הפתוגן הפטרייתי האנושי Cryptococcus neoformans מייצר מגוון גורמים אלימים (למשל, פפטידאזות) כדי לקדם את הישרדותו בתוך הפונדקאי. נישות סביבתיות מייצגות מקור מבטיח של מעכבי פפטידאז טבעיים חדשים. פרוטוקול זה מתאר את הכנת התמציות מרכיכות ואת הערכת השפעתן על ייצור גורמי אלימות פטרייתיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת התכונות האנטי-קריפטוקוקליות המשוערות של תמציות גולמיות ומזוקקות מרכיכות
במאמר זה
סיכום
תקציר
Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אנושי עטוף עם תפוצה עולמית המדביקה בעיקר אנשים מדוכאי חיסון. השימוש הנרחב בתרופות אנטי-פטרייתיות במסגרות קליניות, השימוש בהן בחקלאות והכלאת זנים הובילו לאבולוציה מוגברת של עמידות. שיעור עולה זה של עמידות נגד אנטי פטרייתיות הוא דאגה גוברת בקרב רופאים ומדענים ברחבי העולם, ויש דחיפות מוגברת לפתח טיפולים אנטי פטרייתיים חדשניים. לדוגמה, C. neoformans מייצר מספר גורמי אלימות, כולל אנזימים תוך-תאיים וחוץ-תאיים (למשל, פפטידאזות) עם תפקידים בפירוק רקמות, ויסות תאי ורכישת חומרים מזינים. ההפרעה לפעילות פפטידאז כזו על ידי מעכבים מפריעה לגדילה ולשגשוג של פטריות, מה שמרמז על כך שזו עשויה להיות אסטרטגיה חשובה למאבק בפתוגן. חשוב לציין, חסרי חוליות כגון רכיכות מייצרים מעכבי פפטידאז עם יישומים ביו-רפואיים ופעילות אנטי-מיקרוביאלית, אך הם אינם נחקרים מספיק במונחים של השימוש בהם נגד פתוגנים פטרייתיים. בפרוטוקול זה, בוצע מיצוי גלובלי מרכיכות כדי לבודד מעכבי פפטידאז פוטנציאליים בתמציות גולמיות ומזוקקות, והוערכו השפעתם נגד גורמי אלימות קריפטוקוקליים קלאסיים. שיטה זו תומכת בתעדוף רכיכות בעלות תכונות אנטי פטרייתיות ומספקת הזדמנויות לגילוי חומרים אנטי-אלימים על ידי רתימת המעכבים הטבעיים הנמצאים ברכיכות.
מבוא
Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אנושי המייצר מחלה קשה אצל מארחים מדוכאי חיסון, כגון אנשים החיים עם HIV / איידס1, ומוביל לכ -19% ממקרי המוות הקשורים לאיידס2. הפטרייה רגישה למספר סוגים של אנטי פטרייתיות, כולל אזולים, פולינים ופלוציטוזין, המפעילים פעילות קוטלת פטריות ופטריות באמצעות מנגנונים נפרדים 3,4. עם זאת, השימוש הנרחב באנטי-פטרייתיות בסביבה קלינית וחקלאית בשילוב עם הכלאת זנים הגבירו את התפתחות העמידות במינים פטרייתיים רבים, כולל C. neoformans5.
כדי להתגבר על ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מיצוי חלבון מרכיכות
- אספו רכיכות מאזור טבעי ייעודי ומאושר (למשל, ספיד ריבר, גואלף, אונטריו). עבור מחקר זה, הן מינים מקומיים והן מינים פולשים נבחרו כדי להעריך מגוון רחב של השפעות אנטי פטרייתיות פוטנציאליות.
- שברו בעדינות את קליפת הרכיכות (למשל, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi ו-Cipangopaludina chinensis) באמצעות מזיק וטיט, והוציאו את החתיכות המוצקות בעזרת זוג פינצטה. בדרך כלל, 10 רכיכות מאוגדות לשימוש לאורך כל הפרוטוקול.
- לאסוף ולשקול את האיברים. כ 15-20 גרם של מדגם הוא אופטימלי. השתמש מספריים לחתוך את האיברים לחתיכות קטנות על 0.5-1 ס"מ בגודל.
- להקפיא במהירות הבזק את דגימות האיבר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תהליך העבודה המתואר כאן מאפשר בידוד של חלבונים ופפטידים מרכיכות בעלות תכונות אנטי-אלימות פוטנציאליות נגד C. neoformans. באופן דומה, הערכת צורות שונות של תמציות (כלומר, גולמיות ומובהרות) מאפשרת טיהור למחצה של החומרים הפעילים הפוטנציאליים ותומכת בהערכה במורד הזרם (למשל, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות). בדרך כלל, תהליך מיצוי החלבון מייצר תמיסות הומוגניות עם ריכוזי חלבון של 4-8 מ"ג / מ"ל. כאן, התוצאות המייצגות מדגימות את הערכת הפעילות האנזימטית והתכונות האנטי פטרייתיות של תמציות C. chinensis. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול המיצוי המתואר כאן מתאר את בידוד התרכובות מרכיכות שנאספו מאונטריו, קנדה, ומדגים מחקר חדשני של שימוש בתמציות רכיכות נגד הפתוגן הפטרייתי האנושי, C. neoformans. פרוטוקול זה מתווסף לגוף הולך וגדל של מחקרים החוקרים פעילות מעכבי פפטידאז מחסרי חוליות13. במהלך המיצוי, חלק מדגימות התמצית היו קשות לעיקור סינון, אולי בשל נוכחותם של פוליסכרידים מסיסים ו / או פיגמנטים שחסמו את קרום המסנן. כדי להתגבר על מגבלה זו, מומלץ לסנן תחילה דרך קרום של 5 מיקרומטר כדי להוציא תרכובות גדולות (למשל, קרומי תאי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
המחברים מודים לחברי מעבדת גדס-מקאליסטר על תמיכתם רבת הערך לאורך כל החקירה ועל המשוב שלהם על כתבי היד. המחברים מודים על תמיכת המימון של מלגת אונטריו לתארים מתקדמים ופרס המחקר הבינלאומי לתארים מתקדמים - אוניברסיטת גואלף ל- D. G.-G ומהקרן הקנדית לחדשנות (JELF 38798) ומשרד המכללות והאוניברסיטאות של אונטריו - פרס החוקר המוקדם עבור J. G.-M.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 μ m מסננים | VWR | 28145-477 (צפון אמריקה) | |
| צינורות 1.5 מ"ל (נעילה בטוחה) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 מ"ל צינורות (נעילה בטוחה) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| צלחות 96 בארות | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet בלנדר סטורם 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| צנטריפוגה 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 שרף | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 אינקובטור (סטטי) | SANYO | לא זמין | |
| Cryptococcus neoformans מיקרוסקופ H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC | אולימפוס | ||
| DIC | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| גלוקוז (D-גלוקוז, נטול מים, דרגת ריאגנט) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| גליצין | פישר כימי | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad פריזמה 9 | דומטיקה | ||
| המוציטומטר | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| מגנזיום סולפט הפטהידראט (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| מלח חוצץ פוסוהאט pH 7.4 | BioShop | PBS408 | מק"ט: PBS408.500 |
| קורא צלחות (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | לא זמין | |
| אשלגן פוספט מונוביס (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | סיגמא-אולדריץ' | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| אמבט תרמי | VWR | 76308-834 | |
| תיאמין הידרוכלוריד | פישר-ביוריאגנטים | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| תמצית שמרים | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| שמרים בסיס חנקן (עם חומצות אמינו) | סיגמא-אולדריץ' | Y1250-250G | YNB |
מקורות
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
