מאמר שיטה

תרבות, הקפאה, עיבוד והדמיה של אורגנואידים וספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל

DOI:

10.3791/64563

⸱

23 בדצמבר 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות לתרבות, הקפאה, הפשרה, עיבוד, צביעה, תיוג ובחינה של ספרואידים ואורגנואידים שלמים תחת מיקרוסקופים שונים, בעוד שהם נשארים שלמים בהידרוג'ל בתוך מכשיר רב תכליתי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים וספרואידים, מבני גידול תלת-ממדיים במעבדות של תרביות תאים, הופכים מוכרים יותר ויותר כמודלים מעולים בהשוואה למודלים של תרביות דו-ממדיות, מכיוון שהם מחקים את גוף האדם טוב יותר ויש להם יתרונות על פני מחקרים בבעלי חיים. עם זאת, מחקרים אלה בדרך כלל להתמודד עם בעיות עם שכפול ועקביות. במהלך התהליכים הניסיוניים הארוכים - עם העברות של אורגנואידים וספרואידים בין כלי תרבית תאים שונים, פיפטינג וצנטריפוגות - מבני הגידול התלת-ממדיים הרגישים והשבריריים האלה נפגעים לעתים קרובות או הולכים לאיבוד. בסופו של דבר, התוצאות מושפעות באופן משמעותי, שכן מבנים 3D לא יכול לשמור על אותם מאפיינים ואיכות. השיטות המתוארות כאן ממזערות את הצעדים המלחיצים הללו ומבטיחות סביבה בטוחה ועקבית עבור אורגנואידים וספרואידים לאורך כל רצף העיבוד בזמן שהם עדיין נמצאים בהידרוג'ל במכשיר רב תכליתי. החוקרים יכולים לגדל, להקפיא, להפשיר, לעבד, להכתים, לסמן ולאחר מכן לבחון את המבנה של אורגנואידים או ספרואידים תחת מכשירי היי-טק שונים, ממיקרוסקופים קונפוקליים ועד אלקטרונים, באמצעות מכשיר רב-תכליתי יחיד. טכנולוגיה זו משפרת את יכולת השכפול, האמינות והתוקף של המחקרים, תוך שמירה על סביבה יציבה ומגנה עבור מבני הגידול התלת-ממדיים במהלך העיבוד. בנוסף, ביטול צעדים מלחיצים ממזער טעויות טיפול, מפחית את הזמן שלוקח ומפחית את הסיכון לזיהום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עתיד המחקר והטיפול בתאים טמון בתרביות תאים תלת-ממדיות 1,2,3. מודלים אורגנואידים וספרואידים סוגרים את הפער בין ניסויים במבחנה לבין מודלים של בעלי חיים על ידי יצירת מודלים טובים יותר המחקים את התפתחות גוף האדם, פיזיולוגיה ומחלות 4,5,6,7,8,9. עם זאת, יכולת השכפול והחזרה של מודלים אלה נותרה מאתגרת. יתר על כן, טיפול, קציר, העברה וצנטריפוגה של מבנים אלה בטכנולוגיות הנוכחיות גורמים לאובדן או נזק של האורגנואידים והספרואידים בתנאים רבים, ומשפיעים באופן משמעותי על התוצאות.

למרות פרוטוקולים רבים לצביעה היסטולוגית, צביעה אימונוהיסטוכימית, תיוג אימונופלואורסצנטי ושימור בהקפאה, אין גישה אוניברסלית הקשורה לסטנדרטיזציה של תנאי ניסוי, טיפול ועיבוד מבנים עדינים אלה מבלי לאבד או לפגוע בהם. הפרוטוקולים הנוכחיים הם גם ארוכים להפליא, לסירוגין בין כמה ימים למספר שבועות, וכוללים הליכים מורכבים עם ריאגנטים שונים 10,11,12,13,14. בנוסף, קציר, פיפטציה, צנטריפוגה והעברת מבני גידול תלת-ממדיים בין כלי תרבית תאים וקריביאלים גורמים לשינויים במיקום המבנים והכוחות המכניים, ובסופו של דבר משפיעים על ההתמיינות וההבשלה של האורגנואידים והספרואידים. דווח כי טופולוגיה של רקמות, מיקום התאים וכוחות מכניים משפיעים באופן משמעותי על התמיינות התאים והבשלתם 6,15,16,17.

לכן, רצוי לשפר את הטכנולוגיות הקונבנציונליות הנוכחיות כדי ליצור אורגנואידים וספרואידים באיכות יציבה. שיטה/מכשיר שידלג על הצנטריפוגה ועל שלבים אחרים שתוארו לעיל ויספק את החומר בסביבה בטוחה אחת מההתחלה ועד הסוף של התהליכים המרובים יועיל להגיע לנתונים העקביים והאמינים ביותר. בנוסף, זה יפחית את מגבלות הזמן, העבודה והעלויות.

ההתקן הרב-תכליתי (MD) המתואר כאן מספק סביבה בטוחה אחת לתהליכים מרובים של אורגנואידים וספרואידים (איור משלים 1). התקן זה ופרוטוקולים משלימים מבטלים את שלבי הקציר, הפיפטציה, ההעברה והצנטריפוגה. האורגנואידים והספרואידים נשארים בסביבת המבחנה שלהם במהלך התהליכים הרציפים. סביבה זו כוללת בעיקר רכיבי מטריצה חוץ-תאית טבעיים או סינתטיים, כמו הידרוג'לים זמינים מסחרית. במילים אחרות, השיטות המתוארות כאן מאפשרות לעבד, לבחון ולהקפיא דגימה שלמה של אורגנואידים/ספרואידים בעודה בתוך טיפת הידרוג'ל.

המכשיר התואם ביולוגית עמיד לטמפרטורות שבין 60 °C ל-160 °C, מה שהופך אותו אפשרי לשחזר את האורגנואידים / סטרואידים במיכל חנקן נוזלי ב -160 °C או להכין בלוקים שרף עבור מיקרוסקופ אלקטרונים ב 60 °C. הנישה במכשיר תוכננה להגדיר מרחב מוגבל למבני גידול תלת-ממדיים ולעורר היווצרות של ספרואידים או אורגנואידים בהתבסס על המחקרים הקודמים 18,19,20,21,22,23. חלק זה של המכשיר שקוף ומכיל פלסטיק ספציפי המספק איכות אופטית גבוהה (מקדם שבירה: 1.43; ערך abbe: 58; עובי: 7.8 מיל [0.0078 אינץ' או 198 מיקרומטר]). גם הגומחה וגם החלק ה'צדדי' שמסביב גורמים לפלואורסצנטיות אוטומטית. הגומחה השקופה במרכזיש 80 מ"מ 2 שטח, בעוד החלק הצדדי הוא 600 מ"מ2. עומק המיכל הוא 15 מ"מ, והעובי הוא 1.5 מ"מ. תכונות אלה, בנוסף לגודלו ולעיצובו של המכשיר, מאפשרות לבצע תצפיות תחת סוגים שונים של מיקרוסקופ היי-טק ולהכין את הדגימות לבדיקות מיקרוסקופיות אלקטרונים (איור 2). מערכת הסגירה של המכשיר מספקת שתי עמדות, האחת אטומה במקפיא והשנייה מאפשרת זרימת גז באינקובטור. מבחני ההתרבות והציטוטוקסיות של CCK8 מדגימים השפעות דומות על התאים בהשוואה למנות המסורתיות של תרביות תאים (איור משלים 2). בדיקת אי-הכללה כחולה של טריפאן מדגימה כדאיות גבוהה של תאים (94%) במהלך תרבית התאים ב-MD (איור 3).

התהליכים שניתן לבצע עבור דגימה אחת במכשיר היחיד כוללים (1) תרבות, (2) צביעה היסטולוגית, (3) אימונוסטינינג, כולל תיוג אימונוהיסטוכימי ואימונופלואורסצנטי, (4) הקפאה, (5) הפשרה, (6) בדיקה תחת מיקרוסקופים אופטיים, כגון שדה בהיר, שדה כהה, פלואורסצנציה, קונפוקל ומיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה, (7) ציפוי ובדיקה ישירות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, או (8) הכנה למיקרוסקופ אלקטרונים ( איור 2).

קיימות מתודולוגיות שונות להכתמה היסטולוגית, תיוג אימונוהיסטוכימי, או תיוג פלואורסצנטי של אורגנואידים וספרואידים 10,11,12,13,14,24,25. קצירתם מההידרוג'ל היא הצעד הראשון והעיקרי של הטכנולוגיה הנוכחית. לאחר שלב זה, שיטות מסוימות מאפשרות תיוג חיסוני שלם. האורגנואידים שנקטפו מוטבעים בפרפין, מחולקים ומסומנים להכתמה וחיסונית אצל אחרים. עם זאת, ייתכן שהסעיפים לא יציגו את המדגם כולו ויספקו רק נתונים מוגבלים הקשורים לארכיטקטורה התלת-ממדית של המבנה. יתר על כן, נזק למבנים תלת-ממדיים אלה ואובדן אנטיגניות הם תופעות לוואי ידועות של טכנולוגיות אלה.

הפרוטוקולים החדשים המשלימים לבדיקות מיקרוסקופיות במאמר זה מאפשרים ניתוח של דגימות שלמות שעדיין נמצאות בהידרוג'ל. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים שתי פורמולציות שפותחו לאחרונה: פתרון לאימונוהיסטוכימיה (S-IHC) ופתרון לתיוג אימונופלואורסצנטי (S-IF). השיטות עם פתרונות אלה מאפשרות לחוקרים לקבל נתונים מדויקים יותר, שכן אין השפעות מזיקות של זרימות עבודה מסורתיות, כגון צנטריפוגה, פיפטינג והעברה של המבנים העדינים. הפרוטוקול המתואר כאן גם מבטל את הצורך בשלבי קציר, חסימה, ניקוי ואחזור אנטיגן, ומקצר את כל ההליך ל-6-8 שעות. יתר על כן, המתודולוגיה מאפשרת להוסיף בו זמנית נוגדנים אחד עד שלושה נוגדנים לאותו S-IF. לכן, ניתן לקבל את התוצאות באותו יום גם לאחר ניסויי הסימון המרובים, וזה יתרון נוסף של הפרוטוקול המתואר כאן; פרוטוקולים מסורתיים לתיוג אימונופלואורסצנציה בהרכבה מלאה נמשכים בדרך כלל בין 3 ימים למספר שבועות 10,11,12,13,14.

גם הטמעת פרפין, צעד מזיק נוסף שמפחית את האנטיגניות, מושמטת. המבנה התלת-ממדי נשאר בסביבת המבחנה שלו מתחילת הבדיקה המיקרוסקופית ועד סופה. מאחר שהמבנה התלת-ממדי נשאר בתנאי הגידול שלו, ביטוי החלבון ונתוני הלוקליזציה מחקים טוב יותר את תנאי ה-in vivo. צפויות תוצאות מדויקות יותר, שכן המתודולוגיה מבטלת את השלבים המשפיעים על ביטוי האנטיגן של הדגימה. טבלה 1 וטבלה 2 מדגימות כיצד פרוטוקולים חדשים אלה מבטלים שלבים, חוסכים זמן ועבודה במעבדה ומפחיתים עלויות ומוצרי פסולת בהשוואה לזרימות עבודה מסורתיות.

בנוסף לשלבים המכריעים שתוארו לעיל, בעיה נוספת היא מתן מדיום ושיטה לשימור בהקפאה לשימור המבנה התלת-ממדי של הדגימה עם שיעורי כדאיות תאים גבוהים יותר 26,27,28,29,30,31. שימור בהקפאה חיוני ליצירת מערכת מודל יציבה ולאפשר ביו-בנקציה של אורגנואידים וספרואידים32,33. ביו-בנקאיות של כל המבנה התלת-ממדי המקורי תאפשר סיכום נאמן יותר של המצב הטבעי של בריאות או מחלה. השיקולים המרכזיים הם הנוחות והאמינות של שימור בהקפאה והפשרת אורגנואידים/ספרואידים. התאוששות אורגנואידית לאחר הפשרה היא נמוכה מאוד ברוב הטכנולוגיות הנוכחיות, לעתים קרובות פחות מ -50%. עם זאת, מחקרים אחרונים הראו תוצאות מבטיחות עם שיעורי הישרדות משופרים26,27,28,29. Lee et al. הראו כי 78% מהתאים הספרואידים שרדו לאחר שימור בהקפאה כאשר השתמשו בתמיסה של אוניברסיטת ויסקונסין המכילה 15% DMSO28. יחס הישרדות התאים עלה ל-83% במחקר של Arai et al.29. עם זאת, התוצאות לאחר שימור בהקפאה מושפעות באופן משמעותי מכיוון שהמבנים התלת-ממדיים אינם יכולים לשמור על אותם מאפיינים ואיכות. בנוסף, ריאגנטים ללא סרום נדרשים לתרגול ייצור טוב במסגרות פרמצבטיות ואבחון. תהליכי עבודה מסורתיים משתמשים במדיום המכיל סרום בקר עוברי (FBS) ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) לשיטת ההקפאה האיטית, שניהם קשורים לנכים. FBS הוא מוצר שמקורו בבעלי חיים ויכולות להיות לו וריאציות אצווה. DMSO הוא מגן קריוטרסי מוצלח מאוד, אך חשיפה ארוכת טווח, במיוחד במהלך הפשרה, עלולה לגרום להשפעות ציטוטוקסיות30,31.

מאמר זה מתאר גם את מתודולוגיית ההקפאה/הפשרה של אורגנואידים או ספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל. במחקר נעשה שימוש בשתי נוסחאות להקפאת אורגנואידים וספרואידים: (1) 10% DMSO המכיל תמיסת הקפאה מסורתית (FS) ו-(2) מדיום שימור בהקפאה ללא סרום ו-DMSO. מדיום שימור בהקפאה זה מכיל רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, השונים מהנוסחאות הנוכחיות. המטריצה החוץ-תאית מורכבת משני סוגים עיקריים של מקרומולקולות, פרוטאוגליקנים וחלבונים סיביים, החיוניים לפיגומים פיזיקליים עבור מרכיבי התאים, אך גם יוזמים תהליכים הדרושים למורפוגנזה של רקמות, התמיינות והומאוסטזיס 34,35,36,37,38,39,40 . קולגן מספק חוזק מתיחה, מווסת את הידבקות התאים, תומך בכימוטקסיס ובנדידה ומפתח רקמות ישיר37. בנוסף, סיבי אלסטין מספקים רתיעה לרקמות שעוברות מתיחה חוזרתונשנית 38. חלבון סיבי שלישי, פיברונקטין, מכוון את הארגון של המטריצה הבין-תאית הבין-תאית ויש לו תפקיד מכריע בתיווך ההתקשרות של התא ומתפקד כמווסת מכני חוץ-תאי39. Du et al. הדגימו את ההשפעה המגנה על הקרינה של הידרוליזט קולגן עוף על מערכת המודל הטבעית של אקטומיוזין41. התוצאות שלהם מצביעות על כך שהידרוליזט קולגן יכול לעכב צמיחה של גבישי קרח, להפחית את הדנטורציה והחמצון של חלבונים באופן דומה למגיני קרינה מסחריים, ולספק מבנה ג'ל טוב יותר לאחר מחזורי הפשרה בהקפאה. לכן, הוספת רכיבי מטריצה חוץ-תאית למדיית השימור בהקפאה מספקת סביבה בטוחה ומגנה יותר עבור הדגימה ותומכת במבנים החיים להחלים לאחר הקפאה-הפשרה.

בנוסף, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול פשוט לסימון ממברנות ציטופלסמיות וגרעינים של אורגנואידים חיים וספרואידים בזמן שהם עדיין נמצאים בהידרוג'ל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גידול אורגנואידים וספרואידים

  1. מניחים את ההידרוג'ל על הקרח למשך הלילה (במקרר או בחדר קר) כדי להפשיר.
  2. הניחו את המכשיר הרב-תכליתי הזמין מסחרית (MD; ראו טבלת חומרים) באינקובטור יום אחד לפני הניסוי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) כדי להתחמם.
  3. מניחים במקרר קצוות פיפטה סטריליים רחבים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: שלבים 1.1-1.3 יבוצעו ביום 0, ושלבים 1.4-1.11 יבוצעו ביום 1.
  4. הניחו את ההידרוג'ל על קרח במכסה מנוע של זרימה למינרית למשך 15 דקות.
    1. אופציונלי: לדלל את ההידרוג'ל במדיום תרבית תאים קרים בהתאם להמלצת היצרן.
  5. מניחים את הצינור המכיל כדור של תאי HepG2 (קו תאי קרצינומה הפטוצלולרית שהושגו באופן מסחרי; ראו טבלת חומרים) על קרח.
  6. צלחת 30-35 μL של 100% הידרוג'ל בתוך הגומחה של המכשיר שחומם מראש כדי ליצור טיפת ג'ל.
  7. הניחו 10,000 תאי HepG2 במרכז החלק העליון של כל טיפת הידרוג'ל (איור 2), ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  8. כסו את טיפת ההידרוג'ל ב-200 μL של ה-Modified Eagle Medium (DMEM) של דולבקו עם סרום בקר עוברי 10%.
  9. כסו את מכסה ה-MD במיקום הנכון כדי לאפשר זרימת גז, והניחו את המכשיר באינקובטור.
  10. הזן את התאים עם 200 μL של DMEM עם 10% FBS כל יומיים.
  11. בדקו את הצמיחה של הספרואידים תחת מיקרוסקופ הפוך (איור 3). היווצרות ספרואידים מתחילה לאחר היוםהשלישי . סרטון 1 מראה את מיקומם של ספרואידים ברמות שונות בכיפת הידרוג'ל.
    הערות: מומלץ מאוד לשאוף בעדינות את הנוזל המקיף את ההידרוג'ל ולהוסיף באיטיות את הנוזל החדש לסביבה כדי למנוע פגיעה בטיפות ההידרוג'ל.

2. הכתמת המטוקסילין ואוזין של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

  1. מחממים את המקבע (4% פרפורמלדהיד; PFA), PBS והמטוקסילין (ראו טבלת חומרים) עד 37 מעלות צלזיוס.
  2. שאפו את המדיום המקיף את טיפת ההידרוג'ל עם פיפטה, הוסיפו 100-200 מיקרון ליטר של 4% PFA כדי לתקן, ודגרו במשך 15-20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. שאפו את ה-4% PFA והוסיפו 200 מיקרון ליטר של PBS כדי לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את ה- PBS ודגרו עם 200 μL של תמיסת המטוקסילין למשך 15-20 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  4. שאפו את המטוקסילין והוסיפו 200 μL של dH2O כדי לשטוף 3x במשך 10 דקות כל אחד ב 37 מעלות צלזיוס. שאפו את dH2O ודגרו עם 200 מיקרון ליטר של אתנול למשך 5-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
  5. שאפו את האתנול ודגרו עם 200 מיקרון ליטר של Eosin (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שאפו את האוזין והוסיפו 200 מיקרון ליטר של dH2O לשטיפה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  6. שאפו את dH2O והוסיפו 100 μL של גליצרול כדי לכסות את טיפת ההידרוג'ל כמדיום ההרכבה.
  7. אופציונלי: הרכב את הגומחה עם כיסוי. ניתן להשמיט שלב זה כדי למנוע סחיטת אורגנואידים/ספרואידים בגודל ניכר.
  8. סגרו היטב את מכסה ה-MD כדי למנוע ייבוש עד לבדיקה. המדגם יציב לבדיקה לפחות 6 חודשים.

3. אימונוהיסטוכימיה של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

  1. חמם את הפתרון המתקבל באופן מסחרי לאימונוהיסטוכימיה (S-IHC; ראו טבלת חומרים) ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. דגירה של אורגנואידים או ספרואידים בהידרוג'ל עם 3% מי חמצן (H 2 O 2) ב200 μL של dH2 O במשך 5 דקות ב 37מעלות צלזיוס.
  3. שאפו את תמיסת מי החמצן ושטפו ב- dH2O למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שאפו את dH2O ודגרו פעמיים עם 100 μL של S-IHC ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כל אחד.
  4. שאפו את ה-S-IHC ודגרו עם 100 μL של נוגדן ראשוני (ראו טבלת חומרים) מדולל ב-S-IHC במשך 1-2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס (בהתאם להמלצות היצרן לגבי דילול עבודה).
  5. שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ודגרו עם 100 μL של S-IHC 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס.
  6. שאפו 100 μL של S-IHC ודגרו עם נוגדן משני ביוטינילציה (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ודגרו עם 100 μL של S-IHC 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו את ה-S-IHC ודגרו עם 100 μL של חזרת פרוקסידאז (HRP) עם התווית סטרפטאבידין (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  8. שאפו את HRP שכותרתו סטרפטאבידין ודגרו עם 100 μL של S-IHC 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס.
  9. שאפו את ה-S-IHC ודגרו עם תערובת תמיסת כרומוגנית DAB/AEC של 100 מיקרוגרם (ראו טבלת חומרים) למשך 5-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
  10. עקוב אחר עוצמת הכתמים תחת מיקרוסקופ אור.
  11. יש לשטוף עם dH 2 O 3x במשך2דקות כל אחד.
  12. אופציונלי: דגירה עם 100 μL של המטוקסילין (ראו טבלת חומרים) עבור צביעה נגדית גרעינית למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  13. שאפו את המטוקסילין ושטפו ב- dH2O למשך 5 דקות.
  14. שאפו את dH2O וכסו את טיפת ההידרוג'ל ב-100 מיקרו-ליטר של גליצרול כמדיה הגוברת.
  15. יש לסגור את מכסה ה-MD בחוזקה עד לבדיקה מיקרוסקופית.
    הערות: שלבי אחזור אנטיגן וחסימת חלבונים מושמטים בפרוטוקול זה מכיוון ש- S-IHC מבטל שלבים אלה.

4. תיוג אימונופלואורסצנטי של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

  1. חממו את החומרים הבאים ל-37 מעלות צלזיוס: 4% PFA, PBS, S-IF, תמיסת נוגדנים ראשונית ב-S-IF, תמיסת נוגדנים שניונית ב-S-IF, כתם גרעיני וגליצרול (ראו טבלת חומרים).
  2. שאפו את מדיום תרבית התאים ותיקנו עם 200 μL של 4% PFA למשך 15-30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו את המקבע ושטפו ב-S-IF 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף dH2O לצד המקיף את הגומחה כדי לספק לחות במהלך השלבים הבאים.
  4. שאפו את ה-S-IF המקיף את טיפת ההידרוג'ל ודגרו את טיפת ההידרוג'ל עם 100 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית (ראו טבלת חומרים) ב-S-IF למשך 30-60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
  5. שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטפו ב- S-IF 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס.
  6. שאפו את ה-S-IF ודגרו עם 100 μL של תמיסת נוגדנים משנית (ראו טבלת חומרים) ב-S-IF למשך 30-60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  7. שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו עם PBS 3x למשך 10 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס בחושך.
  8. שאפו את ה-PBS ודגרו עם 100 μL של כתם דנ"א גרעיני המכיל מדיום הרכבה או גליצרול ב-37 מעלות צלזיוס בחושך.
  9. מלאו את הגומחה בגליצרול כדי למנוע ייבוש.
  10. אופציונלי: כסו את הגומחה בכיסוי. ניתן להשמיט שלב זה כדי למנוע סחיטה של האורגנואידים/ספרואידים.
  11. סגור היטב את ה- MD. דגימות ב- MDs ניתן לאחסן ב 4 °C בחושך לפחות 6 חודשים עם אובדן מינימלי של פלואורסצנציה.
  12. השתמש בהגדרות הבאות לבדיקה מיקרוסקופית קונפוקלית: הגדר את ערך חור הפין של כל הערוצים ל- 20.1, החזק את קבוע מאסטר הרווח ב- 550 עבור 488 ננומטר, 485 עבור 550 ננומטר ו- 450 עבור 594 ננומטר, שמור על כוח לייזר קבוע עבור כל הניסויים, והאחוז הנמוך ביותר ב- 2.0.
    הערות: נוגדנים ראשוניים: אנטי-נה-K ATPase (1:100), אנטי-ארגינאז (1:50), אנטי-אלבומין (1:50), אנטי-בטא-גלקטוזידאז (1:25), נוגדן אנטי-מיטוכונדריאלי (1:100), נוגדן אנטי-גולג'י (1:50), אנטי-ציטוקרטין 5 (1:100), נוגדן Ov6 (1:100). נוגדנים משניים: עז נגד ארנב IgG (H+L)- 488, עז נגד ארנב IgG (H +L)-550, עז נגד עכבר IgG (H +L)-488, עז נגד עכבר IgG (H +L)-550, עז נגד עוף IgY(H+L)-647. הדילול של כל הנוגדנים המשניים הוא 1:100. בנוסף, נעשה שימוש גם ב-FITC-Phalloidin (1:100), נוגדן מצומד (ראו טבלת חומרים).

5. קרום פלזמה ותיוג גרעין של אורגנואידים חיים וספרואידים בהידרוג'ל

  1. הכינו תמיסת תיוג המכילה אגלוטינין נבט חיטה פלואור של אלקסה (5.0 מיקרוגרם/מ"ל) ו-Hoechst (2 מיקרומטר) בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), בהתאם להמלצות היצרן (ראו טבלת חומרים), וחממו עד 37 מעלות צלזיוס.
  2. שאפו את מדיום תרבית התאים והוסיפו 100 μL של תמיסת תיוג כדי לכסות את טיפת ההידרוג'ל. דגירה במשך 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. הסר את תמיסת הסימון וכבס פעמיים ב- PBS 2x במשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אופציונלי: תקן עם 200 μL של 4% פורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. מכסים את טיפת ההידרוג'ל בגליצרול כמדיום הרכבה. אופציונלי: הרכב את הגומחה עם כיסוי.
  5. סגרו את מכסה ה-MD בחוזקה והשאירו אותו בקירור בחושך עד לבדיקה פלואורסצנטית/מיקרוסקופית קונפוקלית. הוא יציב לפחות 6 חודשים.

6. הקפאה והפשרה של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

  1. הקפיאו את האורגנואידים לפי השלבים הבאים.
    1. חמם את תמיסת ההקפאה שהושגה באופן מסחרי (FS; ראו טבלת חומרים) ל-37 מעלות צלזיוס.
    2. שאפו בעדינות את אמצעי התקשורת של תרביות התאים המקיפים את כיפת ההידרוג'ל.
    3. הוסף 200 μL של FS בעדינות. לדגום את הדגימה עם FS ב 37 °C במשך 1 שעות.
    4. סגור את מכסה המכשיר בחוזקה והנח אותו בקופסת קצף. הנח קופסת קצף זו בקופסת קצף אחרת, כפי שמוצג באיור משלים 3. סגרו את שתי קופסאות הקצף בחוזקה. שתי קופסאות קצף אחת בתוך השנייה מספקות טווח שיפוע קירור טמפרטורה של 1 עד 2° צלזיוס לדקה של הדגימה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
    5. מניחים את הקופסה בטמפרטורה של -20°C למשך שעתיים. מעבירים את הקופסה למקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות ומשאירים ללילה.
    6. הוציאו את הדגימה מהקופסאות. הדגימה ב- MD יכולה להישמר במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
    7. העבר את ה- MD המכיל את הדגימה למיכל החנקן הנוזלי לאחסון לטווח ארוך יותר.
  2. הפשירו את האורגנואידים בעקבות השלבים הבאים.
    1. מוציאים את ה-MD המכיל את הדגימה מהמקפיא/מיכל החנקן ומניחים אותה ישירות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. דגירה במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 200 μL של מדיום תרבית חמה לנישה (היחס בין FS למדיום תרבית תאים הוא 1:1) ודגרה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף מדיום תרבית חם יותר לנישה (היחס בין FS למדיום תרבית תאים הוא 1:2) ודגרה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. שאפו בעדינות את תערובת המדיום וה- FS. המשך למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (שלב 7) ומיקרוסקופיית אלקטרונים (שלב 8) הדמיה של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל.

7. סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים של אורגנואידים/ספרואידים שלמים

  1. חממו את הפתרון המקבע והפוסט-מקבע של קרנובסקי (ראו טבלת חומרים) לטמפרטורת החדר (RT).
  2. שאפו את מדיום תרבית התאים המקיף את ההידרוג'ל ב-MD. הניחו את הדגימה ב-MD על קרח במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית למשך 15 דקות.
  3. שאפו בעדינות רבה את ההידרוג'ל הנוזלי המקיף את האורגנואידים/ספרואידים. כמות מוגבלת של מטריגל יכולה להישאר בנישה כדי למנוע פגיעה ואובדן הדגימה.
  4. תקן עם המקבע של קרנובסקי (2% PFA, 2.5% גלוטראלדהיד בחיץ קקודילאט 0.15 M, ו-2 mM CaCl2; ראה טבלת חומרים) ב-RT למשך שעה אחת.
  5. שאפו את המקבע בעדינות ושטפו במים מזוקקים (dH2O) 3x למשך 15 דקות כל אחד.
  6. שאפו בעדינות את dH2O ותיקנו עם תמיסה פוסט-קיבוצית (1% אטטרוקסיד אוסמיום מימי [OsO4]; ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך שעה אחת.
  7. יש לשאוף בעדינות את הפוסט-קיבוע ולשטוף במים מזוקקים (dH2O) 3x למשך 15 דקות כל אחד.
  8. התייבשו בסדרה מדורגת של אתנול (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), תערובת אתנול/אצטון (1:1; 1:2), ואצטון מוחלט ב-RT למשך 15 דקות כל אחד.
  9. יש לייבש עם מייבש נקודה קריטית.
  10. מצפים את הדגימה במכשיר בזהב/פלדיום 6 ננומטר באמצעות מעיל מפזר (ראו טבלת חומרים) למשך 90 שניות.
  11. התבונן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם גלאי אלקטרונים משני בעדשה ב 2-3 kV במצב ואקום (5 x 10-6 mA). צלם תמונות עם מרחק עבודה של 8.1-8.2 מ"מ ובהגדלות של 675x, 1050x ו- 1570x.
    הערות: כל השלבים מבוצעים ב- MD. השתמש בתמיסה של 200-250 μL עבור כל שלב.

8. מיקרוסקופיית אלקטרונים של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

  1. לחמם את המקבע של קרנובסקי ל 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מדיום תרבית התאים המקיף את ההידרוג'ל ב-MD.
  2. תקן את המדגם עם המקבע של קרנובסקי ב- RT למשך שעה אחת. יש לשטוף עם dH2O 3x במשך 15 דקות כל אחד.
  3. לאחר התיקון עם 2% OsO4 מימי ו-2.5% אשלגן פרוציאניד ב-RT למשך 45 דקות. יש לשטוף עם dH2O 3x במשך 10 דקות כל אחד.
  4. דגירה ב-0.5% תיוקרבוהידראזיד (TCH; ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך 30 דקות. יש לשטוף עם dH2O 3x במשך 10 דקות כל אחד.
  5. דגירה ב-OsO4 מימי ב-2% ב-RT למשך 30 דקות. יש לשטוף עם dH2O 3x במשך 10 דקות כל אחד.
  6. דגירה בתמיסת אורניל אצטט של 2% (ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך שעה אחת.
    הערה: בשלב זה, ניתן לשמור על ספרואידים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  7. דגירה בתמיסת אספרטט עופרת (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. יש לשטוף עם dH2O 3x במשך 10 דקות כל אחד.
  8. התייבשו בסדרה מדורגת של אתנול (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) ואצטון מוחלט ב-RT למשך 15 דקות כל אחד.
  9. יש לטפל בתערובת של (1:1; 1:2) שרף אצטון/אפון ושרף אפון טהור (ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך שעתיים כל אחד.
  10. פילמר את השרף ב-60°C למשך הלילה (מינימום 16 שעות). לאחר הפילמור, הסר את בלוק השרף מה-MD, כפי שמוצג באיור משלים 4.
  11. חברו את גוש השרף לגוש גדול יותר עם דבק שרף. חותכים את הבלוק ומגיעים למיקום של אורגנואידים או ספרואידים.
  12. קבל חלקים דקים למחצה (1,000 ננומטר) ודקים במיוחד (60 ננומטר) באמצעות אולטרה-מיקרוטום (ראה טבלת חומרים).
  13. מקם את החלקים הדקים במיוחד על רשתות נחושת של 100 רשתות רשת והתבונן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם גלאי STEM במתח מואץ של 30 קילו-וולט. צלם תמונות במרחק עבודה של 44 מ"מ ובהגדלות של 2580x, 5020x ו- 6060x.
    הערות: השתמש בתמיסה של 200-250 μL עבור כל שלב. שלבים 8.1-8.10 מבוצעים ב- MD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המאמר הנוכחי מייצג מכשיר רב-תכליתי (MD) ומתודולוגיות משלימות לתרבות, הקפאה, הפשרה, צביעה היסטולוגית, צביעה אימונוהיסטוכימית, תיוג אימונופלואורסצנטי, ציפוי ועיבוד של אורגנואידים או ספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל בסביבה אחת בעלת עיצוב ייחודי. המחקר הנוכחי נועד להכין ספרואידים של סרטן הכבד HepG2 ב-35 טיפות הידרוג'ל ב-35 MDs. הניסויים נערכו במשולש כדי להבטיח דיוק. בנוסף, אורגנואידים של ריאות ב-MDs סומנו כדוגמה להדגמת התוצאות של המתודולוגיות הנוכחיות למחקרים אורגנואידיים.

איור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-MD, המשלים את הפורמולציות והפרוטוקולים המתוארים כאן, מאפשר צמיחה תלת-ממדית מהירה וספונטנית של אורגנואידים וספרואידים בסביבה מבוקרת יותר וממשיך את הניסוי באותם תנאים. הדגימה נשארת באותה סביבה במהלך כל התהליך, וכמעט 100% מארכיטקטורות הגידול התלת-ממדיות נשארות שלמות במיכל. זה משפר את ההומוגניות במהלך הניסויים הרציפים ומאפשר תקופת תרבות ממושכת. בנוסף, מספר השלבים במהלך עיבוד אורגנואידים וספרואידים מופחת באופן דרסטי בהשוואה לזרימות עבודה מסורתיות (איור 4), מה שבתורו ממזער את זמן הטיפול וטעויות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רנאן גולהאן אקטס הוא הבעלים של MD, S-IHC, S-IF ו-FS בקשות פטנט. אולגו אניס טוק היה מעורב בפיתוח מוצרים אלה. אולגו אניס טוק וגמזה דמירל הם חברי צוות מו"פ של החברה בשם Cellorama. ליוסוף מוסטפא סאצ'י, זיינפ אקבולוט ואוזג'קאן קאיאלאר אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לדייל מרטס מאוניברסיטת שיקגו על הכנת הדיאגרמות, לד"ר מהמט סריף איידין על תמיכתו הטכנית במכון המחקר למדעי הבריאות והטכנולוגיות של אוניברסיטת איסטנבול מדיפול, ולד"ר ראנה קאזמי מאוניברסיטת מלטפה על עריכת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול אבסולוטי (EtOH)Merck8187602500לדלל ב-dH2O כדי לייצר תמיסה של 30%, 50%, 70%, 80%, 90% ו-96% ולאחסן בחנות RT
AcetoneMerck8222512500ב-RT
Alexa fluor נבט חיטה אגלוטינין ו-Hoechst  בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE ממברנת פלזמה וערכת תיוג גרעינית, אחסן ב-20 מעלות; C
אלפא-1-פטו-פרוטאין (AFP) נוגדנים פוליקלונליים מרוכזים ומדוללים מראשBiocare MedicalCP 028 Aחנות ב-+4 מעלות; C
נוגדן נגד אלבומיןAbcamEPR20195חנות ב +4 & deg; C, דילול: 1:50
נוגדן אנטי בטא גלקטוזידאז, עוף פוליקלונליAbcam134435לאחסן ב-+4 מעלות; C, דילול: 1:25
אנטי-ציטוקרטין 5Abcam53121יש לאחסן ב-+4 & deg; C, דילול: 1:100
Arginase-1 ארנב מרוכז ומדולל מראש נוגדן חד שבטי BiocareMedicalACI 3058 A, BStore ב-+4 & deg; C, דילול: 1:50
סידן כלורי (CaCl2)SigmaC1016-500Gמתמוססים בקיבוע של קרנובסקי ליצירת 2 מ"מ CaCl2; יש לאחסן
ב-RT Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
צינורות צנטריפוגה, 15 מ"ל קן601051
צינורות צנטריפוגה, 50 מ"ל Nest602052
Class II ארון בטיחות מיקרוביולוגי Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 חממהPanasonicKM-CC17RU2
רשתות נחושתמיקרוסקופיה אלקטרוניתG100-Cuחלקים דקים במיוחד מונחים על הרשתות; 100 קווים/אינץ' רשת מרובעת
מייבש נקודה קריטיתLeicaEM CPD300לייבוש דגימות ביולוגיות ליישומי SEM בתערובת
תמיסת כרומוגן DAB/AEC אצטון מוחלט  חנות Sigma AldrichAEC101ב-+4 ° C
סכין יהלוםדיאטוםאולטרה 45°, 40-USשימוש לקטעים דקים במיוחד עבור TEM
דימתיל סולפוקסיד לביולוגיה מולקולריתBiofroxx67-68-5
חד פעמי פלסטיק פסטר פיפטותקן
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029חנות ב +4 & deg; C
Eosin Y תמיסה אלכוהוליתבהירה שקופית2.BS01-105-1000
שרף אפון Sigma45359-1EA-Fערכה בינונית להטמעת אפוקסי, יש לאחסן בטמפרטורה של +4 & deg;
C סרום בקר עוברי עם תוסף מחזקPan BiotechP30-3304חנות ב-+4 מעלות;
תמיסת הקפאה C (FS)CelloramaCellO-Fב +4 & deg; C
יצרנית סכיני זכוכיתLeicaEM KMR3לייצור סכיני זכוכית בעובי 8 מ"מ
רצועות סכין זכוכית (גודל 8 מ"מ x 25.4 מ"מ x 400 מ"מ)Leica7890-08השתמש בקטעים דקים במיוחד או חצי עבור
תמיסה מימית TEM Glutaraldehyde, דרגת EM, 25% מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית16210לדלל ב-dH2O כדי ליצור תמיסה של 2.5% ולאחסן ב-+4 ו-deg;
תמיסת C גליצרולסיגמא אולדריץ'56-81-5חנות ב -20 C, דילול: 1:100
נוגדן משני נגד עוף עיזים IgY (H + L), Alexa, 647InvitrogenA32933חנות ב- RT
עז נגד עכבר IgG (H + L) נוגדן משני, DyLight, 488Invitrogen35502חנות ב +4 & deg; ג,  דילול: 1:50
נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עיזים, DyLight, 550Invitrogen84540חנות ב-+4 & deg; ג,  דילול: 1:50
עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני, DyLight, 488Invitrogen35552חנות ב +4 & deg; ג,  דילול: 1:50
נוגדן משני נגד ארנב עז IgG (H+L), DyLight, 550Invitrogen84541חנות ב-+4 & deg; C
המטוקסילין האריס שקופית בהירה2.BS01-104-1000
תאי HepG2ATCCHB-8065אחסן במיכל חנקן
אדם/חולדה OV-6 נוגדן עכבר חד שבטי IgG1 שיבוט # OV-6R& D SystemsMAB2020חנות ב-20 מעלות; C
הידרוג'לקורנינג354248מטריג'ל, מטריצת ממברנת מרתף בריכוז גבוה (HC), ללא LDEV, 10 מ"ל, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
הידרוג'לקורנינג354234מטריג'ל, מטריצת ממברנת מרתף, ללא LDEV, 10 מ"ל, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
הידרוג'לThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, ללא LDEV גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנה בסיסית
הידרוג'לביוטכנולוגיה, מו"פ & D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, חנות ב-20 מעלות;
של קרנובסקי%2 PFA, %2.5 גלוטרלדהיד במאגר קקודילאט 0.15 M, 2 מ"מ CaCl2; הכן טרי; השתמש עבור TEM & דגימות SEM
L-חומצה אספרטיתסיגמא11189-100Gאחסן בתמיסת
עופרת RT אספרטטממיסים 40 מ"ג חומצה אספרטית ב-10 מ"ל ddH2O ומוסיפים 66 מ"ג עופרת חנקתית. התמיסה מתייצבת ב-60 מעלות; C ולהתאים את ה-pH ל-5; הכינו
טרי עופרת חנקתיתאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית17900חנות ב RT
Leica מיקרוסקופ קונפוקליLeicaDMi8
LSM 700 סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקליZeiss
קורא מיקרופלייטBiotek Synergy
מכשיר רב תכליתי (MD)CelloramaCellO-M
כתם DNA גרעיניInvitrogenH3569Hoechst 33258, פנטהידראט (ביס-בנזמיד) - תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל במים, יש לאחסן בטמפרטורה של +4 מעלות; C
כתמי DNA גרעינייםThermoFischer Scientific62248תמיסת DAPI, אחסן ב-+4 & deg; C
אוסמיום טטרוקסיד (OsO4) ,4%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים19190לדלל ב-dH2O כדי ליצור תמיסה של 2%; אחסן ב-+4 & deg; C ובמיכל אטום; להגן על
אור נוגדן Ov6R& מערכות DMAB2020לאחסן ב-+4 ו-deg;
תמיסת C Paraformaldehyde (PFA), 4% Sigma1.04005.1000ממיסים 4% PFA ב-dH2O ומרתיחים, מצננים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; תמיסת
C Paraformaldehyde 4% ב-PBS, 1 ליטרSanta Cruz Biotechnologysc-281692חנות ב-+4 & deg; C
Phosphate Buffered Sa Salt (PBS), טבליותMP Biomedicals, LLC2810305
תמיסה%2 OsO4, %2.5 אשלגן פרוציאניד ב-dH2O; הכינו
תמיסה מימית טרייה של אשלגן פרוציאניד, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01חנות ב-RT
Primovert - מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך - ZEISSZeiss מספר פריט: 491206-0001-000
צינורות מיקרוצנטריפוגה תחתונים עגולים, 2 מ"לNest620611
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם חיבור STEMZeissGeminiSEM 500אנו משתמשים בגלאי אלקטרונים משניים (SE) של Inlens בתדר 2-3 קילו וולט לסריקת מיקרוגרפים אלקטרונים וגלאי aSTEM בתדר 30 קילו וולט למיקרוגרפי אלקטרונים שידור.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125חנות ב-+4 מעלות; C
נתרן קקודילאט מאגר, 0.4 מ', pH 7.2מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים11655מדלל ב-dH2O כדי ליצור 0.2 מ' ולאחסן ב-+4 מעלות; C
נתרן/אשלגן ATPase אלפא 1 נוגדן [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871לאחסן ב-20 מעלות; תמיסת C
לתיוג אימונופלואורסצנטי (S-IF)CelloramaCellO-IFאחסן ב-+4 מעלות;
תמיסת C לאימונוהיסטוכימיה (S-IHC)CelloramaCellO-PStore ב-+4 °
C מכשיר חיתוך דגימהLeicaEM TRIM2להכנת בלוק דגימה epon לציפוי מקרטע אולטרה-מיקרוטום
LeicaEM ACE200ציפוי דגימות SEM עם זהב/פלדיום 6 ננומטר למשך 90 שניות
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5Gמדלל ב-dH2O ליצירת תמיסה של 0.5% ומסנן עם 0.22 & מיקרו; מסנן קרום m; חנות ב-RT; הכן טרי
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
אולטרה ג'ל סופר דבקPattexPSG2Cלדבק פולימר אפון בלוק עם מדגם למחזיק בלוק אפון
UltramicrotomeLeicaEM UC7להכנת קטעים דקים במיוחד או חצי איכותיים למיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)
טיפים לפיפטה אוניברסלית, 10 ומיקרו; LNest171215-1101
קצות פיפטה אוניברסליים, 1000 ומיקרו; LIsolabL-002
קצות פיפטה אוניברסליים, 200 ומיקרו; L Nest110919HA01
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400לדלל ב-dH2O כדי ליצור תמיסה ומסנן של 2% עם 0.22 µ מסנן קרום m; שמור על חנות מכולות סגורה היטב ב-RT
מדעי חנות הקיבוע פוסט-קיבוע

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208(2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578(2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907(2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159(2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149(2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133(2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614(2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole Mount ImagingCryopreservation

מאמרים קשורים