Method Article

הערכת התכונות האנטי-קריפטוקוקליות המשוערות של תמציות גולמיות ומזוקקות מרכיכות

DOI:

10.3791/64540

⸱

December 2nd, 2022

 ,  ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph, 2School of Environmental Sciences, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפתוגן הפטרייתי האנושי Cryptococcus neoformans מייצר מגוון גורמים אלימים (למשל, פפטידאזות) כדי לקדם את הישרדותו בתוך הפונדקאי. נישות סביבתיות מייצגות מקור מבטיח של מעכבי פפטידאז טבעיים חדשים. פרוטוקול זה מתאר את הכנת התמציות מרכיכות ואת הערכת השפעתן על ייצור גורמי אלימות פטרייתיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אנושי עטוף עם תפוצה עולמית המדביקה בעיקר אנשים מדוכאי חיסון. השימוש הנרחב בתרופות אנטי-פטרייתיות במסגרות קליניות, השימוש בהן בחקלאות והכלאת זנים הובילו לאבולוציה מוגברת של עמידות. שיעור עולה זה של עמידות נגד אנטי פטרייתיות הוא דאגה גוברת בקרב רופאים ומדענים ברחבי העולם, ויש דחיפות מוגברת לפתח טיפולים אנטי פטרייתיים חדשניים. לדוגמה, C. neoformans מייצר מספר גורמי אלימות, כולל אנזימים תוך-תאיים וחוץ-תאיים (למשל, פפטידאזות) עם תפקידים בפירוק רקמות, ויסות תאי ורכישת חומרים מזינים. ההפרעה לפעילות פפטידאז כזו על ידי מעכבים מפריעה לגדילה ולשגשוג של פטריות, מה שמרמז על כך שזו עשויה להיות אסטרטגיה חשובה למאבק בפתוגן. חשוב לציין, חסרי חוליות כגון רכיכות מייצרים מעכבי פפטידאז עם יישומים ביו-רפואיים ופעילות אנטי-מיקרוביאלית, אך הם אינם נחקרים מספיק במונחים של השימוש בהם נגד פתוגנים פטרייתיים. בפרוטוקול זה, בוצע מיצוי גלובלי מרכיכות כדי לבודד מעכבי פפטידאז פוטנציאליים בתמציות גולמיות ומזוקקות, והוערכו השפעתם נגד גורמי אלימות קריפטוקוקליים קלאסיים. שיטה זו תומכת בתעדוף רכיכות בעלות תכונות אנטי פטרייתיות ומספקת הזדמנויות לגילוי חומרים אנטי-אלימים על ידי רתימת המעכבים הטבעיים הנמצאים ברכיכות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אנושי המייצר מחלה קשה אצל מארחים מדוכאי חיסון, כגון אנשים החיים עם HIV / איידס1, ומוביל לכ -19% ממקרי המוות הקשורים לאיידס2. הפטרייה רגישה למספר סוגים של אנטי פטרייתיות, כולל אזולים, פולינים ופלוציטוזין, המפעילים פעילות קוטלת פטריות ופטריות באמצעות מנגנונים נפרדים 3,4. עם זאת, השימוש הנרחב באנטי-פטרייתיות בסביבה קלינית וחקלאית בשילוב עם הכלאת זנים הגבירו את התפתחות העמידות במינים פטרייתיים רבים, כולל C. neoformans5.

כדי להתגבר על האתגרים של עמידות נגד פטריות ולהפחית את השכיחות של זיהומים פטרייתיים בקנה מידה עולמי, גישה מבטיחה היא להשתמש בגורמי האלימות של Cryptococcus spp. (למשל, יכולת הסתגלות לטמפרטורה, כמוסה רב-סוכרית, מלנין ואנזימים חוץ-תאיים) כמטרות טיפוליות פוטנציאליות 4,6 . לגישה זו מספר יתרונות, שכן גורמי אלימות אלה מאופיינים היטב בספרות, ומיקוד גורמים אלה עשוי להפחית את שיעורי העמידות האנטי פטרייתית על ידי הטלת לחץ סלקטיבי חלש יותר באמצעות פגיעה באלימות במקום להתמקד בצמיחת תאים6. בהקשר זה, מחקרים רבים העריכו את האפשרות להתמקד באנזימים חוץ-תאיים (למשל, פרוטאזות, פפטידאזות) כדי להפחית או לעכב את האלימות של Cryptococcus spp.7,8,9.

לאורגניזמים כמו חסרי חוליות וצמחים אין מערכת חיסון נרכשת שתגן על עצמם מפני פתוגנים. עם זאת, הם מסתמכים על מערכת חיסון מולדת חזקה עם מגוון עצום של תרכובות כימיות כדי להתמודד עם מיקרואורגניזמים וטורפים10. מולקולות אלה כוללות מעכבי פפטידאז, הממלאים תפקידים חשובים במערכות ביולוגיות רבות, כולל תהליכים תאיים של חסינות חסרי חוליות, כגון קרישה של המולימפה, סינתזה של ציטוקינים ופפטידים אנטי-מיקרוביאליים, והגנה על פונדקאים על ידי השבתה ישירה של פרוטאזות של פתוגנים11. לפיכך, מעכבי פפטידאז מחסרי חוליות כגון רכיכות הם בעלי יישומים ביו-רפואיים פוטנציאליים, אך רבים מהם נותרים בלתי מאופיינים10,12,13. בהקשר זה, ישנם כ-34 מינים של רכיכות יבשתיות באונטריו ו-180 רכיכות מים מתוקים בקנדה14. עם זאת, הפרופיל והאפיון המעמיקים שלהם עדיין מוגבלים15. אורגניזמים אלה מהווים הזדמנות לזיהוי תרכובות חדשות בעלות פעילות אנטי-פטרייתית פוטנציאלית10.

בפרוטוקול הזה מתוארות שיטות לבודד ולהבהיר תמציות מחסרי חוליות (למשל רכיכות) (איור 1), ולאחר מכן למדוד את הפעילות המעכבת המשוערת של הפפטידאז. לאחר מכן מעריכים את התכונות האנטי-פטרייתיות של התמציות האלה על-ידי מדידת ההשפעה שלהן על ייצור פקטורי אלימות של C. neoformans באמצעות בדיקות פנוטיפיות (איור 2). חשוב לציין כי הבדלים בתכונות האנטי-פטרייתיות בין תמציות גולמיות ומזוקקות עשויים להצביע על גורמים מיקרוביאליים (למשל, מטבוליטים משניים או רעלנים המיוצרים על-ידי המיקרוביום המארח) של הרכיכה, אשר עשויים להשפיע על תצפיות ניסיוניות. ממצאים אלה תומכים בצורך של פרוטוקול זה להעריך תמציות גולמיות והבהרות באופן עצמאי כדי לפענח את דרכי הפעולה. בנוסף, תהליך המיצוי אינו מוטה ועשוי לאפשר זיהוי תכונות מיקרוביאליות כנגד שפע של פתוגנים פטרייתיים וחיידקיים. לכן, פרוטוקול זה מספק נקודת התחלה לתעדוף מיני רכיכות בעלות תכונות אנטי-פטרייתיות כנגד C. neoformans והזדמנות להעריך את הקשרים בין פעילות אנזימטית לייצור גורמי אלימות באמצעות מנגנוני עיכוב משוערים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מיצוי חלבון מרכיכות

  1. אספו רכיכות מאזור טבעי ייעודי ומאושר (למשל, ספיד ריבר, גואלף, אונטריו). עבור מחקר זה, הן מינים מקומיים והן מינים פולשים נבחרו כדי להעריך מגוון רחב של השפעות אנטי פטרייתיות פוטנציאליות.
  2. שברו בעדינות את קליפת הרכיכות (למשל, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi ו-Cipangopaludina chinensis) באמצעות מזיק וטיט, והוציאו את החתיכות המוצקות בעזרת זוג פינצטה. בדרך כלל, 10 רכיכות מאוגדות לשימוש לאורך כל הפרוטוקול.
  3. לאסוף ולשקול את האיברים. כ 15-20 גרם של מדגם הוא אופטימלי. השתמש מספריים לחתוך את האיברים לחתיכות קטנות על 0.5-1 ס"מ בגודל.
  4. להקפיא במהירות הבזק את דגימות האיברים שנותחו ולחתוך עם חנקן נוזלי. לאחר מכן, טחנו את דגימות האיברים לאבקה דקה באמצעות מזיק וטיט.
  5. הוסיפו את אבקת דגימת האיברים (כ-15 גרם) ל-30 מ"ל מים מזוקקים קרים (4°C) כדי להשיג יחס של 1:2 (w/v).
  6. יוצקים 2 מ"ל של המדגם לתוך צינורות השפעה גבוהה 2 מ"ל. הוסיפו כף מדידה של חרוזי נירוסטה בקוטר 3 מ"מ (כ-500 מיקרוגרם) לכל צינור, ובצעו הומוגניות באמצעות בלנדר (ראו טבלת חומרים) למשך 3 דקות ב-1,200 סל"ד וב-4°C.
  7. צנטריפוגה ב 12,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. לאסוף את כל supernatants עם פיפטה בצינור טרי 50 מ"ל, לזרוק את הכדור.
  8. מסננים ומעקרים את הסופרנאטנט באמצעות קרום של 0.22 מיקרומטר. אחסנו את הדגימות על קרח, והמשיכו לפרוטוקול ההבהרה (סעיף 2), לפי העניין.
    הערה: ניתן להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי במהירות של -20°C כדי להשתמש בהן כתמציות גולמיות.

2. הבהרה של תמצית רכיכות

  1. הניחו את דגימת הסופרנאטנט משלב 1.8 באמבט תרמי בטמפרטורה של 60°C למשך 30 דקות. לאחר מכן, קררו את הדגימות במהירות על ידי העברתן לדלי עם קרח למשך 20 דקות.
  2. צנטריפוגה הדגימות ב 15,000 × גרם במשך 45 דקות ב 4 ° C. אוספים את הסופרנאטנט בצינור טרי של 50 מ"ל, ומשליכים את הכדור. סנן וחטא את הדגימות באמצעות מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן אחסן אותן על קרח.
  3. קבע את ריכוז החלבון בדגימות משלב 1.8 (כלומר, תמצית גולמית) ושלב 2.2 (כלומר, תמצית מזוקקת) באמצעות בדיקת כימות (למשל, בדיקת חומצה ביכונינגית17). טווח ריכוז החלבון האופטימלי הוא 4-8 מ"ג/מ"ל.
  4. אחסנו את הדגימות על קרח עד שעה או הקפאת הבזק בחנקן נוזלי, ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20°C עד לצורך.

3. בדיקת פעילות מעכבת

  1. למדוד את הפעילות המעכבת של התמציות הגולמיות והמזוקקות באמצעות בדיקות אנזימטיות בשלשה טכנית.
    הערה: כל בדיקה אנזימטית מורכבת מאנזים (למשל, סובטיליסין A, המעורב באלימות פטרייתית 16,17,18; בדרך כלל בסביבות 1 x 10-9 mol/L עבור בדיקות מבוססות כרומוגניות), חיץ ומצע. התגובה מתחילה כאשר הסובסטרט פוגש את האנזים. הפעילות האנזימטית פרופורציונלית לקצב המרת המצע למוצר.
  2. להעריך את ההשפעה של ריכוז אנזים (EC) על פעילות אנזימטית (EA) עד לקבלת תלות ליניארית בין שני הפרמטרים. עבור השלבים הבאים, השתמש בריכוז אנזים בטווח הליניארי הנמדד.
    הערה: הבדיקה האנזימטית עבור peptidase subtilisin A מפורטת בשלבים הבאים.
  3. יש לדגור על תמציות חלבון הרכיכות הגולמי (שלב 1.11) או המזוקק (שלב 2.5) (למשל, 10 מיקרוליטר המכיל 4 מ"ג/מ"ל חלבון) עם 10 מיקרוליטר של סובטיליסין A (ריכוז נקבע משלב 3.2), ו-220 מיקרוליטר של 100 מילימטר Tris-HCl ב-pH 8.6 (לביקורת, הוסף 230 מיקרוליטר של חיץ Tris מבלי להוסיף את התמצית) למשך 10 דקות ב-25°C בצלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות.
  4. הוסף 10 μL של N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide, המצע עבור subtilisin A, בריכוז סופי של 1 Km (קבוע Michaelis-Menten; 0.2 mM עבור מצע זה עם subtilisin A) לקבלת נפח תגובה סופי של 250 μL.
  5. מדוד את הפעילות האנזימטית על ידי ניטור מראה המוצר לאורך זמן על ידי קריאת הצפיפות האופטית (OD) ב- 405 ננומטר כל 15 שניות למשך 3 דקות.
  6. לקבוע את הפעילות האנזימטית השיורית על ידי חישוב היחס בין הפעילות האנזימטית בנוכחות תמצית הרכיכה לזו שבהיעדר התמצית.
  7. אם נצפתה פעילות מעכבת (כלומר, פעילות שיורית מתחת ל-1), יש למדוד את ערך הריכוז המעכב 50 (IC50) באמצעות טווח ריכוזים של התמציות (למשל, סדרת דילול כפולה מ-200 מיקרוגרם/מ"ל עד 1 מק"ג/מ"ל) בשיטות סטנדרטיות19.

4. השפעת תמציות רכיכות על צמיחת C. neoformans

  1. השתמש בקצה פיפטה של 10 μL כדי להכניס מושבה אחת של C. neoformans var. grubii H99 wild-type (WT) לתוך 5 מ"ל של תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז (YPD) בינוני (10 גרם / ליטר תמצית שמרים, 20 גרם / ליטר פפטון, ו 20 גרם / ליטר דקסטרוז, pH 6.5), ודגור במשך 16-18 שעות ב 30 ° C ו 200 סל"ד. בצע את הניסוי בשכפול ביולוגי משולש וטכני.
  2. לאסוף 500 μL של התרבית בקובט, ולמדוד את הצמיחה על ידי קריאת OD ב 600 ננומטר. לדלל את התרבית עם בסיס חנקן שמרים (YNB) בינוני OD600 סופי של 0.02.
  3. תרבית משותפת של תאי C. neoformans בעלי ריכוזים שונים (למשל, סדרת דילול משולשת מ-440 מיקרוגרם/מ"ל ל-15 מק"ג/מ"ל חלבון) של התמציות (כלומר, גולמיות ומזוקקות). כדי לעשות זאת, מערבבים 10 μL של תמציות עם 190 μL של תרבות C. neoformans מדולל (שלב 4.2) בצלחת 96 באר.
  4. מדוד את הצמיחה על-ידי קריאת OD600 באמצעות קורא לוחות כל 15 דקות עד שעה למשך 72 שעות ב-200 סל"ד וב-37°C.

5. השפעת תמציות רכיכות על ייצור מלנין C. neoformans

  1. הכינו צלחות L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA).
    1. Autoclave 230 מ"ל של 14 גרם / ליטר אגר, ולתת לו להתקרר עד שהוא מגיע 50-60 ° C.
    2. הוסף 3.25 מ"ל של 1 M גליצין, 7.35 מ"ל של 1 M KH 2 PO 4, 2.5 מ"ל של 1 M MgSO4.7H 2 O, 0.6 מ"ל של 40% גלוקוז, 70 μL של 10 mM תיאמין, ו2.5מ"ל של 100 mM L-DOPA (מעוקר) לאגר נוזלי.
    3. יוצקים 15 מ"ל מהתערובת לצלחות פטרי, נותנים להם להתייבש כשעה בחושך, ומאחסנים ב 2-4 מעלות צלזיוס עד שבוע אחד. ודא שהמכסים מורמים חלקית כדי שהאגר יתייבש כראוי.
  2. חסן 5 מ"ל של מדיום YNB עם 50 μL של תרבית C. neoformans משלב 4.1. יש לדגור במשך 16-18 שעות ב-30°C וב-200 סל"ד.
  3. סובבו את התאים בטמפרטורה של 1,000 × למשך 5 דקות ב-4°C. שטפו את התאים פי 2 עם מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) ב-pH 7.4.
  4. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. להשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של PBS כדי להגיע לריכוז סופי של 106 תאים / מ"ל.
  5. הכינו סדרת דילול (למשל, כפולה) של תמציות הרכיכות הגולמיות והמזוקקות. באופן דומה, הכינו סדרת דילול פי 10 של תאי C. neoformans (שלב 5.4) מ-1 x 106 תאים/מ"ל ל-1 x 101 תאים /מ"ל באמצעות PBS סטרילי בלוחות 96 בארות.
  6. מורחים 200 מיקרוליטר מהתמציות על צלחות פטרי המכילות אגר L-DOPA באמצעות מקלון, ומניחים להן להתייבש במשך 15 דקות.
  7. יש לכרות 5 μL של תרבית מכל באר על צלחת L-DOPA, ולהשאיר 1 ס"מ בין טיפות. תן לו להתייבש בחושך במשך 15 דקות.
  8. דגרו על הלוחות בטמפרטורה של 30°C ו-37°C באינקובטור סטטי למשך 3-5 ימים, ולכדו תמונות כל 24 שעות באמצעות מצלמה או מצלמת צלחות (למשל, סורק).
    הערה: שני תנאי טמפרטורה משמשים כאן כדי לחקור את השפעת הטמפרטורה על ההשפעות מעכבות הצמיחה של תמציות הרכיכות, כאשר 30 ° C מייצג את הסביבה ו 37 ° C מייצג טמפרטורות פיזיולוגיות אנושיות.

6. השפעת תמציות רכיכות על ייצור כמוסות פוליסכריד C. neoformans

  1. הכינו מדיום דל ברזל (LIM) כמתואר להלן.
    1. יש להמיס 5 גרם של שרף כלאט (ראו טבלת חומרים) ב-60 מ"ל מים טהורים במיוחד, ולארוז בעמוד זכוכית (קוטר 2 ס"מ x 25 ס"מ אורך). לשטוף את העמוד עם 100 מ"ל של מים, ולהשליך את המים שנאספו.
    2. הכינו מים דלי ברזל (LI-water) על ידי העברת 2 ליטר של מים סטריליים אולטרה-טהורים דרך עמוד הכלאטינג. אחסנו את מי ה-LI בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.
    3. להמיס 5 גרם של גלוקוז ב 100 מ"ל של LI-מים. ממיסים 5 גרם של L-אספרגין ב 200 מ"ל של מי LI בכד נפרד.
    4. הוסף את הדברים הבאים ל- 500 מ"ל של מי LI לפי הסדר: 4.78 גרם HEPES, 0.4 גרם של K 2 HPO 4, 0.08 גרם של MgSO4.7H 2 O, 1.85 גרם של NaHCO3 ו- 0.25 גרם של CaCl 2.2H2 O.
    5. שלב את הפתרונות משלב 6.1.3 ושלב 6.1.4. הוסף 1 מ"ל של 100 mM חומצה bathophenanthrolinedisulfonic חומצה מלח נתרן (BPS) לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
    6. כוונן את ה- pH ל- 7.2 עם 1 M LI-MOPS. מוסיפים LI-water לנפח סופי של 1 ליטר, ומסננים את התווך על ידי העברתו דרך קרום של 0.22 מיקרומטר. הוסף 100 μL של תיאמין סטרילי (4 מ"ג / מ"ל) למדיום.
  2. חסן 5 מ"ל של מדיום YNB עם 50 μL של תרבית C. neoformans משלב 4.1. יש לדגור במשך 16-18 שעות ב-30°C וב-200 סל"ד. השתמש בתרבית זו כדי לחסן 5 מ"ל של LIM לריכוז סופי של 105 תאים / מ"ל.
  3. הוסף נפחים מתאימים של תמציות הרכיכות (למשל, דילול כפול או נפח שנקבע מבדיקות אלימות קודמות) כדי להגיע לריכוזים הרצויים. יש לדגור במשך 72 שעות ב-37°C וב-200 סל"ד עם מכסים משוחררים. לאחר הדגירה, לאסוף 1 מ"ל של תאים, ולשטוף 2x עם PBS סטרילי, pH 7.4, ב 1,500 × גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C.
  4. בעדינות להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של PBS. ערבבו את התאים עם דיו הודו ביחס של 1:1 (למשל, 4 מיקרוליטר של דיו הודו עם 4 מיקרוליטר של תרחיף תאים) מעל שקופית מיקרוסקופ זכוכית. הניחו תלוש כיסוי על גבי השקופית.
  5. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) עם מטרת שמן 63x (ראו טבלת חומרים). הגדר את הניגודיות לאוטומטית, והתמקד ידנית באמצעות חוגת המיקרוסקופ. בחר את כל התמונות וייצא אותן בתבנית TIFF. אין צורך להחיל מסננים.
  6. בעזרת הכלי סרגל ב- ImageJ20, כימות היחס בין גודל התא הכולל (כולל הקפסולה) לגודל גוף התא.

7. השפעת תמציות רכיכות על ייצור ביופילם של C. neoformans

  1. חסן 5 מ"ל של מדיום YNB עם 50 μL של תרבית C. neoformans משלב 4.1. יש לדגור במשך 16-18 שעות ב-30°C וב-200 סל"ד.
  2. קציר תאים מתרבית 5 מ"ל. שטפו את התאים עם PBS סטרילי, pH 7.4, ב 1,500 × גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C.
  3. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. להשהות מחדש את התאים ב 3 מ"ל של Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) לריכוז סופי של 107 תאים / מ"ל.
  4. מעבירים 300 μL של תרחיף התא לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית, פוליסטירן, שטוחה תחתית 24 בארות. השתמש בארות עם מדיה רק כבקרה.
  5. הוסף נפחים מתאימים של תמציות הרכיכות (למשל, דילול כפול או נפח שנקבע מבדיקות אלימות קודמות) כדי להגיע לריכוז סופי של 10-20 מיקרוגרם / מ"ל חלבון. ודא שנפח החילוץ אינו גדול מ- 10% מהנפח הכולל.
  6. עטפו את הלוחות ברדיד אלומיניום (כדי למנוע אידוי מדיה), ודגרו במשך 48 שעות באמצעות אינקובטור סטטי בטמפרטורה של 30°C ו-37°C.
  7. באמצעות בקבוק או מתקן לשטוף את הבארות 2x עם מים סטריליים, ולתת להם להתייבש באוויר במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 100 μL של תמיסה סגולה גבישית 0.3% לכל באר (כולל בארות הבקרה הבינוניות בלבד), ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  8. שטפו היטב את הבארות 3x במים סטריליים (הביופילמים לא יופרעו במהלך השטיפה). הוסיפו 200 μL של 100% אתנול, ודגרו במשך 10 דקות ב-RT.
  9. העבר 75 μL לצלחת שטוחה חדשה בעלת 96 בארות, וקרא את OD550. כמת את היווצרות הביופילם כ- (OD 550nm של מדגם - OD550nm של ריק).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך העבודה המתואר כאן מאפשר בידוד של חלבונים ופפטידים מרכיכות בעלות תכונות אנטי-אלימות פוטנציאליות נגד C. neoformans. באופן דומה, הערכת צורות שונות של תמציות (כלומר, גולמיות ומובהרות) מאפשרת טיהור למחצה של החומרים הפעילים הפוטנציאליים ותומכת בהערכה במורד הזרם (למשל, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות). בדרך כלל, תהליך מיצוי החלבון מייצר תמיסות הומוגניות עם ריכוזי חלבון של 4-8 מ"ג / מ"ל. כאן, התוצאות המייצגות מדגימות את הערכת הפעילות האנזימטית והתכונות האנטי פטרייתיות של תמציות C. chinensis. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המיצוי המתואר כאן מתאר את בידוד התרכובות מרכיכות שנאספו מאונטריו, קנדה, ומדגים מחקר חדשני של שימוש בתמציות רכיכות נגד הפתוגן הפטרייתי האנושי, C. neoformans. פרוטוקול זה מתווסף לגוף הולך וגדל של מחקרים החוקרים פעילות מעכבי פפטידאז מחסרי חוליות13. במהלך המיצוי, חלק מדגימות התמצית היו קשות לעיקור סינון, אולי בשל נוכחותם של פוליסכרידים מסיסים ו / או פיגמנטים שחסמו את קרום המסנן. כדי להתגבר על מגבלה זו, מומלץ לסנן תחילה דרך קרום של 5 מיקרומטר כדי להוציא תרכובות גדולות (למשל, קרומי תאי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לחברי מעבדת גדס-מקאליסטר על תמיכתם רבת הערך לאורך כל החקירה ועל המשוב שלהם על כתבי היד. המחברים מודים על תמיכת המימון של מלגת אונטריו לתארים מתקדמים ופרס המחקר הבינלאומי לתארים מתקדמים - אוניברסיטת גואלף ל- D. G.-G ומהקרן הקנדית לחדשנות (JELF 38798) ומשרד המכללות והאוניברסיטאות של אונטריו - פרס החוקר המוקדם עבור J. G.-M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μ m מסנניםVWR28145-477 (צפון אמריקה)
צינורות 1.5 מ"ל (נעילה בטוחה)Eppendorf0030120086
2 מ"ל צינורות (נעילה בטוחה)Eppendorf0030120094
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)Sigma-AldrichD9628-5GCAS #: 59-92-7
צלחות 96 בארותCostar (Corning)3370
Bullet בלנדר סטורם 24NEXT ADVANCEBBY24M
צנטריפוגה 5430REppendorf5428000010
Chelex 100 שרףBioRad142-1253
CO2 אינקובטור (סטטי)SANYOלא זמין
Cryptococcus neoformans מיקרוסקופ H99ATCC208821
DICאולימפוס
DICZeiss
DMEMCorning10-013-CV
גלוקוז (D-גלוקוז, נטול מים, דרגת ריאגנט)BioShopGLU501CAS #: 50-99-7
גליציןפישר כימיG46-1CAS #: 56-40-6
GraphPad פריזמה 9דומטיקה
המוציטומטרVWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375
מגנזיום סולפט הפטהידראט (MgSO4.7 H2O)HoneywellM1880-500GCAS #: 10034-99-8 
PeptoneBioShopPEP403
מלח חוצץ פוסוהאט pH 7.4BioShopPBS408מק"ט: PBS408.500
קורא צלחות (Synergy-H1)BioTek (Agilent)לא זמין
אשלגן פוספט מונוביס (KH2PO4)Fisher ChemicalP285-500CAS #: 7778-77-0
Subtilisin Aסיגמא-אולדריץ'P4860CAS #: 9014-01-01
Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilideSigma-Aldrich573462CAS #: 70967-97-4
אמבט תרמיVWR76308-834
תיאמין הידרוכלורידפישר-ביוריאגנטיםBP892-100CAS #: 67-03-8
תמצית שמריםBioShopYEX401CAS #: 8013-01-2
שמרים בסיס חנקן (עם חומצות אמינו)סיגמא-אולדריץ'Y1250-250GYNB 
תוכנת מיקרוסקופ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
  2. Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
  3. Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79(2018).
  4. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
  5. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
  6. Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
  7. Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
  8. Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
  9. Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
  10. Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016(2021).
  11. Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
  12. Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
  13. González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
  14. Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
  15. Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
  16. Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
  17. Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
  18. Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051(2016).
  19. Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
  20. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  21. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
  22. Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
  23. Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
  24. Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
  25. Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173(2017).
  26. Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Anticryptococcal PropertiesMollusk ExtractsCryptococcus NeoformansPeptidase InhibitorsAntifungal ResistanceBiofilm FormationProtein QuantificationSubtilisin A InhibitionFungal Virulence FactorsThermal Tolerance

Related Articles