תרבות, הקפאה, עיבוד והדמיה של אורגנואידים וספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל

עתיד המחקר והטיפול בתאים טמון בתרביות תאים תלת-ממדיות ^1,2,3. מודלים אורגנואידים וספרואידים סוגרים את הפער בין ניסויים במבחנה לבין מודלים של בעלי חיים על ידי יצירת מודלים טובים יותר המחקים את התפתחות גוף האדם, פיזיולוגיה ומחלות 4,5,6,7,8,9^. עם זאת, יכולת השכפול והחזרה של מודלים אלה נותרה מאתגרת. יתר על כן, טיפול, קציר, העברה וצנטריפוגה של מבנים אלה בטכנולוגיות הנוכחיות גורמים לאובדן או נזק של האורגנואידים והספרואידים בתנאים רבים, ומשפיעים באופן משמעותי על התוצאות.

למרות פרוטוקולים רבים לצביעה היסטולוגית, צביעה אימונוהיסטוכימית, תיוג אימונופלואורסצנטי ושימור בהקפאה, אין גישה אוניברסלית הקשורה לסטנדרטיזציה של תנאי ניסוי, טיפול ועיבוד מבנים עדינים אלה מבלי לאבד או לפגוע בהם. הפרוטוקולים הנוכחיים הם גם ארוכים להפליא, לסירוגין בין כמה ימים למספר שבועות, וכוללים הליכים מורכבים עם ריאגנטים שונים 10,11,12,13,14. בנוסף, קציר, פיפטציה, צנטריפוגה והעברת מבני גידול תלת-ממדיים בין כלי תרבית תאים וקריביאלים גורמים לשינויים במיקום המבנים והכוחות המכניים, ובסופו של דבר משפיעים על ההתמיינות וההבשלה של האורגנואידים והספרואידים. דווח כי טופולוגיה של רקמות, מיקום התאים וכוחות מכניים משפיעים באופן משמעותי על התמיינות התאים והבשלתם 6,15,16,17.

לכן, רצוי לשפר את הטכנולוגיות הקונבנציונליות הנוכחיות כדי ליצור אורגנואידים וספרואידים באיכות יציבה. שיטה/מכשיר שידלג על הצנטריפוגה ועל שלבים אחרים שתוארו לעיל ויספק את החומר בסביבה בטוחה אחת מההתחלה ועד הסוף של התהליכים המרובים יועיל להגיע לנתונים העקביים והאמינים ביותר. בנוסף, זה יפחית את מגבלות הזמן, העבודה והעלויות.

ההתקן הרב-תכליתי (MD) המתואר כאן מספק סביבה בטוחה אחת לתהליכים מרובים של אורגנואידים וספרואידים (איור משלים 1). התקן זה ופרוטוקולים משלימים מבטלים את שלבי הקציר, הפיפטציה, ההעברה והצנטריפוגה. האורגנואידים והספרואידים נשארים בסביבת המבחנה שלהם במהלך התהליכים הרציפים. סביבה זו כוללת בעיקר רכיבי מטריצה חוץ-תאית טבעיים או סינתטיים, כמו הידרוג'לים זמינים מסחרית. במילים אחרות, השיטות המתוארות כאן מאפשרות לעבד, לבחון ולהקפיא דגימה שלמה של אורגנואידים/ספרואידים בעודה בתוך טיפת הידרוג'ל.

המכשיר התואם ביולוגית עמיד לטמפרטורות שבין 60 °C ל-160 °C, מה שהופך אותו אפשרי לשחזר את האורגנואידים / סטרואידים במיכל חנקן נוזלי ב -160 °C או להכין בלוקים שרף עבור מיקרוסקופ אלקטרונים ב 60 °C. הנישה במכשיר תוכננה להגדיר מרחב מוגבל למבני גידול תלת-ממדיים ולעורר היווצרות של ספרואידים או אורגנואידים בהתבסס על המחקרים הקודמים 18,19,20,21,22,23. חלק זה של המכשיר שקוף ומכיל פלסטיק ספציפי המספק איכות אופטית גבוהה (מקדם שבירה: 1.43; ערך abbe: 58; עובי: 7.8 מיל [0.0078 אינץ' או 198 מיקרומטר]). גם הגומחה וגם החלק ה'צדדי' שמסביב גורמים לפלואורסצנטיות אוטומטית. הגומחה השקופה במרכז^{יש 80} מ"מ 2 שטח, בעוד החלק הצדדי הוא 600 מ"מ². עומק המיכל הוא 15 מ"מ, והעובי הוא 1.5 מ"מ. תכונות אלה, בנוסף לגודלו ולעיצובו של המכשיר, מאפשרות לבצע תצפיות תחת סוגים שונים של מיקרוסקופ היי-טק ולהכין את הדגימות לבדיקות מיקרוסקופיות אלקטרונים (איור 2). מערכת הסגירה של המכשיר מספקת שתי עמדות, האחת אטומה במקפיא והשנייה מאפשרת זרימת גז באינקובטור. מבחני ההתרבות והציטוטוקסיות של CCK8 מדגימים השפעות דומות על התאים בהשוואה למנות המסורתיות של תרביות תאים (איור משלים 2). בדיקת אי-הכללה כחולה של טריפאן מדגימה כדאיות גבוהה של תאים (94%) במהלך תרבית התאים ב-MD (איור 3).

התהליכים שניתן לבצע עבור דגימה אחת במכשיר היחיד כוללים (1) תרבות, (2) צביעה היסטולוגית, (3) אימונוסטינינג, כולל תיוג אימונוהיסטוכימי ואימונופלואורסצנטי, (4) הקפאה, (5) הפשרה, (6) בדיקה תחת מיקרוסקופים אופטיים, כגון שדה בהיר, שדה כהה, פלואורסצנציה, קונפוקל ומיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה, (7) ציפוי ובדיקה ישירות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, או (8) הכנה למיקרוסקופ אלקטרונים ( איור 2).

קיימות מתודולוגיות שונות להכתמה היסטולוגית, תיוג אימונוהיסטוכימי, או תיוג פלואורסצנטי של אורגנואידים וספרואידים 10,11,12,13,14,24,25. קצירתם מההידרוג'ל היא הצעד הראשון והעיקרי של הטכנולוגיה הנוכחית. לאחר שלב זה, שיטות מסוימות מאפשרות תיוג חיסוני שלם. האורגנואידים שנקטפו מוטבעים בפרפין, מחולקים ומסומנים להכתמה וחיסונית אצל אחרים. עם זאת, ייתכן שהסעיפים לא יציגו את המדגם כולו ויספקו רק נתונים מוגבלים הקשורים לארכיטקטורה התלת-ממדית של המבנה. יתר על כן, נזק למבנים תלת-ממדיים אלה ואובדן אנטיגניות הם תופעות לוואי ידועות של טכנולוגיות אלה.

הפרוטוקולים החדשים המשלימים לבדיקות מיקרוסקופיות במאמר זה מאפשרים ניתוח של דגימות שלמות שעדיין נמצאות בהידרוג'ל. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים שתי פורמולציות שפותחו לאחרונה: פתרון לאימונוהיסטוכימיה (S-IHC) ופתרון לתיוג אימונופלואורסצנטי (S-IF). השיטות עם פתרונות אלה מאפשרות לחוקרים לקבל נתונים מדויקים יותר, שכן אין השפעות מזיקות של זרימות עבודה מסורתיות, כגון צנטריפוגה, פיפטינג והעברה של המבנים העדינים. הפרוטוקול המתואר כאן גם מבטל את הצורך בשלבי קציר, חסימה, ניקוי ואחזור אנטיגן, ומקצר את כל ההליך ל-6-8 שעות. יתר על כן, המתודולוגיה מאפשרת להוסיף בו זמנית נוגדנים אחד עד שלושה נוגדנים לאותו S-IF. לכן, ניתן לקבל את התוצאות באותו יום גם לאחר ניסויי הסימון המרובים, וזה יתרון נוסף של הפרוטוקול המתואר כאן; פרוטוקולים מסורתיים לתיוג אימונופלואורסצנציה בהרכבה מלאה נמשכים בדרך כלל בין 3 ימים למספר שבועות 10,11,12,13,14^.

גם הטמעת פרפין, צעד מזיק נוסף שמפחית את האנטיגניות, מושמטת. המבנה התלת-ממדי נשאר בסביבת המבחנה שלו מתחילת הבדיקה המיקרוסקופית ועד סופה. מאחר שהמבנה התלת-ממדי נשאר בתנאי הגידול שלו, ביטוי החלבון ונתוני הלוקליזציה מחקים טוב יותר את תנאי ה-in vivo. צפויות תוצאות מדויקות יותר, שכן המתודולוגיה מבטלת את השלבים המשפיעים על ביטוי האנטיגן של הדגימה. טבלה 1 וטבלה 2 מדגימות כיצד פרוטוקולים חדשים אלה מבטלים שלבים, חוסכים זמן ועבודה במעבדה ומפחיתים עלויות ומוצרי פסולת בהשוואה לזרימות עבודה מסורתיות.

בנוסף לשלבים המכריעים שתוארו לעיל, בעיה נוספת היא מתן מדיום ושיטה לשימור בהקפאה לשימור המבנה התלת-ממדי של הדגימה עם שיעורי כדאיות תאים גבוהים יותר 26,27,28,29,30,31. שימור בהקפאה חיוני ליצירת מערכת מודל יציבה ולאפשר ביו-בנקציה של אורגנואידים וספרואידים^32,33. ביו-בנקאיות של כל המבנה התלת-ממדי המקורי תאפשר סיכום נאמן יותר של המצב הטבעי של בריאות או מחלה. השיקולים המרכזיים הם הנוחות והאמינות של שימור בהקפאה והפשרת אורגנואידים/ספרואידים. התאוששות אורגנואידית לאחר הפשרה היא נמוכה מאוד ברוב הטכנולוגיות הנוכחיות, לעתים קרובות פחות מ -50%. עם זאת, מחקרים אחרונים הראו תוצאות מבטיחות עם שיעורי הישרדות משופרים^26,27,28,29. Lee et al. הראו כי 78% מהתאים הספרואידים שרדו לאחר שימור בהקפאה כאשר השתמשו בתמיסה של אוניברסיטת ויסקונסין המכילה 15% DMSO²⁸. יחס הישרדות התאים עלה ל-83% במחקר של Arai et ^al.29. עם זאת, התוצאות לאחר שימור בהקפאה מושפעות באופן משמעותי מכיוון שהמבנים התלת-ממדיים אינם יכולים לשמור על אותם מאפיינים ואיכות. בנוסף, ריאגנטים ללא סרום נדרשים לתרגול ייצור טוב במסגרות פרמצבטיות ואבחון. תהליכי עבודה מסורתיים משתמשים במדיום המכיל סרום בקר עוברי (FBS) ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) לשיטת ההקפאה האיטית, שניהם קשורים לנכים. FBS הוא מוצר שמקורו בבעלי חיים ויכולות להיות לו וריאציות אצווה. DMSO הוא מגן קריוטרסי מוצלח מאוד, אך חשיפה ארוכת טווח, במיוחד במהלך הפשרה, עלולה לגרום להשפעות ציטוטוקסיות^30,31.

מאמר זה מתאר גם את מתודולוגיית ההקפאה/הפשרה של אורגנואידים או ספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל. במחקר נעשה שימוש בשתי נוסחאות להקפאת אורגנואידים וספרואידים: (1) 10% DMSO המכיל תמיסת הקפאה מסורתית (FS) ו-(2) מדיום שימור בהקפאה ללא סרום ו-DMSO. מדיום שימור בהקפאה זה מכיל רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, השונים מהנוסחאות הנוכחיות. המטריצה החוץ-תאית מורכבת משני סוגים עיקריים של מקרומולקולות, פרוטאוגליקנים וחלבונים סיביים, החיוניים לפיגומים פיזיקליים עבור מרכיבי התאים, אך גם יוזמים תהליכים הדרושים למורפוגנזה של רקמות, התמיינות והומאוסטזיס 34,35,36,37,38,39,40 . קולגן מספק חוזק מתיחה, מווסת את הידבקות התאים, תומך בכימוטקסיס ובנדידה ומפתח רקמות ישיר³⁷. בנוסף, סיבי אלסטין מספקים רתיעה לרקמות שעוברות מתיחה חוזרת^{ונשנית 38}. חלבון סיבי שלישי, פיברונקטין, מכוון את הארגון של המטריצה הבין-תאית הבין-תאית ויש לו תפקיד מכריע בתיווך ההתקשרות של התא ומתפקד כמווסת מכני חוץ-תאי³⁹. Du et al. הדגימו את ההשפעה המגנה על הקרינה של הידרוליזט קולגן עוף על מערכת המודל הטבעית של אקטומיוזין⁴¹. התוצאות שלהם מצביעות על כך שהידרוליזט קולגן יכול לעכב צמיחה של גבישי קרח, להפחית את הדנטורציה והחמצון של חלבונים באופן דומה למגיני קרינה מסחריים, ולספק מבנה ג'ל טוב יותר לאחר מחזורי הפשרה בהקפאה. לכן, הוספת רכיבי מטריצה חוץ-תאית למדיית השימור בהקפאה מספקת סביבה בטוחה ומגנה יותר עבור הדגימה ותומכת במבנים החיים להחלים לאחר הקפאה-הפשרה.

בנוסף, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול פשוט לסימון ממברנות ציטופלסמיות וגרעינים של אורגנואידים חיים וספרואידים בזמן שהם עדיין נמצאים בהידרוג'ל.

1. גידול אורגנואידים וספרואידים

1. מניחים את ההידרוג'ל על הקרח למשך הלילה (במקרר או בחדר קר) כדי להפשיר.
2. הניחו את המכשיר הרב-תכליתי הזמין מסחרית (MD; ראו טבלת חומרים) באינקובטור יום אחד לפני הניסוי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) כדי להתחמם.
3. מניחים במקרר קצוות פיפטה סטריליים רחבים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: שלבים 1.1-1.3 יבוצעו ביום 0, ושלבים 1.4-1.11 יבוצעו ביום 1.
4. הניחו את ההידרוג'ל על קרח במכסה מנוע של זרימה למינרית למשך 15 דקות.
   1. אופציונלי: לדלל את ההידרוג'ל במדיום תרבית תאים קרים בהתאם להמלצת היצרן.
5. מניחים את הצינור המכיל כדור של תאי HepG2 (קו תאי קרצינומה הפטוצלולרית שהושגו באופן מסחרי; ראו טבלת חומרים) על קרח.
6. צלחת 30-35 μL של 100% הידרוג'ל בתוך הגומחה של המכשיר שחומם מראש כדי ליצור טיפת ג'ל.
7. הניחו 10,000 תאי HepG2 במרכז החלק העליון של כל טיפת הידרוג'ל (איור 2), ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
8. כסו את טיפת ההידרוג'ל ב-200 μL של ה-Modified Eagle Medium (DMEM) של דולבקו עם סרום בקר עוברי 10%.
9. כסו את מכסה ה-MD במיקום הנכון כדי לאפשר זרימת גז, והניחו את המכשיר באינקובטור.
10. הזן את התאים עם 200 μL של DMEM עם 10% FBS כל יומיים.
11. בדקו את הצמיחה של הספרואידים תחת מיקרוסקופ הפוך (איור 3). היווצרות ספרואידים מתחילה לאחר היום^השלישי . סרטון 1 מראה את מיקומם של ספרואידים ברמות שונות בכיפת הידרוג'ל.
    הערות: מומלץ מאוד לשאוף בעדינות את הנוזל המקיף את ההידרוג'ל ולהוסיף באיטיות את הנוזל החדש לסביבה כדי למנוע פגיעה בטיפות ההידרוג'ל.

2. הכתמת המטוקסילין ואוזין של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

1. מחממים את המקבע (4% פרפורמלדהיד; PFA), PBS והמטוקסילין (ראו טבלת חומרים) עד 37 מעלות צלזיוס.
2. שאפו את המדיום המקיף את טיפת ההידרוג'ל עם פיפטה, הוסיפו 100-200 מיקרון ליטר של 4% PFA כדי לתקן, ודגרו במשך 15-20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
3. שאפו את ה-4% PFA והוסיפו 200 מיקרון ליטר של PBS כדי לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את ה- PBS ודגרו עם 200 μL של תמיסת המטוקסילין למשך 15-20 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
4. שאפו את המטוקסילין והוסיפו 200 μL של dH₂O כדי לשטוף 3x במשך 10 דקות כל אחד ב 37 מעלות צלזיוס. שאפו את dH₂O ודגרו עם 200 מיקרון ליטר של אתנול למשך 5-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
5. שאפו את האתנול ודגרו עם 200 מיקרון ליטר של Eosin (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שאפו את האוזין והוסיפו 200 מיקרון ליטר של dH₂O לשטיפה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
6. שאפו את dH₂O והוסיפו 100 μL של גליצרול כדי לכסות את טיפת ההידרוג'ל כמדיום ההרכבה.
7. אופציונלי: הרכב את הגומחה עם כיסוי. ניתן להשמיט שלב זה כדי למנוע סחיטת אורגנואידים/ספרואידים בגודל ניכר.
8. סגרו היטב את מכסה ה-MD כדי למנוע ייבוש עד לבדיקה. המדגם יציב לבדיקה לפחות 6 חודשים.

3. אימונוהיסטוכימיה של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

1. חמם את הפתרון המתקבל באופן מסחרי לאימונוהיסטוכימיה (S-IHC; ראו טבלת חומרים) ל-37 מעלות צלזיוס.
2. דגירה של אורגנואידים או ספרואידים בהידרוג'ל עם 3% מי חמצן (H 2 O 2) ב200 μL של dH₂ O במשך 5 דקות ב 37מעלות צלזיוס.
3. שאפו את תמיסת מי החמצן ושטפו ב- dH₂O למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שאפו את dH₂O ודגרו פעמיים עם 100 μL של S-IHC ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כל אחד.
4. שאפו את ה-S-IHC ודגרו עם 100 μL של נוגדן ראשוני (ראו טבלת חומרים) מדולל ב-S-IHC במשך 1-2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס (בהתאם להמלצות היצרן לגבי דילול עבודה).
5. שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ודגרו עם 100 μL של S-IHC 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס.
6. שאפו 100 μL של S-IHC ודגרו עם נוגדן משני ביוטינילציה (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
7. שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ודגרו עם 100 μL של S-IHC 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו את ה-S-IHC ודגרו עם 100 μL של חזרת פרוקסידאז (HRP) עם התווית סטרפטאבידין (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
8. שאפו את HRP שכותרתו סטרפטאבידין ודגרו עם 100 μL של S-IHC 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס.
9. שאפו את ה-S-IHC ודגרו עם תערובת תמיסת כרומוגנית DAB/AEC של 100 מיקרוגרם (ראו טבלת חומרים) למשך 5-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
10. עקוב אחר עוצמת הכתמים תחת מיקרוסקופ אור.
11. יש לשטוף עם dH 2 O 3x במשך₂דקות כל אחד.
12. אופציונלי: דגירה עם 100 μL של המטוקסילין (ראו טבלת חומרים) עבור צביעה נגדית גרעינית למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
13. שאפו את המטוקסילין ושטפו ב- dH₂O למשך 5 דקות.
14. שאפו את dH₂O וכסו את טיפת ההידרוג'ל ב-100 מיקרו-ליטר של גליצרול כמדיה הגוברת.
15. יש לסגור את מכסה ה-MD בחוזקה עד לבדיקה מיקרוסקופית.
    הערות: שלבי אחזור אנטיגן וחסימת חלבונים מושמטים בפרוטוקול זה מכיוון ש- S-IHC מבטל שלבים אלה.

4. תיוג אימונופלואורסצנטי של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

1. חממו את החומרים הבאים ל-37 מעלות צלזיוס: 4% PFA, PBS, S-IF, תמיסת נוגדנים ראשונית ב-S-IF, תמיסת נוגדנים שניונית ב-S-IF, כתם גרעיני וגליצרול (ראו טבלת חומרים).
2. שאפו את מדיום תרבית התאים ותיקנו עם 200 μL של 4% PFA למשך 15-30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו את המקבע ושטפו ב-S-IF 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס.
3. הוסף dH₂O לצד המקיף את הגומחה כדי לספק לחות במהלך השלבים הבאים.
4. שאפו את ה-S-IF המקיף את טיפת ההידרוג'ל ודגרו את טיפת ההידרוג'ל עם 100 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית (ראו טבלת חומרים) ב-S-IF למשך 30-60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
5. שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטפו ב- S-IF 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס.
6. שאפו את ה-S-IF ודגרו עם 100 μL של תמיסת נוגדנים משנית (ראו טבלת חומרים) ב-S-IF למשך 30-60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך.
7. שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו עם PBS 3x למשך 10 דקות כל אחד ב-37 מעלות צלזיוס בחושך.
8. שאפו את ה-PBS ודגרו עם 100 μL של כתם דנ"א גרעיני המכיל מדיום הרכבה או גליצרול ב-37 מעלות צלזיוס בחושך.
9. מלאו את הגומחה בגליצרול כדי למנוע ייבוש.
10. אופציונלי: כסו את הגומחה בכיסוי. ניתן להשמיט שלב זה כדי למנוע סחיטה של האורגנואידים/ספרואידים.
11. סגור היטב את ה- MD. דגימות ב- MDs ניתן לאחסן ב 4 °C בחושך לפחות 6 חודשים עם אובדן מינימלי של פלואורסצנציה.
12. השתמש בהגדרות הבאות לבדיקה מיקרוסקופית קונפוקלית: הגדר את ערך חור הפין של כל הערוצים ל- 20.1, החזק את קבוע מאסטר הרווח ב- 550 עבור 488 ננומטר, 485 עבור 550 ננומטר ו- 450 עבור 594 ננומטר, שמור על כוח לייזר קבוע עבור כל הניסויים, והאחוז הנמוך ביותר ב- 2.0.
    הערות: נוגדנים ראשוניים: אנטי-נה-K ATPase (1:100), אנטי-ארגינאז (1:50), אנטי-אלבומין (1:50), אנטי-בטא-גלקטוזידאז (1:25), נוגדן אנטי-מיטוכונדריאלי (1:100), נוגדן אנטי-גולג'י (1:50), אנטי-ציטוקרטין 5 (1:100), נוגדן Ov6 (1:100). נוגדנים משניים: עז נגד ארנב IgG (H+L)- 488, עז נגד ארנב IgG (H +L)-550, עז נגד עכבר IgG (H +L)-488, עז נגד עכבר IgG (H +L)-550, עז נגד עוף IgY(H+L)-647. הדילול של כל הנוגדנים המשניים הוא 1:100. בנוסף, נעשה שימוש גם ב-FITC-Phalloidin (1:100), נוגדן מצומד (ראו טבלת חומרים).

5. קרום פלזמה ותיוג גרעין של אורגנואידים חיים וספרואידים בהידרוג'ל

1. הכינו תמיסת תיוג המכילה אגלוטינין נבט חיטה פלואור של אלקסה (5.0 מיקרוגרם/מ"ל) ו-Hoechst (2 מיקרומטר) בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), בהתאם להמלצות היצרן (ראו טבלת חומרים), וחממו עד 37 מעלות צלזיוס.
2. שאפו את מדיום תרבית התאים והוסיפו 100 μL של תמיסת תיוג כדי לכסות את טיפת ההידרוג'ל. דגירה במשך 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
3. הסר את תמיסת הסימון וכבס פעמיים ב- PBS 2x במשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אופציונלי: תקן עם 200 μL של 4% פורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
4. מכסים את טיפת ההידרוג'ל בגליצרול כמדיום הרכבה. אופציונלי: הרכב את הגומחה עם כיסוי.
5. סגרו את מכסה ה-MD בחוזקה והשאירו אותו בקירור בחושך עד לבדיקה פלואורסצנטית/מיקרוסקופית קונפוקלית. הוא יציב לפחות 6 חודשים.

6. הקפאה והפשרה של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

1. הקפיאו את האורגנואידים לפי השלבים הבאים.
   1. חמם את תמיסת ההקפאה שהושגה באופן מסחרי (FS; ראו טבלת חומרים) ל-37 מעלות צלזיוס.
   2. שאפו בעדינות את אמצעי התקשורת של תרביות התאים המקיפים את כיפת ההידרוג'ל.
   3. הוסף 200 μL של FS בעדינות. לדגום את הדגימה עם FS ב 37 °C במשך 1 שעות.
   4. סגור את מכסה המכשיר בחוזקה והנח אותו בקופסת קצף. הנח קופסת קצף זו בקופסת קצף אחרת, כפי שמוצג באיור משלים 3. סגרו את שתי קופסאות הקצף בחוזקה. שתי קופסאות קצף אחת בתוך השנייה מספקות טווח שיפוע קירור טמפרטורה של 1 עד 2° צלזיוס לדקה של הדגימה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
   5. מניחים את הקופסה בטמפרטורה של -20°C למשך שעתיים. מעבירים את הקופסה למקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות ומשאירים ללילה.
   6. הוציאו את הדגימה מהקופסאות. הדגימה ב- MD יכולה להישמר במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
   7. העבר את ה- MD המכיל את הדגימה למיכל החנקן הנוזלי לאחסון לטווח ארוך יותר.
2. הפשירו את האורגנואידים בעקבות השלבים הבאים.
   1. מוציאים את ה-MD המכיל את הדגימה מהמקפיא/מיכל החנקן ומניחים אותה ישירות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. דגירה במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
   2. הוסף 200 μL של מדיום תרבית חמה לנישה (היחס בין FS למדיום תרבית תאים הוא 1:1) ודגרה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   3. הוסף מדיום תרבית חם יותר לנישה (היחס בין FS למדיום תרבית תאים הוא 1:2) ודגרה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   4. שאפו בעדינות את תערובת המדיום וה- FS. המשך למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (שלב 7) ומיקרוסקופיית אלקטרונים (שלב 8) הדמיה של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל.

7. סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים של אורגנואידים/ספרואידים שלמים

1. חממו את הפתרון המקבע והפוסט-מקבע של קרנובסקי (ראו טבלת חומרים) לטמפרטורת החדר (RT).
2. שאפו את מדיום תרבית התאים המקיף את ההידרוג'ל ב-MD. הניחו את הדגימה ב-MD על קרח במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית למשך 15 דקות.
3. שאפו בעדינות רבה את ההידרוג'ל הנוזלי המקיף את האורגנואידים/ספרואידים. כמות מוגבלת של מטריגל יכולה להישאר בנישה כדי למנוע פגיעה ואובדן הדגימה.
4. תקן עם המקבע של קרנובסקי (2% PFA, 2.5% גלוטראלדהיד בחיץ קקודילאט 0.15 M, ו-2 mM CaCl₂; ראה טבלת חומרים) ב-RT למשך שעה אחת.
5. שאפו את המקבע בעדינות ושטפו במים מזוקקים (dH₂O) 3x למשך 15 דקות כל אחד.
6. שאפו בעדינות את dH₂O ותיקנו עם תמיסה פוסט-קיבוצית (1% אטטרוקסיד אוסמיום מימי [OsO₄]; ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך שעה אחת.
7. יש לשאוף בעדינות את הפוסט-קיבוע ולשטוף במים מזוקקים (dH₂O) 3x למשך 15 דקות כל אחד.
8. התייבשו בסדרה מדורגת של אתנול (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), תערובת אתנול/אצטון (1:1; 1:2), ואצטון מוחלט ב-RT למשך 15 דקות כל אחד.
9. יש לייבש עם מייבש נקודה קריטית.
10. מצפים את הדגימה במכשיר בזהב/פלדיום 6 ננומטר באמצעות מעיל מפזר (ראו טבלת חומרים) למשך 90 שניות.
11. התבונן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם גלאי אלקטרונים משני בעדשה ב 2-3 kV במצב ואקום (5 x ^10-6 mA). צלם תמונות עם מרחק עבודה של 8.1-8.2 מ"מ ובהגדלות של 675x, 1050x ו- 1570x.
    הערות: כל השלבים מבוצעים ב- MD. השתמש בתמיסה של 200-250 μL עבור כל שלב.

8. מיקרוסקופיית אלקטרונים של אורגנואידים/ספרואידים שלמים בהידרוג'ל

1. לחמם את המקבע של קרנובסקי ל 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מדיום תרבית התאים המקיף את ההידרוג'ל ב-MD.
2. תקן את המדגם עם המקבע של קרנובסקי ב- RT למשך שעה אחת. יש לשטוף עם dH₂O 3x במשך 15 דקות כל אחד.
3. לאחר התיקון עם 2% OsO₄ מימי ו-2.5% אשלגן פרוציאניד ב-RT למשך 45 דקות. יש לשטוף עם dH₂O 3x במשך 10 דקות כל אחד.
4. דגירה ב-0.5% תיוקרבוהידראזיד (TCH; ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך 30 דקות. יש לשטוף עם dH₂O 3x במשך 10 דקות כל אחד.
5. דגירה ב-OsO₄ מימי ב-2% ב-RT למשך 30 דקות. יש לשטוף עם dH₂O 3x במשך 10 דקות כל אחד.
6. דגירה בתמיסת אורניל אצטט של 2% (ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך שעה אחת.
   הערה: בשלב זה, ניתן לשמור על ספרואידים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
7. דגירה בתמיסת אספרטט עופרת (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. יש לשטוף עם dH₂O 3x במשך 10 דקות כל אחד.
8. התייבשו בסדרה מדורגת של אתנול (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) ואצטון מוחלט ב-RT למשך 15 דקות כל אחד.
9. יש לטפל בתערובת של (1:1; 1:2) שרף אצטון/אפון ושרף אפון טהור (ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך שעתיים כל אחד.
10. פילמר את השרף ב-60°C למשך הלילה (מינימום 16 שעות). לאחר הפילמור, הסר את בלוק השרף מה-MD, כפי שמוצג באיור משלים 4.
11. חברו את גוש השרף לגוש גדול יותר עם דבק שרף. חותכים את הבלוק ומגיעים למיקום של אורגנואידים או ספרואידים.
12. קבל חלקים דקים למחצה (1,000 ננומטר) ודקים במיוחד (60 ננומטר) באמצעות אולטרה-מיקרוטום (ראה טבלת חומרים).
13. מקם את החלקים הדקים במיוחד על רשתות נחושת של 100 רשתות רשת והתבונן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם גלאי STEM במתח מואץ של 30 קילו-וולט. צלם תמונות במרחק עבודה של 44 מ"מ ובהגדלות של 2580x, 5020x ו- 6060x.
    הערות: השתמש בתמיסה של 200-250 μL עבור כל שלב. שלבים 8.1-8.10 מבוצעים ב- MD.

המאמר הנוכחי מייצג מכשיר רב-תכליתי (MD) ומתודולוגיות משלימות לתרבות, הקפאה, הפשרה, צביעה היסטולוגית, צביעה אימונוהיסטוכימית, תיוג אימונופלואורסצנטי, ציפוי ועיבוד של אורגנואידים או ספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל בסביבה אחת בעלת עיצוב ייחודי. המחקר הנוכחי נועד להכין ספרואידים של סרטן הכבד HepG2 ב-35 טיפות הידרוג'ל ב-35 MDs. הניסויים נערכו במשולש כדי להבטיח דיוק. בנוסף, אורגנואידים של ריאות ב-MDs סומנו כדוגמה להדגמת התוצאות של המתודולוגיות הנוכחיות למחקרים אורגנואידיים.

איור 1 מראה מבט מקרוב על המכשיר המכיל כיפת הידרוג'ל. גודלה וצורתה של הגומחה נועדו לספק סביבת הגנה להידרוג'ל המכיל את האורגנואידים/ספרואידים ולשמור את הריאגנטים המשמשים בתהליכים שונים. בנוסף, החלק הצדדי של המכשיר המקיף את הנישה יכול לשמש כתא הלחות במהלך ניסויים חיסוניים. המדיום להזנת הדגימה עשוי להשתנות בין 100-200 μL, בהתאם לגובה טיפת ההידרוג'ל. המחקר הנוכחי מתמקד בשיטה המבוססת על כיפה מכיוון שהידרוג'לים רבים, רכיבי מטריצה חוץ-תאית מסחרית ותמציות ממברנות מרתף מאפשרים למשתמש להכין טיפות. עם זאת, ניתן גם למלא את הגומחה של MD עם הידרוג'ל ולאחר מכן זרע את התאים בתוכו כדי ליצור אורגנואידים / spheroids. שיטה זו עשויה להיות מועדפת אם צמיגות המטריצה אינה מאפשרת הכנת כיפות או אם הניסוי כולל כמויות גדולות של אורגנואידים. סוג ההידרוג'ל והיחס הידרוג'ל/מדיום להכנת טיפות עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא, לתכנון הניסוי ולמדיום. תרשים 1  מייצג גם את תכנון המכשיר המאפשר לחקור את האורגנואידים/ספרואידים תחת מיקרוסקופי אלקטרונים ברייטפילד, קונפוקליים וסורקים, בעוד אורגנואידים/ספרואידים עדיין נמצאים בסביבת המבחנה הטבעית שלהם.

איור 2 מציג כיצד לזרוע תאים בהידרוג'ל ולבחון התפתחות של ספרואידים או אורגנואידים. העיצוב והמידות של המכשיר הרב תכליתי הוצגו גם באיור זה. סרטון 1 מדגים את מיקומם של ספרואידים גדלים בתלת-ממד בהידרוג'ל. איור 3 מייצג תמונות חיות של ספרואידים גדלים מהיום השלישי עד היום ה-21. הזמן להיווצרות ספרואידים ואורגנואידים עשוי להשתנות בהתאם לאופי הדגימה. לדוגמה, ספרואידים מתאי HepG2 ותאי HEK נוצרו תוך 3 ימים, בעוד היווצרות של כבד ואורגנואידים מרה נמשך 2 שבועות במהלך הניסויים.

המטוקסילין וספרואידים מוכתמים באוזין נראים באיור 4. התמונה מייצגת ספרואידים שהשתמרו היטב ומוכתמים בצורה הומוגנית בגדלים שונים ומיזוגים שונים של ספרואידים. תאים חיים במרכז הספרואידים ראויים לציון. התמונה גם מדגימה את הקשרים העדינים בין התאים מספרואידים שונים. לא ניתן היה לדמיין את החיבורים השבריריים הללו לאחר זרימות עבודה מסורתיות, שכן העברה, צנרת או צנטריפוגה יפגעו בהם. תרשים 5  מדגים אימונוסטיניזציה של ספרואידים עם הנוגדן הספציפי לארג'ינאז, אחד הסמנים הנפוצים ביותר לאבחון ופרוגנוזה של קרצינומה הפטוצלולרית42,43. המיקרוגרפים חושפים תאי סרטן כבד מובחנים ולא מובחנים באותם ספרואידים. נתון זה מכיל תמונות עם ובלי צביעה נגדית עם המטוקסילין. חוקרים עשויים לבחור להשמיט צביעה נגדית עם המטוקסילין במקרים שבהם יהיה קשה להבדיל בין אזורים מסומנים במבנה תלת-ממדי.

איור 6 מייצג פרוטוקול פשוט נוסף להדמיה מלאה של אורגנואידים/ספרואידים חיים בהידרוג'ל: קרום תא חי וכתם גרעין. המתודולוגיה מאפשרת את אותה צפיפות תיוג בפריפריה ובמרכז, ומראה חדירה מלאה של מגיבים. איור 7, איור 8 ואיור 9 מראים תמונות מייצגות של ספרואידים המסומנים בנוגדן אחד, שניים או שלושה, בהתאמה. אחד עד שלושה נוגדנים עיקריים מדוללים ב-S-IF בו זמנית. באופן דומה, אחד עד שלושה נוגדנים משניים תואמים המתאימים לניסוי מדוללים בו זמנית ב-S-IF. פרוטוקול התיוג החיסוני מאפשר לחוקרים לסמן את המבנים התלת-ממדיים בטווח של 4-6 שעות מבלי לאבד או לפגוע בהם. הרקע שקוף, והטכנולוגיה המשמשת כאן אינה דורשת ניקוי נוסף, אחזור אנטיגן או שיטות / פתרונות חסימה. השיטה גם מאפשרת לחוקרים לתייג את הדגימה עם נוגדנים מרובים בשלב אחד. במילים אחרות, המשתמש מכין תמיסה אחת המכילה נוגדנים ראשוניים אחד עד שלושה נוגדנים ראשוניים ותמיסה נוספת התואמת אחד עד שלושה נוגדנים משניים. הפרוטוקול המתואר כאן מבטל שלבי תיוג רציפים עם נוגדנים שונים במתודולוגיות קונבנציונליות.

איור 10 מייצג סריקה והעברה של תמונות מיקרוסקופיות של אלקטרונים של הספרואידים. השורה הראשונה מדגימה תמונות של ספרואידים שלמים ב-MD תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. השורה השנייה מכילה תמונות מיקרוסקופיות של אלקטרונים של ספרואידים לאחר הכנת בלוקי השרף המכילים ספרואידים שלמים ב-MD, וכן תמונות של ספרואידים חתוכים ומוכתמים. אברונים ציטופלסמיים שהשתמרו היטב ותכונות אולטרה-סטרוקטורליות אחרות של התאים מדגימים את היעילות של פרוטוקול פשוט זה, המגן על המבנה התלת-ממדי של הדגימה כולה. ה-MD גם מאפשר לחוקרים להקפיא ולהפשיר את כל הדגימות בהידרוג'ל. תרשים 11  מדגים כיפות הידרוג'ל ואת הספרואידים בהגדלה גבוהה יותר לפני ואחרי הקפאה. אי הסדירות בגבולות כיפת ההידרוג'ל בולטת. עם זאת, המעוגלות של הספרואידים בהקפאה כמעט יציבה לאחר ההפשרה בהשוואה לספרואידים לפני ההקפאה. שיטות תיוג של קרום תאים חי וגרעין מיושמות גם הן 48 שעות לאחר ההפשרה כדי להדגים כיצד הליך ההקפאה/הפשרה השפיע על הארכיטקטורה התלת-ממדית, על קרום התא ועל כדאיות התא. תמיסת ההקפאה המסורתית המכילה דימתיל סולפוקסיד והתמיסה החדשה הנוכחית, SF, מדגימות תוצאות דומות. יותר מ-75% מהמבנים התלת-ממדיים יכלו לשרוד בפרוטוקול זה. עם זאת, נדרשים ניסויים נוספים כדי לחשוף את תופעות הלוואי ארוכות הטווח של כל פורמולה על אורגנואידים וספרואידים.

טבלה 1 וטבלה 2 משוות את זרימות העבודה המסורתיות לאלה המתוארות כאן בהתבסס על מספר שלב, משך וייצור פסולת (כלומר, המספר הכולל של כפפות פלסטיק, קצוות פיפטה, פיפטות סרולוגיות, צינורות צנטריפוגה, צינורות מיקרוצנטריפוגה, כלי תרבית תאים, קריוביאלים וכו 'עבור כל זרימת עבודה).

איור משלים 1 מייצג צעדים רציפים שניתן לבצע ב-MD יחיד באופן סכמטי. איור משלים 2 מדגים את תוצאות הניסויים שנועדו להשוות את כדאיות התאים, רעילותם ושיעורי ההתרבות של תאי HepG2 ב-MD או בצלחת מסורתית עם תחתית זכוכית. איור משלים 3 מראה את קופסאות הקצף ששימשו להקפאת הדגימות ב-MDs. איור משלים 4 מסכם את השלבים להוצאת בלוק שרף מ-MD. איור משלים 5 כולל תמונות של אורגנואידים של דרכי הנשימה שסומנו כאימונופלואורסצנטיים ולאחר מכן הודגמו כשהם עדיין היו ב-MDs. באופן דומה, וידאו 2 מדגים שני אורגנואידים של דרכי הנשימה המסומנים כאימונופלואורסצנטיים ב-MD. לבסוף, איור 6 משלים הוא גרף המשווה את העוצמה הממוצעת של עוצמת הסימון של קרום התא בספרואידים חיים לפני ואחרי הקפאה באמצעות זרימת עבודה מסורתית וזרימת העבודה המתוארת כאן. תוכנת Image J שימשה לניתוח.

איור 1: התקן תרבית התאים הרב-תכליתי (MD). (A) הגומחה (N), החלק המרכזי של המכשיר, נועדה ליצור סביבת הגנה עבור האורגנואידים/ספרואידים הגדלים בטיפת הידרוג'ל (D) במהלך תהליכים רציפים. הצד (S), החלק שמסביב לגומחה, יכול לשמש כתא אדים במהלך ניסויים חיסוניים. (B) המרכז השקוף במכסה מאפשר למשתמש לצפות באורגנואידים/ספרואידים כאשר המכשיר סגור. (C) כיפת ההידרוג'ל המכילה אורגנואידים ב-MD יכולה להיות מוכתמת או מוטבעת בבלוק שרף לצורך העברת מיקרוסקופיית אלקטרונים. המכסה כולל גם את הגומחה (N) לתליית מתודולוגיית טיפה. הגודל והעיצוב של המכשיר מאפשרים למשתמש לבחון את האורגנואידים/ספרואידים תחת (D) שדה בהיר, (E) קונפוקל, ו-(F) מיקרוסקופי אלקטרונים סורקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: זריעת תאים בתוך הידרוג'ל. (A) כדור התא שבפיפטה מוכנס לחלק העליון של הכיפה. לאחר 3-5 ימים, spheroids להיות גלוי בכיפה, במיוחד בשולי הטיפה. (B) ארבע תמונות חיות של ספרואידים גדלים מכל רבע בכיפה צולמו ומוזגו. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (C)העיצוב והמידות (בסנטימטרים) של ההתקן הרב-תכליתי (MD). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: פיתוח ספרואידים בטיפת הידרוג'ל מהיום השלישי עד היום ה-21. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: המטוקסילין וספרואידים מוכתמים באוזין בתוך ה-MD. הדמיה של הקשרים בין התאים הממוקמים בספרואידים הסמוכים או המתמזגים. התהליכים העדינים בין התאים (החצים) נראים לעין מכיוון שהדגימה השלמה בהידרוג'ל קבועה, מוכתמת ונבדקת מבלי לפגוע במבני הגידול התלת-ממדיים. סרגל קנה מידה: יום 3, יום 9 = 50 מיקרומטר; יום 7, יום 17 = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: צביעה אימונוהיסטוכימית של ספרואידים שלמים בהידרוג'ל בתוך ה-MD. הדגימות עברו בדיקה חיסונית עם נוגדן ספציפי לארגינאז. תאים חיוביים לארגינאז (חיצים אדומים) ושליליים (חיצים שחורים) נראים בספרואידים. התמונות הן משני ניסויים: (A-C) ללא ו-(D-F) עם צביעה נגדית עם המטוקסילין. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: תמונה קונפוקלית של אורגנואיד חי בהידרוג'ל. האורגנואידים החיים סומנו עם קרום התא החי (WGA) וכתמי גרעין (Hoechst). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: תיוג אימונופלואורסצנטי של ספרואידים שלמים בהידרוג'ל עם נוגדן אחד וכתם גרעיני (Hoechst). (א-ג) הפאנל העליון מציג ספרואיד המסומן בנוגדן ספציפי ל-Na-K ATPase בקרום התא. (ד-ו) הפאנל התחתון מדגים את מיקומו של נוגדן אחר ספציפי לארגינאז, חלבון ציטוזולי ספציפי לקרצינומה הפטוצלולרית, בספרואידים של סרטן הכבד. משך פרוטוקול הצביעה: 6 שעות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 8: תיוג אימונופלואורסצנטי של ספרואידים שלמים בהידרוג'ל עם שני נוגדנים וכתם גרעיני (Hoechst). (A-C) הפאנל העליון מציג ספרואיד המסומן בשני נוגדנים ספציפיים לאלבומין ול-Ov6. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (D-F) הפאנל התחתון מדגים את המיקום של חלבון אלפא פטו ו- Ov6 בספרואידים של סרטן הכבד. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. משך פרוטוקול הצביעה: 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 9: תיוג אימונופלואורסצנטי של ספרואידים שלמים בהידרוג'ל עם שלושה נוגדנים וכתם גרעיני (Hoechst). (A-E) הספרואיד בפאנל העליון מסומן בנוגדנים ספציפיים לארגינאז, Na-K ATPase ובטא-גלקטוזידאז. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (F-J) הפאנל האמצעי מדגים ספרואיד המסומן ב-Ov6, בטא-גלקטוזידאז וחלבון אלפא-פטו. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (K-O) הספרואיד בפאנל התחתון סומן עם FITC-phalloidin, נוגדן אנטי-מיטוכונדריאלי ונוגדן אנטי-גולג'י. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. שים לב לספציפיות הגבוהה של התוויות ולרקע המופחת. משך פרוטוקול הצביעה: 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 10: תמונות ממיקרוסקופיית אלקטרונים. (א-ג) סריקת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של ספרואידים שלמים בהידרוג'ל ב-MD. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (D-F) תכונות אולטרה-סטרוקטורליות של התאים בספרואיד הודגמו גם תחת מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. פסי קנה מידה: (D) = 4 מיקרומטר; (E,F) = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 11: תמונות חיות של ספרואידים לפני ואחרי הקפאה. (א-ו) אי סדירות גבולות כיפות ההידרוג'ל ניכרת לאחר הקפאה. עם זאת, הגודל והמעוגלות של הספרואידים נשארים דומים. (F) ניתן לראות נדידת תאים על פני התרבית לאחר הפשרה. (ז-ל) קרום התא החי (WGA) וכתם הגרעין (Hoechst) מדגימים כדאיות תאים דומה וקרומי תאים שלמים לפני ואחרי הקפאת כל הספרואידים בהידרוג'ל ב-MD. קנה מידה basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: השוואה של מספר שלב, זמן וייצור פסולת בין זרימות העבודה המסורתיות והחדשות במהלך ניסוי קצר טווח.

טבלה 2: השוואה בין ה-immunolabeling הקונבנציונלי לבין פרוטוקול ה-immunolabeling החדש.

סרטון 1: סדרת זמן של תמונות ברמות שונות של הידרוג'ל המכיל ספרואידים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו 2: מבנה תלת-ממדי של שני אורגנואידים של דרכי הנשימה המסומנים בנוגדנים עבור ציטוקרטין 5 ו-DAPI. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

איור משלים 1: סקירה כללית של הניסוי. סכימה זו מראה את שלבי הניסוי הרציפים לגידול ובחינת אורגנואידים שלמים בהידרוג'ל. הטכנולוגיה המתוארת כאן מאפשרת לגדל, להקפיא, להפשיר, לתייג ולבחון את האורגנואידים תחת מיקרוסקופים שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: השוואה של כדאיות התאים, רעילותם ושיעורי ההתרבות של תאי HepG2 בצלחת מסורתית עם תחתית זכוכית או MD. תאי HepG2 גודלו על(A) צלחת תרבית תאים מסורתית עם תחתית זכוכית או (B) ב-MD כדי להשוות את הכדאיות והרעילות של התאים. (C) מבחן ההדרה הכחולה של טריפאן שימש להוכחת הכדאיות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. התוצאות הושוו באמצעות (D-E) ציטוטוקסיות CCK8 ומבחני שגשוג תאים (F). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: סידור שתי קופסאות הקצף. קופסת קצף אחת ממוקמת בתוך השנייה במהלך תהליך ההקפאה האיטי של כל האורגנואידים או הספרואידים ב- MD. *מציין את שתי התיבות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: שלבים המדגימים כיצד להסיר את גוש השרף מה-MD לאחר פילמור השרף. (A) גוש השרף המקיף את הספרואידים או האורגנואידים מוכן בתוך גומחת MD ולאחר מכן מתפלרם. (ב-ד) לאחר מכן, עם מוט דק מתאים, בלוק שרף נדחף כדי להסיר אותו מן הנישה. (E) לאחר מכן, בלוק שרף, עם הפלסטיק למטה, מוסר. (פ-ג) לבסוף, זוג פינצטה משמש כדי להפריד אותם אם הבלוק עדיין מחובר לפלסטיק. (H) הבלוק מוכן לחתך דק. האורגנואידים או הספרואידים השלמים בבלוק השרף (*) מוכנים לחיתוך למיקרוסקופיית אלקטרונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: אורגנואידים של דרכי הנשימה שסומנו כאימונופלואורסצנטיים ולאחר מכן דמיינו אותם כשהם עדיין היו ב-MDs. (א-ג) הלוח העליון מציג אורגנואידים עגולים של דרכי הנשימה עם לומן מרכזי. ירוק מייצג תאי אב של דרכי הנשימה המבטאים ציטוקרטין 5 בטבעת החיצונית ביותר של האורגנואיד, וכחול מייצג את הגרעינים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (D-F) הלוח התחתון מציג את התמונה התלת-ממדית של שני האורגנואידים זה לצד זה במסננים (D) DAPI ו-(E) Alexa 488, וכן את התמונה הממוזגת (F). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 6: השוואה של צפיפות הסימון על קרומי התאים החיים של התאים. הגרף משווה את הספרואידים לפני ואחרי ההקפאה באמצעות תהליך העבודה המסורתי המאומץ כיום. הניתוח בוצע באמצעות תוכנת ניתוח התמונות Image J. קיצורים: IntDen = צפיפות משולבת (עוצמת פלואורסצנטיות בספרואידים שנבחרו). CTCF = פלואורסצנציה כוללת מתוקנת של התא. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

רנאן גולהאן אקטס הוא הבעלים של MD, S-IHC, S-IF ו-FS בקשות פטנט. אולגו אניס טוק היה מעורב בפיתוח מוצרים אלה. אולגו אניס טוק וגמזה דמירל הם חברי צוות מו"פ של החברה בשם Cellorama. ליוסוף מוסטפא סאצ'י, זיינפ אקבולוט ואוזג'קאן קאיאלאר אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.