בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

משיכה קונבנציונלית נמצאת בשימוש נרחב לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון¹. עם זאת, חלבונים מטוהרים לעתים קרובות אינם מתקשרים ביעילות במבחנה^2,3, וחלקם אינם מסיסים ללא שותפו הקושר ^4,5. חלבונים כאלה עשויים לדרוש הרכבה משותפת או נוכחות של מלווים מולקולריים 5,6,7,8,9. מגבלה נוספת של משיכה קונבנציונלית היא בדיקת פעילות הטרומולטימריזציה אפשרית בין תחומים שיכולים להתקיים כהומו-אוליגומרים יציבים המורכבים בתרגום משותף ^8,10, מכיוון שרבים מהם אינם יכולים להתנתק ולהתחבר מחדש במבחנה בזמן הדגירה. ביטוי משותף נמצא כיעיל בהתגברות על בעיות כאלה ^3,11. ביטוי משותף באמצעות וקטורים תואמים בחיידקים שימש בהצלחה לטיהור קומפלקסים מקרומולקולריים מרובי יחידות גדולות, כולל קומפלקס דיכוי פוליקומב PRC2¹², RNA פולימראז II מתווך ראש מודול¹³, בקטריופאג T4 baseplate 14, SAGA קומפלקס deubiquitinylase מודול 15,16, ו ferritin ¹⁷. מקורות השכפול הנפוצים לביטוי משותף הם ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ ו-RSF²⁰. במערכת הביטוי Duet הזמינה מסחרית, מקורות אלה משולבים עם גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה ואתרי שיבוט מרובים נוחים ליצירת וקטורים פוליציסטרוניים, המאפשרים ביטוי של עד שמונה חלבונים. למקורות אלה יש מספרי העתקה שונים וניתן להשתמש בהם בשילובים שונים כדי להשיג רמות ביטוי מאוזנות של חלבוני מטרה²¹. כדי לבדוק אינטראקציות חלבון-חלבון, נעשה שימוש בתגי זיקה שונים; הנפוצים ביותר הם 6xHistidine, גלוטתיון-S-transferase (GST) וחלבון קושר מלטוז (MBP), שלכל אחד מהם זיקה ספציפית לשרף המתאים. GST ו- MBP גם משפרים את המסיסות והיציבות של חלבונים מתויגים²².

כמו כן פותחו מספר שיטות לביטוי משותף של חלבונים בתאים איקריוטים, הבולטת שבהן היא בדיקת שמרים דו-היברידית (Y2H)²³. בדיקת Y2H זולה, קלה ומאפשרת בדיקה של אינטראקציות מרובות; עם זאת, זרימת העבודה שלו נמשכת יותר משבוע אחד. יש גם כמה בדיקות מבוססות תאי יונקים פחות נפוצות, לדוגמה, בדיקה פלואורסצנטית דו-היברידית (F2H)²⁴ ובדיקת אינטראקציה חלבון-חלבון במערך התא (CAPPIA)²⁵. בדיקת F2H מהירה יחסית, ומאפשרת לצפות באינטראקציות חלבונים בסביבה התאית הטבעית שלהם, אך כרוכה בשימוש בציוד הדמיה יקר. לכל השיטות הללו יש יתרון על פני ביטוי פרוקריוטי המספק את סביבת התרגום והקיפול האיקריוטית הילידית; עם זאת, הם מזהים אינטראקציה בעקיפין, או על ידי הפעלת שעתוק או על ידי העברת אנרגיה פלואורסצנטית, אשר לעתים קרובות מייצרת חפצים. כמו כן, תאים אאוקריוטים עשויים להכיל שותפים אחרים לאינטראקציה של חלבונים בעלי עניין, אשר יכולים להפריע לבדיקת אינטראקציות בינאריות בין חלבונים של איקריוטים גבוהים יותר.

המחקר הנוכחי מתאר שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי ואחריו טכניקות משיכה קונבנציונליות. השיטה מאפשרת לחקור אינטראקציות בין חלבוני מטרה הדורשות ביטוי משותף. הוא חסכוני יותר בזמן בהשוואה למשיכה מסורתית, ומאפשר בדיקת אצווה של מטרות מרובות, מה שהופך אותו ליתרון ברוב המקרים. ביטוי משותף באמצעות וקטורים תואמים נוח יותר מאשר ביטוי משותף פוליציסטרוני מכיוון שהוא אינו דורש שלב שיבוט מייגע.

הייצוג הסכמטי של זרימת העבודה של השיטה מוצג באיור 1.

1. טרנספורמציה משותפת של E. coli

1. הכינו וקטורי ביטוי לחלבוני מטרה בשיטות שיבוט סטנדרטיות.
   הערה: בדרך כלל, נקודת התחלה טובה היא להשתמש בווקטורים קונבנציונליים של pGEX/pMAL הנושאים גן עמידות לאמפיצילין ומקור ColE1 לביטוי חלבונים המתויגים ב-GST/MBP ובווקטור תואם עם מקור p15A או RSF ועמידות לקנמיצין כדי לבטא חלבונים מתויגים 6xHis, במקרים מסוימים בשילוב עם Thioredoxin או SUMO-tag כדי להגביר את מסיסות. בדרך כלל, יש לבדוק מספר שילובים של תגים לפני הניסוי. השיטה המתוארת עצמה נוחה לבדיקת אצווה של תנאי הביטוי של חלבוני המטרה. חשוב לציין שרוב זני הרוזטה כבר מכילים את הפלסמיד עם מקור p15A לביטוי tRNA עבור קודון נדיר;, ולכן אם שימוש בזנים כאלה הוא אפשרות אפשרית, יש להימנע מפלסמידים p15A. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.
   1. לגדל חיידקים מזן מתאים במדיה לוריא-ברטאני (LB) ב-37°C עד לצפיפות אופטית (OD) של 0.1-0.2. זן BL21(DE3) שימש לדוגמה במחקר זה.
      הערה: מומלץ להשתמש בתאים מוכשרים טריים שהוכנו כדי להשיג טרנספורמציה משותפת יעילה עם שני וקטורים. אם יותר משני וקטורים צריכים לעבור טרנספורמציה משותפת, עדיף לשנות אותם ברצף כדי להשיג יעילות טרנספורמציה טובה. אלקטרופורציה היא חלופה טובה.
   2. צנטריפוגה 1.0 מ"ל של תרחיף החיידקים למשך דקה אחת ב 9,000 x גרם ב 4 ° C, ולהשליך את supernatant.
   3. הוסף 0.5 מ"ל של מאגר טרנספורמציית חיץ קר כקרח (TB) (10 mM MOPS [pH 6.7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 ו- 15 mM CaCl₂) ודגור במשך 10 דקות על קרח.
   4. צנטריפוגה ל-30 שניות ב-8,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט.
   5. הוסף 100 μL של מאגר שחפת, הוסף 100 ng של כל וקטור, ודגר במשך 30 דקות על קרח. התמירו בנפרד וקטורים בודדים כדי לחקור התנהגות חלבונים ללא ביטוי משותף. בנוסף, בצע המרה משותפת של וקטורי ביטוי בזוגות עם וקטורים ריקים של ביטוי משותף עבור פקדי קישור לא ספציפיים.
      הערה: בדוגמאות שסופקו במחקר זה, וקטורי pGEX/pMAL עם cDNA תואם התמזגו ל-cDNA של GST/MBP בשילוב עם וקטורים תואמים שמקורם ב-pACYC הנושאים תחומי חלבון שותפים המקודדים cDNA שאוחו ל-cDNA של Thioredoxin.
   6. מחממים ב 42 ° C במשך 150 שניות, ולאחר מכן מצננים במשך 1 דקות על קרח.
   7. הוסף 1 מ"ל של חומר LB נוזלי ללא אנטיביוטיקה ודגר ב 37 ° C במשך 90 דקות. צלחת על צלחות LB-אגר המכילות 0.5% גלוקוז ואנטיביוטיקה מתאימה (ריכוזים נפוצים הם: 50 מ"ג / ליטר אמפיצילין; 20 מ"ג / ליטר קנמיצין; 50 מ"ג / ליטר סטרפטומיצין; 35 מ"ג / ליטר chloramphenicol). לדגור את הצלחות לילה ב 37 °C (77 °F).

2. ביטוי

1. שטפו את התאים מהצלחת עם 2 מ"ל של מדיה נוזלית LB לתוך 50 מ"ל של מדיה LB עם אנטיביוטיקה מתאימה (ריכוזים נפוצים הם: 50mg / L ampicillin; 20 מ"ג / L kanamycin; 50 מ"ג / L סטרפטומיצין; 35 מ"ג / L chloramphenicol). הוסף יוני מתכת או גורמים משלימים ידועים אחרים (בדוגמאות שסופקו במחקר זה, 0.2 mM ZnCl₂ נוסף למדיה). אחסן aliquot עם 20% גליצרול ב -70 ° C עבור חזרה נוספת של הניסוי.
   הערה: מומלץ לשטוף מספר מושבות ישירות מהצלחת כדי למנוע אפשרות של ביטוי רע בשיבוט בודד אחד עקב אירועי רקומבינציה מזדמנים בין שני פלסמידים.
2. גדל את התאים עם סיבוב קבוע של 220 סל"ד ב 37 ° C ל OD של 0.5-0.7, קריר לטמפרטורת החדר (RT), ולהוסיף isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ל 1 mM. אחסן aliquot 20 μL של תרחיף התא כבקרה של הדגימה uninduced.
3. לדגור על התאים עם סיבוב קבוע של 220 סל"ד ב 18 ° C במשך הלילה.
   הערה: הזמן והטמפרטורה האופטימליים של הדגירה עשויים להשתנות; 18 מעלות צלזיוס בלילה עובד הכי טוב עבור רוב החלבונים ומומלץ לנסות כברירת מחדל. צמצם את זמן הדגירה ל 2-3 שעות אם נצפתה קשירה חזקה ולא ספציפית.
4. חלק את התרחיף החיידקי לשני חלקים (או יותר אם נעשה שימוש ביותר משני תגים שונים) ואחסן Aliquot של 20 μL של תרחיף התא כדי לאשר ביטוי חלבון. צנטריפוגה בגודל 4,000 x גרם למשך 15 דקות.
   הערה: נקודת השהיה: ניתן לאחסן כדוריות חיידקיות בטמפרטורה של -70°C למשך 6 חודשים לפחות.

3. מבחן משיכה כלפי מטה

הערה: ההליכים המפורטים מתוארים עבור חלבונים המתויגים עם 6xHis או MBP/GST. כל ההליכים מבוצעים בטמפרטורה של 4°C.

1. יש להשהות מחדש את כדורי החיידקים ב-1 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח עם מעכבי פרוטאז וחומרים מחזרים (ראו להלן) שנוספו מיד לפני הניסוי. הימנע dithiotreitol (DTT) בעת שימוש שרפים chelating מתכת מאז זה מסיר יוני מתכת. התאם את הרכב החיץ עבור החלבונים שנבדקו. המתכונים הנפוצים של מאגרי ליזה שנמצאו מתאימים לרוב החלבונים הם:
   1. 6xHis-pulldown: ערבבו 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0.1% NP40, 10% [w/w] גליצרול, 5 mM בטא-מרקפטואתנול, 1 mM פנילמתילפולפונילפלואוריד (PMSF), ודילול 1:1,000 של קוקטייל מעכבי פרוטאז (ראה טבלת חומרים).
   2. משיכת GST או MBP: ערבבו 20 mM Tris (pH 7.5 ב-25°C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl₂, 0.1% NP40, 10% [w/w] גליצרול, 5 mM DTT, 1 mM PMSF ודילול 1:1,000 של קוקטייל מעכבי פרוטאז (ראו טבלת חומרים).
2. לשבש את התאים על ידי סוניקציה על קרח. יש לאחסן אליציטוט של 20 μl עבור אלקטרופורזה.
   הערה: בדרך כלל, נדרשות 20-25 פעימות של 5 שניות עם מרווחים של 15 שניות עם הספק יציאה של 20 ואט לכל דגימה. יש לכוונן את עוצמת הסוניקציה המתאימה לכל מכשיר כדי למנוע התחממות יתר ולהבטיח הפרעה מוחלטת לתאים. כדי להשיג ביצועים טובים יותר, מומלץ מאוד להשתמש בבדיקות סוניקטור מרובות קצוות בעלות תפוקה גבוהה.
3. צנטריפוגה ברזולוציה של 20,000 x גרם למשך 30 דקות. אסוף 20 μL של הליזט המובהר לניתוח SDS-PAGE עוקב.
4. אזנו את השרף (50 מיקרוליטר לכל דגימה) עם 1 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח למשך 10 דקות, צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות, והשליכו את הסופרנטנט.
5. מוסיפים ללרזט התא (ריכוז חלבון כולל: 20-50 מ"ג/מ"ל) לשרף, דוגרים במשך 10 דקות בסיבוב קבוע של 15 סל"ד, צנטריפוגות ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות, ומשליכים את הסופרנטנט. אסוף 20 μL של החלק הלא מאוגד לצורך ניתוח SDS-PAGE עוקב.
6. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ כביסה קר כקרח ודגרים למשך דקה. צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 30 שניות, ולהשליך את supernatant. המתכונים הנפוצים למאגרי כביסה הם:
   1. 6xHis-pulldown: יש לערבב 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazole, 0.1% NP40, 10% [w/w] גליצרול ו-5 mM בטא-מרקפטואתנול.
   2. משיכת GST או MBP: יש לערבב 20 mM Tris (pH 7.5 ב-25°C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl₂, 0.1% NP40, 10% [w/w] גליצרול ו-5 mM DTT.
7. בצעו שתי שטיפות ארוכות: הוסיפו 1 מ"ל של חיץ שטיפה קר כקרח, דגרו במשך 10-30 דקות עם סיבוב קבוע של 15 סל"ד, צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות, והשליכו את הסופרנטנט.
8. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ כביסה קר כקרח, דוגרים במשך דקה, צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 30 שניות, ומשליכים את supernatant.
9. יש להקפיד על החלבונים הקשורים עם 50 מיקרוליטר של חיץ האלוציה בשייקר במהירות 1,200 סל"ד למשך 10 דקות. המתכונים הנפוצים של מאגרי אלוציה הם:
   1. 6xHis-pulldown: יש לערבב 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazole ו-5 mM בטא-מרקפטואתנול.
   2. משיכת GST: 20 mM Tris (pH 7.5 ב-25°C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutathione (מותאם ל-pH 7.5 עם Tris בסיסי) ו-5 mM DTT.
   3. משיכת MBP: יש לערבב 20 mM Tris (pH 7.5 ב-25°C), 150 mM NaCl, מלטוז 40 mM ו-5 mM DTT.
10. נתח את החלבונים המדוללים באמצעות SDS-PAGE.
    הערה: אחוז האקרילאמיד צריך להיות מותאם לגודל החלבונים. בדוגמאות שסופקו במחקר זה, נעשה שימוש ב-12% ג'לים אקרילאמידים, הפועלים במאגר tris-glycine-SDS (2 mM Tris, 250 mM Glycine, 0.1% SDS) במתח קבוע של 180 V. ג'לים הוכתמו על ידי הרתחה ב-0.2% Coomassie blue R250, 10% חומצה אצטית ו-30% איזופרופנול, והוסרו מהכתמה על ידי הרתחה ב-10% חומצה אצטית. כמות החלבון הטעון לא צריכה להיות שווה, שכן כמויות שונות של חלבונים אינטראקציה ניתן למשוך למטה בניסויים שונים.

השיטה המתוארת שימשה באופן שגרתי עם מטרות רבות ושונות. להלן כמה תוצאות מייצגות שככל הנראה לא ניתן להשיג באמצעות טכניקות משיכה קונבנציונליות. הראשון הוא המחקר של דימריזציה ספציפית של ZAD (תחום הקשור לאבץ באצבע)11. ZADs יוצרים דימרים יציבים וספציפיים, כאשר הטרודימרים אפשריים רק בין תחומים קרובים בתוך קבוצות פרלוגיות. הדימרים הנוצרים על ידי תחומים אלה יציבים ואינם מתנתקים לפחות כמה ימים; לפיכך, ערבוב ZADs מטוהרים אינו מייצר כל קשירה ניתנת לזיהוי. באותו הזמן, הביטוי המשותף של MBP ו-Thioredoxin-6xHis-fused ZADs מראה פעילות הומו-דימריזציה טובה וניתנת לשחזור (איור 2A), ומופיע כפס נוסף בתוצאות SDS-PAGE של מבחן משיכת MBP. ניתן לראות חלק קטן מההטרודימרים עם M1BP המתבטא יחד עם תחום אחר; אינטראקציה זו לא אושרה עם Y2A וככל הנראה היא תוצאה של קשר לא ספציפי עקב ריכוז חלבון גבוה, שכן תחומים אלה עשירים בציסטאין ונוטים מאוד לצבירה. יש לציין כי במקרה זה, משיכה 6xHis-down אינה הולמת מכיוון ש-ZADs הם תחומים קואורדינטיבי מתכת שאינם נקשרים באופן ספציפי לשרף כלאט המתכת. פעילות כזו צריכה להיבחן בקפידה בניסוי מקביל.

דוגמה נוספת היא בדיקת התחרות בין חלבון ENY2 לבין שותפיו הקושרים Sgf11 (1-83aa) ותחום אצבעות האבץ (460-631 aa) של חלבון CTCF26. כאשר הוא מבוטא לבד, חלבון ENY2 יוצר דימרים המונעים ממנו אינטראקציה עם שותפיו הקושרים הטבעיים. ככל הנראה, הן חלבוני Sgf11 והן חלבוני CTCF נקשרים לאותו משטח מולקולרי של ENY2, מה שהופך את האינטראקציה ביניהם לבלעדית הדדית. במבחן הביטוי המשותף, ENY2 המתויג 6xHis קיים אינטראקציה הן עם Sgf11 המתויג GST והן עם MBP-CTCF, אך לא היה GST-Sgf11 נוכח במשיכות MBP ולהיפך (איור 2B). תוצאות אלה מצביעות על כך שלא ניתן ליצור קומפלקס משולש, ואינטראקציות הן הדדיות. נתונים אלה אושרו באופן עצמאי עם בדיקות אחרות ותומכים בתפקידים הפונקציונליים השונים של ENY2 בקומפלקסים אלה. יש לשים לב לכך שתגי זיקה גדולים יכולים להטיל מכשולים סטריים בפני עצמם, ולמנוע היווצרות מורכבת; לכן, המסקנה לא צריכה להתבסס רק על נתוני ביטוי משותף.

השוואה שלב-אחר-שלב של זרימות העבודה של משיכות ביטוי משותף קונבנציונליות ומצומדות מוצגת באיור 3A. משיכה מצומדת של ביטוי משותף היא לפחות פי שניים יותר חסכונית בזמן, אפילו עם מספר קטן של דגימות, ומאפשרת מדרגיות טובה. התוצאות של שימוש בשתי השיטות כדי לחקור את אותה אינטראקציה בין תחום BTB של חלבון CP190 (1-126aa) לבין תחום C-terminal המתויג GST (610-818aa) של חלבון Drosophila CTCF (dCTCF) מוצגות באיור 3B. שתי השיטות מראות יעילות טובה ויכולת שחזור (בדיקות בוצעו בשלושה עותקים משוכפלים); במקרה זה, משיכה מצומדת לביטוי משותף הראתה קשירה לא ספציפית נמוכה יותר, כפי שניתן לראות בדגימות הבקרה עם חלבון GST בלבד.

איור 1: הייצוג הסכמטי של הפרוטוקול. הסכימה מציגה את זרימת העבודה של השיטה בה נעשה שימוש במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תוצאות מייצגות . (A) מחקר של הומודימריזציה של תחום הקשור לאבץ-אצבע (ZAD) במבחני MBP ו-6xHis-pulldown. ZADs שהתמזגו עם MBP (40 kDa) או עם 6xHis-Thioredoxin (20 kDa) באו לידי ביטוי משותף בתאי חיידקים וזיקה מטוהרת עם שרף עמילוז (קושר חלבונים המתויגים ב-MBP) או עם שרף Ni-NTA (קושר חלבונים המתויגים 6xHis). חלבונים מטוהרים במשותף הודגמו באמצעות SDS-PAGE ואחריו צביעת קומאסי. תוצאות משיכת MBP מוצגות בפאנלים עליונים, תוצאות משיכת 6xHis מוצגות בפאנלים התחתונים (משמשים רק כבקרת ביטוי חלבונים מכיוון ש- ZADs רבים נקשרים באופן לא ספציפי ל- Ni-NTA). (B) מחקר של אינטראקציות הדדיות בלעדיות בין חלבוני ENY2 ו-Sgf11/CTCF. חלבוני SGF11 (1-81aa) המתויגים ב-GST, תחום אצבע אבץ CTCF עם תג MBP (460-631aa) וחלבוני ENY2 המתויגים 6xHis באו לידי ביטוי בשילובים שונים ובזיקה מטוהרים עם שרף עמילוז, שרף גלוטתיון (קושר חלבונים המתויגים ב-GST), או עם שרף Ni-NATA. חלבונים מטוהרים במשותף הודגמו באמצעות SDS-PAGE ואחריו צביעת קומאסי. האיור בלוחות A ו-B שונה באישור Bonchuk et al.11 ו-Bonchuk et al.26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השוואה בין זרימות עבודה של מבחני משיכה קונבנציונליים ומצומדים של ביטוי משותף. (A) השוואה שלב אחר שלב של מרווחי הזמן הנדרשים בזרימת העבודה של מבחן המשיכה הרגיל בהשוואה למשיכה כלפי מטה המצומדת לביטוי משותף. (B) השוואה בין שתי טכניקות משיכה שונות בחקר האינטראקציה בין תחום מסוף C dCTCF (610-818aa) לבין תחום BTB של חלבון CP190 (1-126aa) במבחני משיכת GST. dCTCF (610-818aa) שהתמזגו עם GST (25kDa) או GST בלבד באו לידי ביטוי משותף בתאי חיידקים או הודגרו במבחנה עם Thioredoxin-6xHis-tagged CP190 BTB וזיקה מטוהרת עם שרף גלוטתיון. שלושה עותקים משוכפלים עצמאיים של כל בדיקה מוצגים. חלבונים מטוהרים במשותף הודגמו באמצעות SDS-PAGE ואחריו צביעת קומאסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.