המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות לתרבות, הקפאה, הפשרה, עיבוד, צביעה, תיוג ובחינה של ספרואידים ואורגנואידים שלמים תחת מיקרוסקופים שונים, בעוד שהם נשארים שלמים בהידרוג'ל בתוך מכשיר רב תכליתי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבות, הקפאה, עיבוד והדמיה של אורגנואידים וספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל
במאמר זה
סיכום
תקציר
אורגנואידים וספרואידים, מבני גידול תלת-ממדיים במעבדות של תרביות תאים, הופכים מוכרים יותר ויותר כמודלים מעולים בהשוואה למודלים של תרביות דו-ממדיות, מכיוון שהם מחקים את גוף האדם טוב יותר ויש להם יתרונות על פני מחקרים בבעלי חיים. עם זאת, מחקרים אלה בדרך כלל להתמודד עם בעיות עם שכפול ועקביות. במהלך התהליכים הניסיוניים הארוכים - עם העברות של אורגנואידים וספרואידים בין כלי תרבית תאים שונים, פיפטינג וצנטריפוגות - מבני הגידול התלת-ממדיים הרגישים והשבריריים האלה נפגעים לעתים קרובות או הולכים לאיבוד. בסופו של דבר, התוצאות מושפעות באופן משמעותי, שכן מבנים 3D לא יכול לשמור על אותם מאפיינים ואיכות. השיטות המתוארות כאן ממזערות את הצעדים המלחיצים הללו ומבטיחות סביבה בטוחה ועקבית עבור אורגנואידים וספרואידים לאורך כל רצף העיבוד בזמן שהם עדיין נמצאים בהידרוג'ל במכשיר רב תכליתי. החוקרים יכולים לגדל, להקפיא, להפשיר, לעבד, להכתים, לסמן ולאחר מכן לבחון את המבנה של אורגנואידים או ספרואידים תחת מכשירי היי-טק שונים, ממיקרוסקופים קונפוקליים ועד אלקטרונים, באמצעות מכשיר רב-תכליתי יחיד. טכנולוגיה זו משפרת את יכולת השכפול, האמינות והתוקף של המחקרים, תוך שמירה על סביבה יציבה ומגנה עבור מבני הגידול התלת-ממדיים במהלך העיבוד. בנוסף, ביטול צעדים מלחיצים ממזער טעויות טיפול, מפחית את הזמן שלוקח ומפחית את הסיכון לזיהום.
מבוא
עתיד המחקר והטיפול בתאים טמון בתרביות תאים תלת-ממדיות 1,2,3. מודלים אורגנואידים וספרואידים סוגרים את הפער בין ניסויים במבחנה לבין מודלים של בעלי חיים על ידי יצירת מודלים טובים יותר המחקים את התפתחות גוף האדם, פיזיולוגיה ומחלות 4,5,6,7,8,9. עם זאת, יכולת השכפול והחזרה של מודלים אלה נותרה מאתגרת. יתר על כן, טיפול, קציר, העברה וצנטריפוגה של מבנים אלה בטכנולוגיות הנוכחיות גור....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. גידול אורגנואידים וספרואידים
- מניחים את ההידרוג'ל על הקרח למשך הלילה (במקרר או בחדר קר) כדי להפשיר.
- הניחו את המכשיר הרב-תכליתי הזמין מסחרית (MD; ראו טבלת חומרים) באינקובטור יום אחד לפני הניסוי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) כדי להתחמם.
- מניחים במקרר קצוות פיפטה סטריליים רחבים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: שלבים 1.1-1.3 יבוצעו ביום 0, ושלבים 1.4-1.11 יבוצעו ביום 1. - הניחו את ההידרוג'ל על קרח במכסה מנוע של זרימה למינרית למשך 15 דקות.
- אופציונלי: לדלל את ההידרוג'ל במדיום תרבית תאים קרים בהתאם להמלצת היצרן.
- מניחים את הצינור המכיל כדור של תאי HepG2 (קו תאי קר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המאמר הנוכחי מייצג מכשיר רב-תכליתי (MD) ומתודולוגיות משלימות לתרבות, הקפאה, הפשרה, צביעה היסטולוגית, צביעה אימונוהיסטוכימית, תיוג אימונופלואורסצנטי, ציפוי ועיבוד של אורגנואידים או ספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל בסביבה אחת בעלת עיצוב ייחודי. המחקר הנוכחי נועד להכין ספרואידים של סרטן הכבד HepG2 ב-35 טיפות הידרוג'ל ב-35 MDs. הניסויים נערכו במשולש כדי להבטיח דיוק. בנוסף, אורגנואידים של ריאות ב-MDs סומנו כדוגמה להדגמת התוצאות של המתודולוגיות הנוכחיות למחקרים אורגנואידיים.
איור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ה-MD, המשלים את הפורמולציות והפרוטוקולים המתוארים כאן, מאפשר צמיחה תלת-ממדית מהירה וספונטנית של אורגנואידים וספרואידים בסביבה מבוקרת יותר וממשיך את הניסוי באותם תנאים. הדגימה נשארת באותה סביבה במהלך כל התהליך, וכמעט 100% מארכיטקטורות הגידול התלת-ממדיות נשארות שלמות במיכל. זה משפר את ההומוגניות במהלך הניסויים הרציפים ומאפשר תקופת תרבות ממושכת. בנוסף, מספר השלבים במהלך עיבוד אורגנואידים וספרואידים מופחת באופן דרסטי בהשוואה לזרימות עבודה מסורתיות (איור 4), מה שבתורו ממזער את זמן הטיפול וטעויות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
רנאן גולהאן אקטס הוא הבעלים של MD, S-IHC, S-IF ו-FS בקשות פטנט. אולגו אניס טוק היה מעורב בפיתוח מוצרים אלה. אולגו אניס טוק וגמזה דמירל הם חברי צוות מו"פ של החברה בשם Cellorama. ליוסוף מוסטפא סאצ'י, זיינפ אקבולוט ואוזג'קאן קאיאלאר אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
אנו מודים לדייל מרטס מאוניברסיטת שיקגו על הכנת הדיאגרמות, לד"ר מהמט סריף איידין על תמיכתו הטכנית במכון המחקר למדעי הבריאות והטכנולוגיות של אוניברסיטת איסטנבול מדיפול, ולד"ר ראנה קאזמי מאוניברסיטת מלטפה על עריכת כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אתנול אבסולוטי (EtOH) | Merck | 8187602500 | לדלל ב-dH2O כדי לייצר תמיסה של 30%, 50%, 70%, 80%, 90% ו-96% ולאחסן בחנות RT |
| Acetone | Merck | 8222512500 | ב-RT |
| Alexa fluor נבט חיטה אגלוטינין ו-Hoechst בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE ממברנת פלזמה וערכת תיוג גרעינית, אחסן ב-20 מעלות; C |
| אלפא-1-פטו-פרוטאין (AFP) נוגדנים פוליקלונליים מרוכזים ומדוללים מראש | Biocare Medical | CP 028 A | חנות ב-+4 מעלות; C |
| נוגדן נגד אלבומין | Abcam | EPR20195 | חנות ב +4 & deg; C, דילול: 1:50 |
| נוגדן אנטי בטא גלקטוזידאז, עוף פוליקלונלי | Abcam | 134435 | לאחסן ב-+4 מעלות; C, דילול: 1:25 |
| אנטי-ציטוקרטין 5 | Abcam | 53121 | יש לאחסן ב-+4 & deg; C, דילול: 1:100 |
| Arginase-1 ארנב מרוכז ומדולל מראש נוגדן חד שבטי Biocare | Medical | ACI 3058 A, B | Store ב-+4 & deg; C, דילול: 1:50 |
| סידן כלורי (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | מתמוססים בקיבוע של קרנובסקי ליצירת 2 מ"מ CaCl2; יש לאחסן |
| ב-RT Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| צינורות צנטריפוגה, 15 מ"ל | קן | 601051 | |
| צינורות צנטריפוגה, 50 מ"ל | Nest | 602052 | |
| Class II ארון בטיחות מיקרוביולוגי Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| CO2 חממה | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
| רשתות נחושת | מיקרוסקופיה אלקטרונית | G100-Cu | חלקים דקים במיוחד מונחים על הרשתות; 100 קווים/אינץ' רשת מרובעת |
| מייבש נקודה קריטית | Leica | EM CPD300 | לייבוש דגימות ביולוגיות ליישומי SEM בתערובת |
| תמיסת כרומוגן DAB/AEC אצטון מוחלט | חנות Sigma Aldrich | AEC101 | ב-+4 ° C |
| סכין יהלום | דיאטום | אולטרה 45°, 40-US | שימוש לקטעים דקים במיוחד עבור TEM |
| דימתיל סולפוקסיד לביולוגיה מולקולרית | Biofroxx | 67-68-5 | |
| חד פעמי פלסטיק פסטר פיפטות | קן | ||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | חנות ב +4 & deg; C |
| Eosin Y תמיסה אלכוהולית | בהירה שקופית | 2.BS01-105-1000 | |
| שרף אפון | Sigma | 45359-1EA-F | ערכה בינונית להטמעת אפוקסי, יש לאחסן בטמפרטורה של +4 & deg; |
| C סרום בקר עוברי עם תוסף מחזק | Pan Biotech | P30-3304 | חנות ב-+4 מעלות; |
| תמיסת הקפאה C (FS) | Cellorama | CellO-F | ב +4 & deg; C |
| יצרנית סכיני זכוכית | Leica | EM KMR3 | לייצור סכיני זכוכית בעובי 8 מ"מ |
| רצועות סכין זכוכית (גודל 8 מ"מ x 25.4 מ"מ x 400 מ"מ) | Leica | 7890-08 | השתמש בקטעים דקים במיוחד או חצי עבור |
| תמיסה מימית TEM Glutaraldehyde, דרגת EM, 25% | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 16210 | לדלל ב-dH2O כדי ליצור תמיסה של 2.5% ולאחסן ב-+4 ו-deg; |
| תמיסת C גליצרול | סיגמא אולדריץ' | 56-81-5 | חנות ב -20 C, דילול: 1:100 |
| נוגדן משני נגד עוף עיזים IgY (H + L), Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | חנות ב- RT |
| עז נגד עכבר IgG (H + L) נוגדן משני, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | חנות ב +4 & deg; ג, דילול: 1:50 |
| נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עיזים, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | חנות ב-+4 & deg; ג, דילול: 1:50 |
| עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | חנות ב +4 & deg; ג, דילול: 1:50 |
| נוגדן משני נגד ארנב עז IgG (H+L), DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | חנות ב-+4 & deg; C |
| המטוקסילין האריס | שקופית בהירה | 2.BS01-104-1000 | |
| תאי HepG2 | ATCC | HB-8065 | אחסן במיכל חנקן |
| אדם/חולדה OV-6 נוגדן עכבר חד שבטי IgG1 שיבוט # OV-6 | R& D Systems | MAB2020 | חנות ב-20 מעלות; C |
| הידרוג'ל | קורנינג | 354248 | מטריג'ל, מטריצת ממברנת מרתף בריכוז גבוה (HC), ללא LDEV, 10 מ"ל, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C |
| הידרוג'ל | קורנינג | 354234 | מטריג'ל, מטריצת ממברנת מרתף, ללא LDEV, 10 מ"ל, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C |
| הידרוג'ל | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, ללא LDEV גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנה בסיסית |
| הידרוג'ל | ביוטכנולוגיה, מו"פ & D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, חנות ב-20 מעלות; |
| של קרנובסקי | %2 PFA, %2.5 גלוטרלדהיד במאגר קקודילאט 0.15 M, 2 מ"מ CaCl2; הכן טרי; השתמש עבור TEM & דגימות SEM | ||
| L-חומצה אספרטית | סיגמא | 11189-100G | אחסן בתמיסת |
| עופרת RT אספרטט | ממיסים 40 מ"ג חומצה אספרטית ב-10 מ"ל ddH2O ומוסיפים 66 מ"ג עופרת חנקתית. התמיסה מתייצבת ב-60 מעלות; C ולהתאים את ה-pH ל-5; הכינו | ||
| טרי עופרת חנקתית | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 17900 | חנות ב RT |
| Leica מיקרוסקופ קונפוקלי | Leica | DMi8 | |
| LSM 700 סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | ||
| קורא מיקרופלייט | Biotek Synergy | ||
| מכשיר רב תכליתי (MD) | Cellorama | CellO-M | |
| כתם DNA גרעיני | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, פנטהידראט (ביס-בנזמיד) - תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל במים, יש לאחסן בטמפרטורה של +4 מעלות; C |
| כתמי DNA גרעיניים | ThermoFischer Scientific | 62248 | תמיסת DAPI, אחסן ב-+4 & deg; C |
| אוסמיום טטרוקסיד (OsO4) ,4% | מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים | 19190 | לדלל ב-dH2O כדי ליצור תמיסה של 2%; אחסן ב-+4 & deg; C ובמיכל אטום; להגן על |
| אור נוגדן Ov6 | R& מערכות D | MAB2020 | לאחסן ב-+4 ו-deg; |
| תמיסת C Paraformaldehyde (PFA), 4% | Sigma | 1.04005.1000 | ממיסים 4% PFA ב-dH2O ומרתיחים, מצננים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; תמיסת |
| C Paraformaldehyde 4% ב-PBS, 1 ליטר | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | חנות ב-+4 & deg; C |
| Phosphate Buffered Sa Salt (PBS), טבליות | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| תמיסה | %2 OsO4, %2.5 אשלגן פרוציאניד ב-dH2O; הכינו | ||
| תמיסה מימית טרייה של אשלגן פרוציאניד, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26603-01 | חנות ב-RT |
| Primovert - מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך - ZEISS | Zeiss מספר פריט: 491206-0001-000 | ||
| צינורות מיקרוצנטריפוגה תחתונים עגולים, 2 מ"ל | Nest | 620611 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם חיבור STEM | Zeiss | GeminiSEM 500 | אנו משתמשים בגלאי אלקטרונים משניים (SE) של Inlens בתדר 2-3 קילו וולט לסריקת מיקרוגרפים אלקטרונים וגלאי aSTEM בתדר 30 קילו וולט למיקרוגרפי אלקטרונים שידור. |
| SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | חנות ב-+4 מעלות; C |
| נתרן קקודילאט מאגר, 0.4 מ', pH 7.2 | מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים | 11655 | מדלל ב-dH2O כדי ליצור 0.2 מ' ולאחסן ב-+4 מעלות; C |
| נתרן/אשלגן ATPase אלפא 1 נוגדן [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | לאחסן ב-20 מעלות; תמיסת C |
| לתיוג אימונופלואורסצנטי (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | אחסן ב-+4 מעלות; |
| תמיסת C לאימונוהיסטוכימיה (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Store ב-+4 ° |
| C מכשיר חיתוך דגימה | Leica | EM TRIM2 | להכנת בלוק דגימה epon לציפוי מקרטע אולטרה-מיקרוטום |
| Leica | EM ACE200 | ציפוי דגימות SEM עם זהב/פלדיום 6 ננומטר למשך 90 שניות | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | מדלל ב-dH2O ליצירת תמיסה של 0.5% ומסנן עם 0.22 & מיקרו; מסנן קרום m; חנות ב-RT; הכן טרי |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| אולטרה ג'ל סופר דבק | Pattex | PSG2C | לדבק פולימר אפון בלוק עם מדגם למחזיק בלוק אפון |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | להכנת קטעים דקים במיוחד או חצי איכותיים למיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) |
| טיפים לפיפטה אוניברסלית, 10 ומיקרו; L | Nest | 171215-1101 | |
| קצות פיפטה אוניברסליים, 1000 ומיקרו; L | Isolab | L-002 | |
| קצות פיפטה אוניברסליים, 200 ומיקרו; L | Nest | 110919HA01 | |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | לדלל ב-dH2O כדי ליצור תמיסה ומסנן של 2% עם 0.22 µ מסנן קרום m; שמור על חנות מכולות סגורה היטב ב-RT |
מקורות
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Nath, S., Devi, G. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
