNTA, מסנני LEE	-	ניתן לרכוש בחנות נוחות מקומית או בחנויות מקוונות.
SWES בינוני	אוניברסיטת מורסיה	-
טבילה נוזלית מסוג G	Leica Microsystems	11513910	גליצרול