מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

Lifang Yu; Yadan Zhang; Mario  Andrea Marchisio

doi:10.3791/64539

מאמר שיטה

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

DOI:

10.3791/64539

⸱

18 באוקטובר 2022

Lifang Yu^*¹ , Yadan Zhang^*¹ , Mario Andrea Marchisio¹

¹School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גנים סינתטיים לשערים בוליאניים ולמעגלים דיגיטליים יש מגוון רחב של יישומים, החל מאבחון רפואי ועד לטיפול סביבתי. גילוי מערכות CRISPR-Cas והמעכבים הטבעיים שלהן - חלבוני האנטי-קריספר (Acrs) - מספק כלי חדש לתכנון ויישום מעגלים דיגיטליים של גנים in vivo . כאן, אנו מתארים פרוטוקול העוקב אחר הרעיון של מחזור ההנדסה הביולוגית "תכנון-בנייה-בדיקה-למידה" ועושה שימוש ב- dCas9/dCas12a יחד עם ה- Acrs המתאימים שלהם כדי ליצור רשתות שעתוק קטנות, שחלקן מתנהגות כמו שערים בוליאניים, ב - Saccharomyces cerevisiae. תוצאות אלה מציינות את המאפיינים של dCas9/dCas12a כגורמי שעתוק. בפרט, כדי להשיג הפעלה מקסימלית של ביטוי גנים, dSpCas9 צריך לקיים אינטראקציה עם RNA פיגום מהונדס שאוסף עותקים מרובים של תחום ההפעלה VP64 (AD). לעומת זאת, dCas12a יאוחה, במסוף C, עם VP64-p65-Rta (VPR) AD חזק. יתר על כן, הפעילות של שני חלבוני Cas אינה משופרת על ידי הגדלת כמות sgRNA/crRNA בתא. מאמר זה גם מסביר כיצד לבנות שערים בוליאניים בהתבסס על אינטראקציית CRISPR-dCas-Acr. תחום קשירת ההורמונים המאוחה AcrIIA4 של קולטן האסטרוגן האנושי הוא הליבה של שער NOT המגיב ל-β-אסטרדיול, בעוד ש-AcrVAs המסונתזים על ידי מקדם GAL1 המושרה מאפשרים לחקות שערי כן ו-NOT עם גלקטוז כקלט. במעגלים האחרונים, AcrVA5, יחד עם dLbCas12a, הראו את ההתנהגות הלוגית הטובה ביותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת 2011, חוקרים הציעו שיטה חישובית ופיתחו תוכנה מתאימה לתכנון אוטומטי של מעגלי גנים סינתטיים דיגיטליים¹. המשתמש היה צריך לציין את מספר הקלטים (שלוש או ארבע) ולמלא את טבלת האמת המעגלית; זה סיפק את כל המידע הדרוש כדי לגזור את מבנה המעגל באמצעות טכניקות מאלקטרוניקה. טבלת האמת תורגמה לשתי נוסחאות בוליאניות בשיטת מפת קרנאו². כל נוסחה בוליאנית מורכבת ממשפטים המתארים פעולות לוגיות (סכום או כפל) בין (חלק) קלטי המעגל ושלילותיהם (הליטרלים). סעיפים, בתורם, מסוכמים (OR) או מוכפלים (AND) כדי לחשב את פלט המעגל. כל מעגל יכול להתממש על פי כל אחת משתי הנוסחאות המתאימות: האחת כתובה בצורת קופה (מכפלה של סכומים) והשנייה בצורת SOP (סכום מוצרים). הראשון מורכב מכפל של סעיפים (כלומר, שערים בוליאניים) המכילים סכום לוגי של הליטרלים. האחרון, לעומת זאת, הוא סכום של סעיפים שבהם מכפילים את המילוליים.

מעגלים חשמליים יכולים להתממש, על קרש לחם, על ידי חיווט פיזי של שערים שונים יחד. הזרם החשמלי מאפשר חילופי אותות בין השערים, מה שמוביל לחישוב הפלט.

בביולוגיה המצב מורכב יותר. שער בוליאני יכול להתממש כיחידת שעתוק (TU; כלומר, הרצף "מקדם-קידוד אזור-מסיים" בתוך תאים איקריוטים), שבו שעתוק או תרגום (או שניהם) מוסדרים. לפיכך, לפחות שני סוגים של מולקולות יוצרים חיווט ביולוגי: חלבוני גורם השעתוק והרנ"א האנטיסנס שאינו מקודד¹.

מעגל דיגיטלי גנטי מאורגן בשתיים או שלוש שכבות של שערים, כלומר: 1) שכבת הקלט, העשויה משערי כן (חיץ) ולא וממירה את כימיקלי הקלט למולקולות חיווט; 2) השכבה הפנימית, המורכבת מכמה TUs שיש סעיפים בנוסחה הבוליאנית המתאימה. אם המעגל מתוכנן על פי נוסחת SOP, כל סעיף בשכבה הפנימית יפיק את פלט המעגל (למשל, פלואורסצנציה) במה שנקרא ארכיטקטורת פלט מבוזר. אם משתמשים בנוסחת המכפלה של סכום (POS), נדרשת שכבה סופית 3), שתכיל שער כפל יחיד האוסף את מולקולות החיווט מהשכבה הפנימית.

בסך הכל, בביולוגיה סינתטית, ניתן לתכנן סכמות רבות ושונות עבור אותו מעגל. הם נבדלים במספר ובסוג של TUs ומולקולות חיווט. על מנת לבחור את הפתרון הקל ביותר ליישום בתאי שמרים, כל תכנון מעגל משויך לציון סיבוכיות S, המוגדר כ

figure-introduction-1

כאשר A מייצג את מספר המפעילים, R מייצג את מספר המדכאים, ו-A הוא כמות מולקולות האנטיסנס RNA. אם מפעילים או מדכאים נעדרים מהמעגל, תרומתם ל-S היא אפס. לכן, קשה יותר לממש סכמת מעגלים במעבדה (S גבוהה) כאשר היא דורשת מספר גבוה של גורמי שעתוק אורתוגונליים. משמעות הדבר היא כי מפעילים ומדכאים חדשים יונדסו דה נובו על מנת לממש את החיווט המלא בתוך המעגלים הדיגיטליים. באופן עקרוני, ניתן להרכיב חלבונים קושרי דנ"א חדשים באמצעות חלבוני אצבע אבץ³ ואפקטי TAL⁴ כתבניות. עם זאת, אפשרות זו נראית מפרכת מדי וגוזלת זמן; לכן, יש להסתמך בעיקר על רנ"א קטן ובקרת תרגום כדי לסיים מעגלי גנים מורכבים.

במקור, שיטה זו פותחה כדי לייצר מעגלים דיגיטליים בחיידקים. ואכן, בתאים איקריוטים, במקום רנ"א אנטיסנס, מתאים יותר לדבר על מיקרו-רנ"א (miRNAs) או על רנ"א מפריע קטן (siRNAs)⁵. עם זאת, מסלול RNAi אינו קיים שמרים S. cerevisiae. לפיכך, יש לבחור ברשתות תמלול מלאות. נניח שמעגל חשמלי זקוק לחמישה מפעילים וחמישה מדכאים; ציון הסיבוכיות שלו יהיה S = 32. ניתן להפחית את מורכבות המעגל על ידי החלפת 10 גורמי השעתוק ב- dCas9⁶ יחיד (Cas9 חסר נוקלאז) המאוחה לתחום הפעלה (AD). כפי שמוצג^ב-7, dCas9-AD פועל כמדכא בשמרים בעת קשירת מקדם בין תיבת TATA ל-TSS (אתר התחלת שעתוק) וכמפעיל בעת קשירה טובה במעלה הזרם של תיבת TATA. לפיכך, ניתן להחליף 10 גורמי שעתוק בחלבון היתוך dCas9-AD יחיד ו-10 sgRNA (RNA מנחה יחיד) לקבלת ציון סיבוכיות כולל של S = 11. זה מהיר וקל לסנתז עשרה sgRNAs, בעוד שכפי שצוין קודם לכן, הרכבה של 10 חלבונים תדרוש עבודה ארוכה ומסובכת הרבה יותר.

לחלופין, ניתן להשתמש בשני חלבוני dCas אורתוגונליים (למשל, dCas9 ו-dCas12a): אחד כדי להתיך לאלצהיימר, והשני חשוף או בשילוב עם תחום דיכוי. ציון הסיבוכיות יגדל ביחידה אחת בלבד (S = 12). לפיכך, מערכות CRISPR-dCas הן המפתח לבניית מעגלים ספרתיים מורכבים מאוד של גנים בשמרי אפייה (S. cerevisiae).

מאמר זה מאפיין באופן עמוק את היעילות של מדכאים ומפעילים מבוססי dCas9 ו-dCas12a בשמרים. התוצאות מראות כי הם אינם דורשים כמות גבוהה של sgRNA כדי לייעל את פעילותם, ולכן פלסמידים אפיזומליים הם העדיפו להימנע. יתר על כן, מפעילים מבוססי dCas9 יעילים הרבה יותר בעת שימוש ב-RNA פיגום (scRNA) המגייס עותקים של VP64 AD. לעומת זאת, dCas12a עובד היטב כאשר הוא מאוחה ישירות ל-VPR AD החזק. יתר על כן, מקדם מופעל סינתטי דורש מספר משתנה של אתרי מטרה, בהתאם לתצורה של מפעיל (למשל, שלושה בעת שימוש dCas12a-VPR, שישה עבור dCas9-VP64, ורק אחד עם dCas9 ו scRNA). כמדחיק, dCas12a נראה נוקב יותר בעת קשירת אזור הקידוד ולא המקדם.

כחיסרון, עם זאת, CRISPR-dCas9/dCas12a אינם מתקשרים ישירות עם כימיקלים. לכן, ייתכן שלא יועיל להם בשכבת הקלט. מסיבה זו נחקרו עיצובי שערים בוליאניים חלופיים המכילים חלבונים אנטי-קריספר (Acrs). Acrs לפעול על (d)Cas חלבונים ולעכב את פעולתם⁸. לפיכך, הם אמצעי לווסת את הפעילות של מערכות CRISPR-(d)Cas. מאמר זה מנתח ביסודיות את האינטראקציות בין סוג II Acrs ו- (d)Cas9, כמו גם סוג V Acrs ו- (d)Cas12a ב- S. cerevisiae. מכיוון ש-Acrs קטנים בהרבה מחלבוני Cas, שער NOT המגיב לאסטרוגן β-אסטרדיול נבנה על ידי איחוי תחום קשירת ההורמונים של קולטן האסטרוגן האנושי 9-HBD(hER)-ל-AcrIIA4. חוץ מזה, קומץ שערים של כן ו-NOT שביטאו dCas12a(-AD) באופן מכונן ו-AcrVAs עם אינדוקציה עם גלקטוז מומשו. כיום, שערים אלה משמשים רק כהוכחת היתכנות. עם זאת, הם גם מייצגים את הצעד הראשון לקראת חשיבה מחודשת עמוקה על האלגוריתם לביצוע התכנון האוטומטי החישובי של מעגלים דיגיטליים של גנים סינתטיים בתאי שמרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון ובנייה של קלטת ביטוי sgRNA/crRNA

הערה: ישנם שני סוגים של קלטות ביטוי sgRNA/crRNA: SNR52¹⁰ המורכב ממקדם SNR52 תלוי RNA פולימראז III, רצף sgRNA/crRNA ומסיים SUP4; מבנה נוסף, המקוצר כ-RGR¹¹, מורכב ממקדם ADH1 תלוי RNA פולימראז II, מבנה RGR (ribozyme-guide RNA-ribozyme) המכיל שני ריבוזימים (ריבוזימי ראש פטיש-HH, וריבוזים-HDV של נגיף הפטיטיס דלתא) ואת רצף ה-sgRNA/crRNA שביניהם, ואת ה-ADH1 terminator. ההומולוגים המנחים את ה-sgRNA Cas9 מורכבים מרצף ספייסר ומהחזרה הישירה האופיינית¹², בעוד שה-crRNA עבור חלבוני Cas12a מורכב מהחזרה הישירה ואחריה מרצף הספייסר^13,14 (ראו טבלה משלימה 1 לכל רצפי הדנ"א ששימשו במחקר זה).

תכנן את רצף הספייסר עבור הפעלת שעתוק בתיווך Cas9/Cas12a.
1. רתום את רצף אופרטורי הלקס החיידקי (הנקרא lexOp) לאתר היעד ^15,16 והכנס אותו למקדם CYC1 המניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר שמרים (yEGFP)¹⁷. לפיכך, רצף הספייסר מוגדר על ידי ומשלים את הלקסופ שהוכנס.
בדוק את האורתוגונליות של רצף הספייסר באמצעות הכלי CRISPRDIRECT¹⁸.
1. הדבק את רצף lexOp שמשני צדדיו רצף PAM בשדה הטקסט, הגדר את רצף PAM כ- NRG עבור dCas9 ו- TTTV עבור dCas12a, וציין את המינים מהרשימה הנפתחת כ - Budding Yeast (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genome. לחץ על עיצוב. ודא שאין אתר יעד תואם בחיפוש 20mer+PAM וגם לא בחיפוש 12mer+PAM.
בנה את קסטת הביטוי sgRNA/crRNA.
1. השתמש ב- touchdown PCR כדי להגביר את רצפי ה- DNA של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים, כמו מקדמים, רצפי קידוד וטרמינטורים.
  1. הכינו תערובת תגובה המכילה: 20-40 ננוגרם של תבנית DNA, 1 μL של פריימר קדמי 10 מיקרומטר (כלומר, ot25, בניית פלסמיד ביטוי sgRNA/crRNA), 1 μL של פריימר הפוך 10 μM (כלומר, ot26, בניית פלסמיד ביטוי sgRNA/crRNA), 5 μL של תערובת dNTP 2.5 mM, 0.5 μL של DNA פולימראז, 10 μL של 5x DNA פולימראז חיץ תגובה, ומים מזוקקים פעמיים (ddH₂O) עד לנפח כולל של 50 μL.
    הערה: עיין בטבלה משלימה 2 לקבלת רשימה של פריימרים ששימשו במחקר זה.
  2. הפעל את תוכנית ה- PCR למגעים על thermocycler:
    שלב 1: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
    שלב 2 עם 10 מחזורים: 98 ° C עבור 10 שניות, 68 ° C עבור 20 שניות, ו 72 ° C עבור 15 שניות.
    שלב 3 עם 25 מחזורים: 98 ° C עבור 10 שניות, 59 ° C עבור 20 שניות, ו 72 ° C עבור 15 שניות.
    שלב 4: 72°C למשך 2 דקות.
    לבסוף, החזק בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לתחילת ניסויי ההמשך.
    הערה: 68°C בשלב 2 ו- 59°C בשלב 3 תלויים בטמפרטורות ההתכה של פריימרים קדמיים והפוכים, המשתנות מזוגות שונים של פריימרים. הזמן ב 72 ° C בשלבים 2 ו -3 נקבע על ידי אורך מוצר PCR ומהירות ה- DNA פולימראז.
2. בודדו את מוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל (100 וולט, 30 דקות). יש להקפיד על רצפי הדנ"א מג'ל האגרוז באמצעות ערכת מיצוי ג'ל DNA (ראו טבלת חומרים).
  הערה: ג'ל אגרוז 0.8% נדרש עבור מקטעים ארוכים מ- 500 nt, ג'ל אגרוז 1.5% עבור מקטעים בין 100 nt ל- 500 nt, וג'ל אגרוז 2% עבור מקטעים קצרים מ- 100 nt.
3. הכנס את TU המבטא sgRNA/crRNA לווקטור מעבורת pRSII404/424¹⁹, המכיל את הגן לעמידות לאמפיצילין ואת גן הסמן האוקסוטרופי הניתן לבחירת שמרים - TRP1.
  1. עכל את וקטור המעבורת ב 37 ° C במשך 1 שעה עם שני אנזימי הגבלה SacI ו Acc65I. הכינו את תערובת התגובה על ידי הוספת 5 מיקרוגרם של וקטור המעבורת, כמויות האנזימים המומלצות, חיץ העיכול (בהתאם להוראות האנזים) ו- ddH₂O עד לנפח כולל של 30 מיקרוליטר.
  2. ודא את העיכול הווקטורי של המעבורת באמצעות אלקטרופורזה בג'ל (ראה שלב משנה 1.3.2). לאחר מכן, נטרלו את שני האנזימים בטמפרטורה של 65°C למשך 20 דקות.
  3. השתמש בשיטת ההרכבה²⁰ של גיבסון כדי להחדיר את מוצרי ה-PCR המטוהרים לווקטור המעבורת החתוך-פתוח על ידי הכנסת תערובת ה-DNA השווה ב-50°C למשך שעה אחת.
  4. התמירו תאים מוכשרים Escherichia coli DH5α עם תערובת תגובת גיבסון לעיל באמצעות שיטת טרנספורמציית הלם חום²¹. העבירו את תאי E. coli שעברו טרנספורמציה על לוחות אגר Luria-Bertani (LB) המכילים אמפיצילין ( 0.1 גרם / ליטר). הכניסו את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ותנו לתאים לגדול בן לילה.
  5. בחרו ארבע מושבות מצלחת האגר LB ותרבו אותן בנפרד למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C בתמיסת LB המכילה אמפיצילין (0.1 גרם לליטר). לאחר מכן, השתמש בהליך הכנה מיני כדי לחלץ פלסמידים מתאי E. coli ²².
  6. השתמש בפריימרים ot18 ו- ot19 (ראה טבלה משלימה 2 עבור רצפי אוליגו) כדי לרצף ולאשר את יחידת השעתוק שהוכנסה באמצעות שיטת Sanger²³.
    הערה: בניסויים מאוחרים יותר, הפלסמידים הבנויים והמאושרים יוכנסו לגנום השמרים באמצעות פרוטוקול PEG/LiAc²⁴.

2. תכנון ובניית קלטת ביטוי RNA פיגום

הערה: הרנ"א מדריך הפיגום (scRNA) מורכב מרצף sgRNA וממבני סיכות הראש MS2²⁵. שני סוגים של מבני סיכות ראש MS2 משמשים בעבודה זו: סיכת שיער MS2 מסוג פראי, וחלבון מעיל f6 MS2 (MCP) aptamer-f6.

סנתז תבנית scRNA המסוגלת להכיל רצפי ספייסר שונים (כלומר, pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
הערה: במחקר זה, תבנית scRNA סונתזה על ידי חברת סינתזת גנים (ראה טבלת חומרים).
תכנן פריימרים מתאימים (ראה טבלה משלימה 2) כדי להריץ PCR על רצפי הספייסר הדרושים.
בצע את ההליכים בשלב 1.3 כדי לבנות קלטת ביטוי scRNA.

3. dSpCas9 הנדסת ובניית פלסמיד ביטוי

השג את pTPGI_dSpCas9_VP64 הפלסמיד (ראה טבלת חומרים).
בנה את וקטור הקבלה pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, בהתבסס על וקטור המעבורת pRSII406, באמצעות touchdown PCR ושיטת ההרכבה של Gibson (עיין בשלב 1.3). הפלסמיד מספק מקדם מכונן חזק-pGPD, וטרמינטור-CYC1t.
עכל את הפלסמיד pTPGI_dCas9_VP64 ואת וקטור המקבל החדש שנבנה (5 מיקרוגרם עבור 1 שעות או 10 מיקרוגרם עבור לילה - ראה שלב 1.3.3.1 כהפניה) עם XbaI ו- XhoI ב 37 ° C. הפרד וטהרה את קטע ההוספה ואת וקטור המקבל כמו בשלב 1.3.2.
קשרו את מקטע ההוספה המטוהר ואת וקטור הקבלה עם ליגאז T4 DNA ב 16 °C במשך 8 שעות. הכן את תמיסת הקשירה על ידי הוספת 50-100 ננוגרם של וקטור המקבל המטוהר, מקטעי מטרה מטוהרים בכמות שווה ערך עם וקטור המקבל, 1.5 מיקרוליטר של חיץ T4, 0.5 מיקרוליטר של ליגאז T4 ו- ddH₂O עד לנפח כולל של 15 מיקרוליטר.
בצע את שלבים 1.3.3.3 ו- 1.3.3.4. לאחר מכן, ודא כי פלסמיד שנבנה לאחרונה נכון על ידי עיכול עם XbaI ו Xhol (37 ° C, 1 שעות) אלקטרופורזה ג'ל (ראה שלב 1.3.2).

4. dCas12a הנדסה ובניית פלסמיד

בנו את הפלסמידים המבטאים dCas12a-AD.
1. סנתז שני חלבוני dCas12a ממוטבים לקודון שמרים (denAs12a ו-dLbCas12a) שמשני צדיהם אתרי אנזימי הגבלה BamHI ו-Xhol.
  הערה: במחקר זה, שני חלבוני dCas12a המותאמים לקודון שמרים סונתזו על ידי חברת סינתזת גנים (ראה טבלת חומרים).
2. בנה את וקטור הקבלה pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 באמצעות touchdown PCR ושיטת ההרכבה של גיבסון (ראה שלב 1.3), כאשר "מקדם" הוא pGPD או pGAL1, "sp" מייצג רצף אקראי קצר, ו- "AD" הוא VPR או VP64.
3. הכנס כל חלבון dCas12a לשני וקטורי הקבלה החדשים שנבנו באמצעות עיכול עם BamHI ו- XhoI וקשירה עם ליגאז DNA T4 (עיין בשלבים 3.3 ו- 3.4).
בנו את הפלסמידים המבטאים dCas12a חשוף.
1. בנה וקטור מקבל עבור קלטות הביטוי המושרות בגלקטוז של dCas12a כ- pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t באמצעות touchdown PCR ושיטת ההרכבה של גיבסון (ראה שלב 1.3).
2. עכל את הפלסמידים המכילים את חלבוני dCas12a ואת וקטור הקבלה לעיל עם BamHI ו- Xhol, ולאחר מכן קשר אותם עם ליגאז DNA T4 כדי לקבל את פלסמיד pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (עיין בשלבים 3.3 ו- 3.4).
3. עכל את הפלסמיד שהתקבל בשלב 4.2.2 עם Acc65I ו- BamHI, ולאחר מכן החלף את pGAL1 ב- pGPD באמצעות PCR טאצ'דאון ושיטת ההרכבה של גיבסון לבניית pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. הנדסת חלבונים אנטי-קריספר ובניית פלסמיד

הערה: שלושה סוגים של מקדמים שימשו כדי להניע ביטוי Acrs: מקדם אינדוקטיבי-pGAL1, ארבעה מקדמי שמרים-pGPD, pACT1, pTEF1 ו-pTEF2, ומקדם מכונן סינתטי-genCYC1t_pCYC1noTATA²⁶.

השג את הפלסמידים המכילים את הרצפים של Acrs מסוג II (AcrIIA2, AcrIIA4²⁷ ו- AcrIIA5 28) ו- V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 ו- AcrVA5²⁹) מחברת סינתזת גנים.
בנה את הפלסמידים בהתבסס על וקטור המעבורת pRSII403 כדי לבטא Acrs.
1. בניית קלטות ביטוי AcrIIA.
  הערה: השתמש ב-touchdown PCR כדי להגביר ארבעה מקדמים שונים (כלומר, pGPD, pACT1, pTEF2 ו-genCYC1t_pCYC1noTATA), שלושת סוגי AcrIIA ושני טרמינטורים (ADH1t ו-CYC1t). בנה סדרה של TUs המבטאים AcrIIAs, תחת מקדמים שונים, באמצעות שיטת ההרכבה של גיבסון (עיין בשלב 1.3).
2. בניית קלטות ביטוי AcrVA.
  1. סנתז את רצף המקבלים: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, כאשר "sp" הוא רצף אקראי שיוחלף על ידי AcrVAs מאוחר יותר.
    הערה: במחקר זה, רצפי הקבלה סונתזו על ידי חברת סינתזת גנים (Table of Materials).
  2. הרכיבו את וקטורי הקבלה pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, כאשר ה"מקדם" הוא: pGAL1, pTEF1 ו- genCYC1t_pCYC1noTATA. השתמש בשיטת ההרכבה של Gibson (עיין בשלב 1.3).
  3. הכנס כל אחד משלושת ה- AcrVAs לווקטור הקבלה המתואר בשלב 5.2.2.2 (באמצעות touchdown PCR ושיטת ההרכבה של Gibson [ראה שלב 1.3]) כדי לבנות קבוצה של פלסמידים המייצרים AcrVAs.
מהנדס נוסף AcrIIA4 על ידי הרחבת הרצף שלו עם הרצפים של מקשר GS ו- HBD (hER). זה מאפשר בניית מעגל מגיב β אסטרדיול.
1. השתמש ב-touchdown PCR כדי להשיג חלקי GS-HBD ו-AcrIIA4 בנפרד (ראה שלב 1.3.1).
2. הכניסו את AcrIIA4, GS-HBD ואת וקטור המעבורת לתוך תערובת גיבסון ובנו את הפלסמיד המלא בשיטת גיבסון (ראו שלב 1.3.3).

6. זיהוי crRNA: RT-qPCR ועיצוב פריימרים

הערה: זיהוי crRNA הושג באמצעות RT-qPCR, אשר מאורגן בשלושה שלבים.

בצעו את מיצוי וטיהור ה-RNA מתאי שמרים באמצעות ערכת RNA.
1. תאי שמרים בתרבית לילה ב-2 מ"ל של מדיום שלם סינתטי מוגדר (SDC, נפח 1 ליטר: 20 גרם גלוקוז, 2 גרם תערובת AA, 6.7 גרם YNB, 396 מ"ג לאוצין, 79.2 מ"ג טריפטופן, 79.2 מ"ג היסטידין ו-79.2 מ"ג אורציל) באמצעות צלחת 24 בארות (240 סל"ד, 30 מעלות צלזיוס).
2. בבוקר, לדלל את תרבית התאים (1:100) לתוך 2 מ"ל של SDC טרי ולהמשיך לגדל את תאי השמרים ב 30 ° C, 240 סל"ד, במשך 4 שעות נוספות.
3. קצרו את כל 2 מ"ל של תמיסת התא והצנטריפוגה במהירות של 20,238 x גרם למשך 2 דקות. הסר את הסופרנאטנט בזהירות מכיוון שכדורית התא קטנה.
4. חלצו את הרנ"א מתאי שמרים באמצעות ערכת RNA.
5. בדוק את איכות ה- RNA.
  1. הכינו ג'ל אגרוז 1%. ערבבו 5 μL מכל דגימת RNA עם 1 μL של צבע טעינת DNA. לאחר מכן לטעון את התערובת על ג'ל ולהפעיל אותו.
  2. ודא ששני פסים שקופים ב~4,000 nt ו- ~2,000 nt, המתאימים ל- RNA ריבוזומלי (25S/18S), נמצאים על הג'ל. ניתן לראות פס מטושטש נוסף ב~80 nt עבור tRNA.
6. השתמש בדגימות RNA באופן מיידי לסינתזה cDNA או אחסן אותן ב -80 ° C לשימוש עתידי.
שעתוק הפוך: השתמש בשיטת לולאת גזע³⁰ כדי ליצור את הגדיל הראשון של cDNA המתאים ל- crRNA (40 nt). עבור שעתוק לאחור של sgRNA (כמעט 100 nt), ההליך זהה לזה של סינתזת cDNA של גן הייחוס ACT1.
הערה: השיטה לשעתוק לאחור של crRNA שונה מזו המשמשת עם sgRNA ו- ACT1 mRNA. מכיוון שה-crRNA קצר מאוד, התייחסו אליו כאל מיקרו-רנ"א והשתמשו בשיטת השעתוק ההפוך של המיקרו-רנ"א (גישת לולאת גזע) כדי להשיג את ה-cDNA המתאים. שתי ערכות סינתזת cDNA (ערכת לולאת גזע עבור crRNA וערכת שעתוק לאחור רגילה עבור הגן ACT1 ) שימשו לכימות crRNA. אותה כמות של רנ"א שימשה בשתי הערכות (ראו טבלת חומרים) כדי להפוך את תוצאות הניסוי לדומות. הפריימר ששימש עם ערכת לולאת הגזע תוכנן על פי רצף לולאת הגזע וששת הנוקלאוטידים האחרונים בקצה 3' של crRNA (עבור רצף לולאת גזע ופריימר, ראה טבלה משלימה 2).
1. שיטת לולאת גזע לשעתוק לאחור crRNA
  1. הוציאו את תבנית הרנ"א, הפריימר והמאגרים מהמקפיא ותנו להם להימס על קרח.
  2. הסרת DNA גנומי: ראשית, הכינו 10 μL של תערובת התגובה בהתאם להוראות הערכה. שים את התערובת במחזור תרמי ב 42 ° C למשך 2 דקות. לבסוף, העבירו אותו על קרח.
  3. סינתזה של גדיל cDNA הראשון: הכינו 20 μL של תערובת התגובה על ידי הוספת 10 μL של התערובת משלב 6.2.1.2, 1 μL של פריימר לולאת גזע (ריכוז 2 μM), 2 μL של 10x RT reaction buffer, 2 μL של תערובת אנזימי שעתוק לאחור (המכיל את השעתוק ההפוך), ו-5 μL של H₂O נטול RNase.
  4. הניחו את תערובת התגובה במחזור תרמי והפעילו את התוכנית הבאה: 25°C למשך 5 דקות, 50°C למשך 15 דקות ו-85°C למשך 5 דקות. השתמש במוצר לתגובת qPCR באופן מיידי או אחסן אותו ב -80 ° C.
2. sgRNA ו - ACT1 mRNA שעתוק לאחור
  1. תגובה ראשונה: הכינו תערובת של 13 μL המורכבת מתערובת פריימר, תערובת dNTP, תבנית RNA (50 pg-5 μg) ומים נטולי RNase (מלבד תבנית RNA, כולם מסופקים על ידי הערכה), בהתאם להוראות הערכה. השתמש 1 מיקרוגרם של תבנית RNA. הכניסו את התערובת למחזור תרמי בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות.
  2. תגובה שנייה (סינתזת cDNA): הכינו את תערובת התגובה על ידי הוספת הריאגנטים (כמתואר בהוראות הערכה) ל-13 μL של תמיסת התגובה הראשונה עד לנפח סופי של 20 μL. הניחו את התערובת במחזור תרמי למשך 15 דקות ב-50°C ולאחר מכן למשך 5 דקות נוספות ב-85°C. השתמש במוצר לתגובת qPCR באופן מיידי או אחסן אותו ב -80 ° C.
ערכת SYBR עבור qPCR: זיהוי ערך Ct
הערה: הפריימר ההפוך המשמש ב- qPCR של crRNA קבוע מכיוון שהוא מתאים להשלמה ההפוכה של רצף לולאת הגזע (ראה טבלה משלימה 2). הפריימר הקדמי, לעומת זאת, משתנה ותלוי ברצף של crRNA. הפריימרים קדימה ואחורה עבור sgRNA ו - ACT1 mRNA qPCR מתוכננים https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. שני פריימרים נבחרים כאשר ההפרש בין טמפרטורות ההתכה שלהם אינו גדול מ- 2 מעלות צלזיוס (ראה טבלה משלימה 2). כל דגימה נמדדת בשלושה עותקים משוכפלים.
1. הכן את תערובת התגובה qPCR בהתאם להוראות היצרן עבור ערכת SYBR.
2. הגדר את תוכנית qPCR הבאה במכשיר PCR בזמן אמת.
  דגירה: 10 דקות ב 95 ° C.
  שלב PCR: 15 שניות ב 95 ° C, ואחריו 34 s ב 55 ° C. הגדר את מחזור שלב ה- PCR ל- 45 פעמים. שלב ההתכה: 10 שניות ב 95 ° C, ואחריו 60 s ב 65 ° C, ולבסוף 1 s ב 97 ° C.
3. חשב את ערכי ביטוי ה- mRNA היחסיים באמצעות נוסחת Pfaffl³¹.

7. Immunofluorescence כדי לזהות חלבונים Cas

הערה: חלבוני Cas (CasP) מאוחים His_tag.

הכנת תאי שמרים
1. בחרו כמה תאי שמרים באמצעות לולאה סטרילית ותרבו אותם ב-5 מ"ל של מדיום עשיר ב-YPD למשך הלילה ב-240 סל"ד ב-30°C. בבוקר, להוסיף 500 μL של תמיסת התא ל 20 מ"ל של YPD טרי ולגדל אותם ב 240 סל"ד ב 30 ° C עד OD₆₀₀ מגיע 0.6.
2. קח 5 מ"ל של התרבית ולערבב אותו עם 500 μL של 37% פורמלדהיד. הניחו לתערובת להישאר בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות. קצרו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1,500 x גרם למשך 5 דקות.
3. הסר את supernatant ו resuspend את התאים עם 1 מ"ל של חיץ קיבוע (0.1 M KH 2 PO₄, 0.5 M MgCl₂, 3.7% פורמלדהיד, pH = 6.5). שמור את תמיסת התא ב- RT למשך 20 דקות.
4. צנטריפוגה את תמיסת התא ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את התאים ב-1 מ"ל של חיץ כביסה (0.1 M KH 2 PO 4,_1.2M סורביטול, pH = 6.5) בתוספת 4 μL של בטא-מרקפטואתנול_ו-4 μL של תמיסת ליזט (5 מ"ג/מ"ל). הכנס את תמיסת התא לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
5. צנטריפוגה את תמיסת התא ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. שטפו את גלולת התא פעמיים עם 1 מ"ל PBS באמצעות צנטריפוגה (1,500 x גרם למשך 5 דקות).
6. להשהות מחדש את התאים ב 100 μL של PBS בתוספת 0.05% Tween 20 ולהוסיף 4 μL של תמיסת BSA (10 מ"ג / מ"ל). שמור את תמיסת התא ב- RT למשך 20 דקות.
דגירה עם נוגדן ראשוני
1. הוסף את הנוגדן העיקרי Anti-His tag לתערובת בשלב 7.1.6 בדילול של 1:400. שמור את הפתרון ב- RT למשך שעתיים.
2. צנטריפוגו את התערובת בשלב 7.2.1 במהירות של 1,500 x גרם למשך 5 דקות והסירו את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל PBST וצנטריפוגה (1,500 x גרם) למשך 5 דקות כדי לשטוף את גלולת התא. חזור על פעולה זו פעמיים. לבסוף, להשליך את supernatant ולהשעות את התאים ב 100 μL של 1x PBST.
זיהוי תאי מיקרוסקופיה
1. הר את התאים בשקופית; קח 2 μL של תמיסת התא משלב 7.2.2 והנח אותו על מגלשת זכוכית. כסו אותו בכיסוי.
2. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי, המיקרוסקופ והמחשב. רשום את מספר מקור האור הפלואורסצנטי ופתח את תוכנת המיקרוסקופ במחשב.
3. שים את השקופית על במת המיקרוסקופ. בחר עדשה אובייקטיבית 40x והתבונן בתאים תחת האור הירוק (550 ננומטר). הזיזו את ידית המיקוד הגסה עד להופעת קווי המתאר של תאי השמרים. הזז את ידית המיקוד העדינה כדי למקד את התאים.
4. זהה את התאים באמצעות תוכנת המיקרוסקופ. סגור את שדה הראייה של המיקרוסקופ ועבור למסך המחשב. לחץ על שידור חי, המתן 3-5 שניות ולחץ על צלם כדי לצלם תמונה. שמור את התמונה.
5. כבה את המחשב, המיקרוסקופ ומקור האור הפלואורסצנטי.

8. רכישת נתונים: FACS

הערה: פלואורסצנטיות ירוקה מזוהה באמצעות ציטומטריית זרימה (כלומר, מדידות מיון תאים המופעלות על ידי פלואורסצנטיות [FACS]). תאי שמרים מתורבתים, באופן כללי, ב 30 ° C ו 240 סל"ד כדי להפעיל ניסויים FACS. עם זאת, תאים עשויים לדרוש כמה אמצעי זהירות בהתאם לתוכן הגנטי שלהם. תאים המכילים את הגן dCas12a-VPR (הנשלט על ידי מקדם המכונן GPD ) חייבים להיות מגודלים במשך 24 שעות בתמיסת SDC. לאחר מכן, התאים מדוללים ביחס של 1:100 ב-SDC טרי ומגודלים במשך 12 שעות נוספות לפני מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות. תאים שעברו שינוי עם הגן AcrIIA4-HBD(hER) דורשים דילול גם כן. יתר על כן, OD₆₀₀צריך להיות נשלט. ראשית, התאים מורשים לגדול SDC בן לילה (מעל 14 שעות). בבוקר, OD₆₀₀ נמדד. לאחר מכן התרבות מדוללת ב- SDC, המסופקת עם ריכוז מגוון של β-אסטרדיול, עד OD₆₀₀= 0.1. לפני ניסויי FACS, התאים גדלים במשך 7 שעות נוספות, כך OD₆₀₀ מגיע 0.8-1.0. תאים המבטאים dCas9-VP64 או dCas12a-VP64 גדלים ב-SDC למשך 20-24 שעות ללא דילול וצמיחה נוספת לפני המדידות במכונת FACS.

הפעל את מכשיר FACS 20 דקות לפני המדידות כדי לחמם את הלייזר.
הכן את הדגימות (דילול): מערבבים 20 μL של תרבית התא עם 300 μL של ddH₂O.
הפעל את תוכנת FACS במחשב המחובר למחשב FACS וצור ניסוי חדש. הגדר את פרמטרי המדידה (כלומר, FSC(SSC)-A/H/W והיסטוגרמה).
בחר את המסנן בהתאם לאורכי גל העירור והפליטה של הדגימות. לדוגמה, חלבון המטרה כאן הוא yEGFP, שאורכי גל העירור והפליטה שלו הם 488 ננומטר ו-507 ננומטר, בהתאמה. לכן, בחר את מסנן FITC או GFP (אורך גל עירור: 488 ננומטר; אורך גל פליטה: 527/32 ננומטר). הגדר את מספר תא הרכישה ל- 10,000.
כוונן את מתח מסנן FITC על ידי מדידת עוצמת החרוזים הפלואורסצנטיים. ודא שההבדל היחסי בעוצמת החרוזים בין שני ניסויים עוקבים אינו עולה על 5%.
שטפו את המכונה עם ddH₂O למשך מספר שניות כדי להסיר חרוזים עודפים אפשריים.
מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של הדגימה. לחץ על תצוגה מקדימה והמתן 3-5 שניות ליציבות הזרקת הדגימה. לבסוף, לחץ על Acquire.
מדדו שוב את החרוזים בסוף הניסוי. המתח הוא זה ששימש במהלך מדידת החרוזים הראשונית (ראה שלב 8.4, 438-441 V). בדקו האם ההפרש היחסי בין המידות של שני החרוזים עולה על 5%.
יצא את נתוני FACS כקבצי FCS.
נתח את קבצי FCS באמצעות תוכנת R Studio.

9. ניתוח נתונים

הערה: השתמש בחבילת Flowcore R Bioconductor ³² בתוך סטודיו R. קבצי FCS נותחו באמצעות סקריפט שנכתב בשפת R.

פתח את סטודיו R וטען את ניתוח הסקריפט Bdverse. R כדי לנתח את קבצי FCS.
הגדר את שם הניסוי (ename), את הספרייה (נתיב) שבה נמצאים קובצי FCS
מאוחסן (dir_d), והיכן ייווצרו קבצי התוצאה (dir_r).
הגדר את תעלת הפלואורסצנטיות. לדוגמה, select_ch = "GPA-A" אם נמדדה פלואורסצנטיות ירוקה.
הגדר את מספר הדגימות שנמדדו (s_num).
הגדר את המידות של כל תרשים נקודה (sxlim, sylim). הגדר את האורך המרבי של ציר x ו- y עבור תרשימי עמודות ותרשימי תיבות (xlimit, ylimit). xlimit חייב להיות גדול או שווה ל- s_num.
בחר בשיטת gating על-ידי הסרת # מהשורות המתאימות.
הערה: morphGate היא שיטת gating אוטומטית המבוצעת על ידי הסקריפט (כלומר, האזור של חלקות הנקודות שבו התאים צפופים יותר מזוהה ונבחר על ידי התוכנית). מצולע ו-rectangleGate דורשים להסתכל על חלקות הנקודות ולהגדיר את קודקודי המצולע או את הצד של מלבן החובק את האזור שבו נמצאים רוב התאים.
בחר באובייקט flowSet עם גייט, המתאים לשיטת gating שנבחרה. בחר ברזולוציית התוויית הנקודות (res; צריכה להיות שווה לפחות ל- 256).
בטל את ההערה flt_low <- filter_low(sp) כדי להסיר מדידות שבהן הפלואורסצנטיות שלילית. בטל תגובה flt_sp <- filter(flt_lw) כדי להסיר חריגים עקב ניסויים אחרים.
הקש מקור והפעל את קובץ ה-script. כל הקבצים המכילים את תוצאות הניתוח נוצרים ב - dir_r.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי sgRNA/crRNA על ידי מקדם RNA פולימראז מסוג III
ראשית, עבודה זו התייחסה להנדסה של מעגל הפעלת השעתוק (מעגל 1) המוצג באיור 1A. הוא הכיל שלושה מרכיבים בסיסיים: 1) הגן המקודד ל-yEGFP (המדווח), שקדמו לו סדרה של מקדמים סינתטיים שונים שסיפקו אתרי מטרה עבור dCas9/dCas12a-AD; 2) גרסה ממוטבת קודון שמרים של dCas9 או dCas12a המאוחה לתחום הפעלה (VP64 ו-VPR, בהתאמה) ומכילה רצף לוקליזציה גרעיני אחד או שניים (NLS). שני חלבוני dCas הופקו על ידי מקדם מכונן חזק - pGPD; ו-3) רצף sgRNA/cr...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הראה זרימת עבודה מלאה אפשרית עבור מעגלים דיגיטליים של גנים סינתטיים, לאחר מחזור ההנדסה הביולוגית "תכנון-בנייה-בדיקה-למידה" (DBTL) ובנוגע לניסויי מעבדה יבשה ומעבדה רטובה. כאן, התמקדנו במערכת CRISPR-Cas, בעיקר dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a וחלבוני האנטי-קריספר המתאימים, על ידי תכנון ובנייה ברשתות שעתוק קטנות של S. cerevisiae. חלקם חיקו שערים בוליאניים, שהם המרכיבים הבסיסיים של מעגלים דיגיטליים. כל המעגלים המתוארים כאן אפשרו לנו לתאר את התכונות והתכונות של חלבונים הקשורים לקריספר ואנטי-קריספר בשמרי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות לכל הסטודנטים במעבדה לביולוגיה סינתטית - SPST, TJU - על עזרתם הכללית, יחד עם ג'י לי ושיאנגיאנג ז'אנג על עזרתם בניסויי FACS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.1 מ"ל PCR 8 רצועות צינורות	NEST	403112
0.2 מ"ל צינורות PCR	Axygen	PCR-02-C
1.5 מ"ל מיקרו-צינורות	Axygen	MCT-150-C
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה	BIOFIL	CFT011150
2 מ"ל מיקרו-צינורות	Axygen	MCT-200-C
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל	BIOFIL	CFT011500
ביולוגיה מולקולרית אגרוזית-מולקולרית כיתה	Invitrogen	75510-019
מלח נתרן Ampicillin	Solarbio	69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well תרמי	Cycler Thermo Fisher Scientific	4375786
ערכת מיצוי ג'ל DNA AxyPrep	Axygen	AP-GX-250
BD FACSuite CS& המגבר; חרוזי מחקר T	BD	650621	חרוזי פלואורסצנט
BD FACSציטומטר זרימה מסחרית
	Eppendorf	5424
צנטריפוגה סורוול ST 16R	תרמו פישר Scientific	75004380
E. coli תאים מוכשרים (זן DH5α)	Life Technologies	18263-012
ECL בחר ריאגנט לזיהוי כתמים מערביים	Healthcare	RPN2235
מכשיר אלקטרופורזה	בייג'ינג JUNYI אלקטרופורזה ושות', בע"מ	JY300C
כובעים שטוחים 8 רצועות	NEST	406012
חברת סינתזת גנים	Azenta מדעי		החייםhttps://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11004
HiFiScript cDNA ערכת סינתזה	CWBIO	CW2569M	ערכת בשימוש בשלב 6.2.2.1
תמיסת ליזאט (זימוליאז)	zymoresearch	E1004-A
ניקון Eclipse 80i מיקרוסקופ פלואורסצנטי	ניקון	-	מיקרוסקופ פלואורסצנטי
טיפים לפיפט— 10 μ L	Axygen	T-300-R-S
טיפים לפיפטים— 1000 μ L	Axygen	T-1000-B-R-S
טיפים לפיפטים— 200 μ L	Axygen	T-200-Y-R-S
pRSII403	Addgene	35436
pRSII404	Addgene	35438
pRSII405	Addgene	35440
pRSII406	Addgene	35442
pRSII424	Addgene	35466
pTPGI_dSpCas9_VP64	Addgene	49013
Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוהה	ניו אינגלנד Biolabs	M0491
אנזים הגבלה-Acc65I	ניו אינגלנד Biolabs	R0599
אנזים הגבלה-BamHI	ניו אינגלנד Biolabs	R0136
אנזים הגבלה-SacI-HF	ניו אינגלנד Biolabs	R3156
אנזים הגבלה-XhoI	ניו אינגלנד ביולאבס	R0146
רוש לייטסייקלר 96	PCR בזמן אמת	של Roche
S. cerevisiae CEN. PK2-1C	-		זן ההורה. הגנוטיפ הוא: MATa; his3D1; leu2-3_112; URA3-52; TRP1-289; MAL2-8c;
ערכת לולאת גזע	SparkJade	AG0502	ערכת בשימוש בשלב 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	186-1096
T4 DNA ligase	ניו אינגלנד Biolabs	M0202
T5 Exonuclease	ניו אינגלנד Biolabs	M0363
Taq DNA ligase	ניו אינגלנד Biolabs	M0208
Taq DNA פולימראז	ניו אינגלנד Biolabs	M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2x) (צבע SYBR ירוק I)	Takara	RR820Q
ערכת רנ"א YeaStar	Zymo Research	R1002
β-אסטרדיול	סיגמא-אולדריץ'	E8875

BD-צנטריפוגה GE מכשיר SUC2

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).
Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).
Mandell, J. G., Barbas, C. F. Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases. Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).
Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
Drinnenberg, I. A., et al. RNAi in budding yeast. Science. 326 (5952), 544-550 (2009).
Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates. Nature Communications. 8, 15459(2017).
Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas. ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).
Nakamura, M., et al. Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells. Nature Communications. 10 (1), 194(2019).
Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131 (1), 129-134 (1993).
DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
Gao, Y., Zhao, Y. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
Yu, L., Marchisio, M. A. Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins. ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).
Zhang, Y., Marchisio, M. A. Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).
Sheff, M. A., Thorn, K. S. Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).
Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
Chee, M. K., Haase, S. B. New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae. G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).
Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).
Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. Fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
Sanger, F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).
Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
Zalatan, J. G., et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).
Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits. Journal of Biological Engineering. 10, 19(2016).
Rauch, B. J., et al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).
Hynes, A. P., et al. An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9. Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).
Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science. 362 (6411), 236-239 (2018).
Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179(2005).
Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
Hahne, F., et al. flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry. BMC Bioinformatics. 10 (1), 106(2009).
Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae. Journal of Biological Engineering. 12, 11(2018).
Dong, L., et al. An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

dCas9 dCas12a VPR Gibson Assembly

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים