מאמר שיטה

ב Silico זיהוי ואפיון של circRNAs במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן

DOI:

10.3791/64565

⸱

21 באוקטובר 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR), Universiti Malaya

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוגש כאן מסביר את צנרת הסיליקו המלאה הדרושה לחיזוי ולאפיון פונקציונלי של CirRNAs מנתוני שעתוק ריצוף RNA החוקרים אינטראקציות מארח-פתוגן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רנ"א מעגלי (circRNAs) הוא סוג של רנ"א לא מקודד שנוצר באמצעות שחבור אחורי. מעגלי רנ"א אלה נחקרים בעיקר בשל תפקידם כרגולטורים של תהליכים ביולוגיים שונים. יש לציין כי ראיות חדשות מוכיחות כי CirRNA מארח יכול לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי (DE) בעת הדבקה בפתוגנים (למשל, שפעת ווירוסי קורונה), דבר המצביע על תפקיד של circRNA בוויסות תגובות החיסון המולד של המארח. עם זאת, חקירות על תפקידם של circRNAs במהלך זיהומים פתוגניים מוגבלות על ידי הידע והמיומנויות הדרושים לביצוע הניתוח הביואינפורמטי הדרוש לזיהוי DE circRNAs מנתוני ריצוף RNA (RNA-seq). חיזוי וזיהוי ביואינפורמטיקה של circRNA הוא חיוני לפני כל אימות, ומחקרים פונקציונליים המשתמשים בטכניקות מעבדה רטובות יקרות וגוזלות זמן. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול שלב אחר שלב של חיזוי סיליקו ואפיון של circRNAs באמצעות נתוני RNA-seq מסופק בכתב יד זה. ניתן לחלק את הפרוטוקול לארבעה שלבים: 1) חיזוי וכימות של DE circRNA באמצעות צינור CIRIquant; 2) ביאור באמצעות circBase ואפיון של DE circRNAs; 3) חיזוי אינטראקציה CircRNA-miRNA דרך צינור Circr; 4) ניתוח העשרה פונקציונלית של גנים הוריים circRNA באמצעות אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG). צינור זה יהיה שימושי בהנעת מחקר עתידי במבחנה ו-in vivo כדי לפענח עוד יותר את התפקיד של circRNA באינטראקציות מארח-פתוגן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות מארח-פתוגן מייצגות יחסי גומלין מורכבים בין הפתוגנים לבין אורגניזמים מארחים, אשר מעוררים את התגובה החיסונית המולדת של המארחים שבסופו של דבר מביאה לסילוק פתוגנים פולשים 1,2. במהלך זיהומים פתוגניים, מספר רב של גנים חיסוניים המאכסן מווסתים כדי לעכב את השכפול והשחרור של פתוגנים. לדוגמה, גנים נפוצים המעוררים אינטרפרון (ISGs) המווסתים על זיהומים פתוגניים כוללים ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I ו- OASL 3,4. מלבד גנים מקודדי חלבונים, מחקרים דיווחו גם כי RNA שאינו מקודד כגון RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs), microRNA (miRNAs) ו- RNA מעגלי (circRNAs) גם לשחק תפקיד והם מווסתים בו זמנית במהלך זיהומים פתוגניים 5,6,7. בניגוד לגנים מקודדי חלבונים המקודדים בעיקר חלבונים כמולקולות פונקציונליות, RNA לא מקודד (ncRNAs) ידוע כמתפקד כמווסת של גנים ברמת השעתוק ואחרי השעתוק. עם זאת, מחקרים הכוללים השתתפות של RNA לא מקודד, במיוחד circRNAs, בוויסות הגנים החיסוניים של המארחים אינם מדווחים היטב בהשוואה לגנים מקודדי החלבון.

CircRNAs מאופיינים באופן נרחב על ידי מבנה לולאה רציפה סגורה קוולנטית, אשר נוצר באמצעות תהליך שחבור לא קנוני שנקרא שחבור אחורי8. תהליך השחבור האחורי, בניגוד לתהליך השחבור של רנ"א ליניארי קוגנטי, כולל קשירה של אתר התורם במורד הזרם לאתר המקבל במעלה הזרם, ויוצר מבנה בצורת מעגל. נכון לעכשיו, הוצעו שלושה מנגנוני שחבור אחוריים שונים עבור הביוגנזה של circRNAs. אלה הם RNA binding protein (RBP) mediated circularization9,10, intron-pairing-driven circularization 11, and lariat-driven circularization12,13,14. בהתחשב בכך ש-circRNA מחוברים מקצה לקצה במבנה מעגלי, הם נוטים להיות עמידים באופן טבעי לעיכול אקסונוקלאז רגיל, ולכן נחשבים יציבים יותר מעמיתיהם הליניאריים15. מאפיין נפוץ נוסף המוצג על ידי circRNA כולל ביטוי ספציפי לסוג התא או הרקמה במארחים16.

כפי שמשתמע מהמבנה הייחודי שלהם ומהביטוי הספציפי שלהם לתא או לרקמה, התגלו כבעלי תפקידים ביולוגיים חשובים בתאים. נכון להיום, אחד התפקידים הבולטים של סירק-רנ"א הוא תפקידם כספוגי מיקרו-רנ"א (miRNA)17,18. תפקיד רגולטורי זה של circRNAs מתרחש באמצעות קשירה משלימה של נוקלאוטידים circRNA עם אזור הזרעים של miRNAs. אינטראקציה כזו של circRNA-miRNA מעכבת את תפקודי הבקרה הרגילים של miRNA על mRNA מטרה, ובכך מווסתת את ביטוי הגנים19,20. בנוסף, CirRNAs ידועים גם לווסת ביטוי גנים על ידי אינטראקציה עם חלבונים קושרי RNA (RBPs) ויצירת קומפלקסים RNA-חלבון21. למרות ש-circRNA מסווגים כ-RNA שאינו מקודד, יש גם ראיות לכך ש-circRNA יכול לשמש כתבניות לתרגום חלבונים22,23,24.

לאחרונה הודגם כי CirRNAs ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות יחסי הגומלין בין המאכסן לפתוגן, במיוחד בין המארחים לנגיפים. באופן כללי, מניחים כי הרנ"א של הפונדקאי מסייע בוויסות התגובה החיסונית של הפונדקאי כדי לחסל את הפתוגנים הפולשים. דוגמה ל-circRNA שמקדם תגובות חיסוניות של המארח היא circRNA_0082633, שדווחה על ידי Guo et al.25. CirRNA זה משפר את איתות אינטרפרון מסוג I (IFN) בתוך תאי A549, אשר מסייע לדכא שכפול וירוס שפעת25. יתר על כן, Qu et al. דיווחו גם על CirRNA אינטרוני אנושי, הנקרא circRNA AIVR, המקדם חסינות על ידי ויסות הביטוי של חלבון קושר CREB (CREBBP), מתמר אותות של IFN-β26,27. עם זאת, קיימים גם סירק-רנ"א הידועים כמקדמים את הפתוגנזה של מחלה בעת זיהום. לדוגמה, Yu et al. דיווחו לאחרונה על התפקיד שממלא CirRNA שחבור מתחום אצבע אבץ GATA המכיל את הגן 2A (circGATAD2A) בקידום שכפול נגיף H1N1 באמצעות עיכוב של אוטופגיה של התא המארח28.

כדי לחקור ביעילות circRNAs, מיושם בדרך כלל אלגוריתם חיזוי circRNA כלל-גנומי, ואחריו אפיון בסיליקו של המועמדים החזויים ל-circRNA לפני שניתן לבצע מחקרים פונקציונליים כלשהם. גישה ביואינפורמטית כזו לחיזוי ואפיון CirRNA היא פחות יקרה ויותר חסכונית בזמן. זה עוזר לחדד את מספר המועמדים להיחקר באופן פונקציונלי ועשוי להוביל לממצאים חדשים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט מבוסס ביואינפורמטיקה לזיהוי, אפיון וביאור פונקציונלי של circRNA במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן. הפרוטוקול כולל זיהוי וכימות של circRNA ממערכי נתונים של ריצוף RNA, ביאור באמצעות circBase, ואפיון המועמדים ל-circRNA במונחים של סוגי circRNA, מספר גנים חופפים ואינטראקציות circRNA-miRNA חזויות. מחקר זה מספק גם את הביאור הפונקציונלי של הגנים ההוריים circRNA באמצעות אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) ניתוח העשרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, מערכי נתונים של ספריית RNA-seq ריבוזומלית (rRNA)-מדולדלת RNA-seq שהוכנו מתאי מקרופאג אנושיים נגועים בנגיף שפעת A הורדו ושימשו ממסד הנתונים של אומניבוס ביטוי גנים (GEO). כל צינור הביואינפורמטיקה מהחיזוי ועד לאפיון הפונקציונלי של ה-circRNA מסוכם באיור 1. כל חלק של הצינור מוסבר בהרחבה בסעיפים הבאים.

1. הכנה, הורדה והגדרה לפני ניתוח נתונים

הערה: כל חבילות התוכנה המשמשות במחקר זה הן חופשיות וקוד פתוח.

  1. הורדת הכלים הנדרשים לפלטפורמת לינוקס
    1. הורד והתקן את התוכנות והכלים הדרושים המפורטים בטבלת החומרים במחשב בעל ביצועים גבוהים של Linux באמצעות ההוראות שסופקו על-ידי המפתח.
      הערה: לרוב הכלים והתוכנות יש דפי GitHub מקוונים משלהם או תיעוד המכיל הוראות להתקנת הכלים שלהם ולשימוש בהם (עיין בטבלת החומרים).
    2. הורד את ערכות הנתונים הרצויות של RNA-seq לזיהוי וניתוח circRNA מאתרי ארכיון רצפים (לדוגמה, ארכיון הנוקלאוטידים האירופי ואומניבוס ביטוי גנים).
    3. הורד את גנום הייחוס (תבנית FASTA) ואת קובצי הביאור (תבנית GTF/GFF3), התואמים למחשב המארח שממנו הוכן מערך הנתונים RNA-seq. גנום ייחוס מארח וקבצי ביאור נמצאים בדרך כלל בדפדפני גנום מקוונים כגון המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI), אוניברסיטת קליפורניה סנטה קרוז (UCSC) ואתרי האינטרנט של אנסמבל.
  2. בדיקת איכות של RNA-seq
    1. הזן את קבצי FASTQ לתוכנית FASTQC כדי לקבוע את איכות רצפי הרנ"א. אם האיכות של קבצי FASTQ נמוכה (לדוגמה, 29,30.

2. חיזוי וניתוח ביטוי דיפרנציאלי של circRNA באמצעות CIRIquant

הערה: מדריך מפורט יותר להתקנה וביצוע של ניתוח ביטויים דיפרנציאליים ניתן למצוא בסעיף זמינות הקוד במאמר CIRIquant31. הנתונים המשלימים כוללים גם כמה מהפקודות הבסיסיות המשמשות בפרוטוקול זה.

  1. תחזיות CircRNA
    1. צור אינדקס של גנום הייחוס של המארח תחילה באמצעות קשתיות יישור BWA ו- HISAT2. לאחר מכן, במסוף לינוקס, בצע את הפקודות bwa index 32 ו- hisat2-build33 בספרייה של גנום הייחוס של המארח כדי לאנדקס אותו.
    2. לאחר מכן, הכן קובץ תצורת YML המכיל את שם הקובץ, נתיב הכלים (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), הנתיב לקובצי הייחוס שהורדו (קבצי FASTA של גנום הייחוס של המארח, קבצי ביאור) והנתיב לקבצי האינדקס משלב 2.1.1.
    3. הפעל את הכלי CIRIquant מהמסוף באמצעות ברירת המחדל או פרמטרים ידניים. המשתמש יכול לציין את סוג הספרייה (תקועה או לא תקועה) של נתוני RNA-seq בעת הפעלת הכלי CIRIquant.
      הערה: ניתן לקבוע את סוג הספרייה של נתוני RNA-seq על-ידי הכרת סוג ערכת הכנת הספרייה שבה נעשה שימוש. אם זהותה של ערכת הכנת הספרייה אינה ידועה, ניתן להשתמש בחבילה ביואינפורמטית של בקרת RNA-seq בשם RSeQC36 כדי לקבוע את גדילות נתוני RNA-seq.
  2. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי
    הערה: חבילת CIRIquant כוללת prep_CIRIquant, prepDE.py ו-CIRI_DE_replicate; לכן, אין צורך בהורדות נוספות עבור שלושת הכלים הללו.
    1. הכנת קובץ טקסט ( .lst) עם רשימת נתונים המכילה את הנתונים הבאים:
      עמודה 1st : מזהים של נתוני RNA-seq המשמשים בשלב 2.1.3
      עמודהשנייה : נתיב לקבצי GTF שהופקו על ידי CIRIquant
      עמודהשלישית : קיבוץ של נתוני RNA-seq, בין אם מדובר בקבוצת ביקורת או בקבוצת טיפול.
    2. לדוגמה, עיין בטבלה 1 להלן.
      הערה: אין צורך לשים את הכותרות כפי שהם רק לעיון.
    3. במסוף Linux, הפעל prep_CIRIquant עם קובץ הטקסט ( .lst) שהוכן בשלב 2.2.1 כקלט. ההפעלה תיצור רשימה של קבצים: library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv ו - circRNA_ratio.csv.
    4. הכן קובץ טקסט שני עם רשימת נתונים המכילה את מזהי RNA-seq ואת הנתיב לפלט StringTie המתאים שלהם. פריסת הקובץ חייבת להיות דומה לקובץ הטקסט בשלב 2.2.1 ללא עמודת הקיבוץ.
    5. הפעל prepDE.py עם קובץ הטקסט שהוכן בשלב 2.2.4 כקלט ליצירת קבצי מטריצת ספירת הגנים.
    6. הפעל CIRI_DE_replicate עם קבצי library_info.csv ו- circRNA_bsj.csv משלב 2.2.3 וקובץ gene_count_matrix.csv משלב 2.2.5 כקלט כדי להפיק את קובץ circRNA_de.tsv הסופי.
  3. סינון של DE circRNAs
    1. השתמש ב- R (במסוף המחשב או ב- RStudio) או בכל תוכנת גיליון אלקטרוני (לדוגמה, Microsoft Excel) כדי לפתוח את קובץ circRNA_de.tsv שנוצר משלב 2.2.6 כדי לסנן ולקבוע את מספר ה- circRNA המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DE).
    2. סינון DE circRNAs על פי הקריטריונים LogFC > |2| ו- FDR < 0.05.
    3. צור קובץ בשם DE_circRNAs.txt לאחסון המידע של DE circRNAs.

3. אפיון וביאור של DE circRNA חזוי

  1. מצב ביאור של DE circRNAs
    1. טען את הקובץ בשם DE_circRNAs.txt ב- RStudio , המורכב מרשימת DE circRNA המסוננת משלב 2.3.3. כלול מידע נוסף כגון המיקומים הגנומיים (Chr, Start, End), כיווני גדיל (+ או -), שם הגן וסוג circRNA. לפני שתמשיך, המר את קואורדינטות ההתחלה הגנומית של circRNA מ- CIRIquant ל- 0-based על ידי חיסור זוג בסיס אחד.
      הערה: ניתן לקבל את המידע האחר המצוין לעיל מקבצי GTF שהופקו על ידי CIRIquant (קובץ משלים 1).
    2. קבע את מצב הביאור של ה- DE החזוי circRNAs על ידי הורדת ספרייה המכילה את המיקומים הגנומיים של מסד הנתונים circRNA (למשל, circBase) שהופקד circRNAs.
      הערה: ודא שגרסת הגנום המשמשת לחיזוי ה- circRNA זהה לספריית מסד הנתונים circRNA לפני ביצוע ההשוואה. קובץ הנתונים circBase המשמש כאן זמין באופן חופשי בתיקיית הכונן המסופקת ב- Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37.
    3. לאחר הכנת שני הקבצים משלב 3.1.1 ושלב 3.1.2, הפעל את סקריפט R שניתן בקובץ משלים 1. מיקומים כרומוזומליים של DE circRNA נשאלים לספריה לפני הקצאת המצב מבואר או לא מבואר.
  2. אפיון DE circRNAs
    1. השתמש ב-R ובתוכנות גיליון אלקטרוני אחרות כדי לסכם את מספר ה-circRNAs לפי סוגי ה-circRNA (כלומר, אקסון, אינטרון, אינטרגני ואנטיסנס) ומספר הגנים שה-circRNA משתרעים על פני (1 או >1) (קובץ משלים 1).הערה: CIRIquant יכול לזהות רק ארבעה סוגים של circRNA (אקסון, אינטרון, אינטרגני ואנטיסנס). CirRNA אקסון-אינטרון, הידוע גם בשם ElciRNAs, אינו ניתן לזיהוי על ידי CIRIquant.

4. חיזוי האינטראקציה circRNA-miRNA באמצעות Circr

הערה: מדריך מפורט יותר כיצד להתקין ולהשתמש ב- Circr לניתוח אינטראקציה circRNA-miRNA ניתן למצוא בכתובת: https://github.com/bicciatolab/Circr 37.

  1. הכנת תיקים
    1. פתח וחלץ את התוכן של הקובץ Circr.zip לאחר הורדתו מדף Circr GitHub באמצעות התוכנה הרלוונטית כגון "WinRar" או "7-zip" לספרייה חדשה שבה יבוצע הניתוח.
    2. התקן את יישומי התוכנה הנדרשים מראש (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools ו- samtools) לפני ביצוע ניתוח circRNA-miRNA.
    3. גנומי ייחוס וקובצי ביאור עבור מספר אורגניזמים בעלי עניין, קובץ קואורדינטות rRNA, קובץ אינטראקציה מאומת miRNA וקבצי circBase circRNA מסופקים על ידי מחבר Circr בדף Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37. לאחר לחיצה על קבצי התמיכה בתיקיית הכונן, בחר את התיקיה עבור האורגניזם המעניין, תיקיית miRNA וקובץ הטקסט circBase והורד אותו.
    4. לאחר הורדת הקבצים הדרושים בשלב 4.1.3, צור ספריה חדשה בשם support_files בספריה המוזכרת בשלב 4.1.1. לאחר מכן, חלץ וחלץ את התוכן לספריית support_files .
    5. אינדקס את קובץ גנום הייחוס של האורגניזם המעניין באמצעות הפקודה samtools faidx (קובץ משלים 1).
    6. הכן קובץ קלט המורכב מהקואורדינטות של DE circRNA המעניינות בקובץ BED מופרד באמצעות טאבים, כפי שמוצג בטבלה 2.
      הערה: מכיוון ש- circRNA שנחזה על ידי CIRIquant אינו מבוסס 0, יש צורך במינוס 1 bp בקואורדינטת ההתחלה (כפי שהוזכר בשלב 3.1.1) לפני המרתם לתבנית BED. הכותרות המוצגות בטבלה 2 מיועדות לעיון בלבד ואינן נחוצות בקבצי BED.
    7. בשלב זה, ודא שמבנה עץ התיקיות הצפוי עבור ניתוח Circr הוא כמו באיור 2.
  2. ריצה Circr.py
    1. בצע Circr.py באמצעות Python 3, וכארגומנטים, ציין את קובץ הקלט circRNA, את גנום FASTA של האורגניזם המעניין, את גרסת הגנום של האורגניזם שנבחר, את מספר החוטים ואת שם קובץ הפלט בשורת הפקודה.
    2. אם האורגניזם המעניין אינו מסופק בתיקיית הכונן המפורטת בשלב 4.1.3 או אם המשתמש מעדיף לקבל קבוצה מותאמת אישית של קבצים להפעלת הניתוח, פקודות נוספות המציינות את המיקום של קבצים אלה צריכות להיכלל בעת ביצוע Circr.py.
    3. לאחר השלמת ניתוח Circr, התוכנית מפיקה קובץ אינטראקציה circRNA-miRNA בפורמט csv.
    4. סנן את תוצאות האינטראקציה circRNA-miRNA בהתאם להעדפה הספציפית למשתמש. עבור מחקר זה, התחזיות מסוננות באמצעות Rstudio על פי הקריטריונים הבאים:
      -זוהה על ידי כל שלושת כלי התוכנה
      - שני אתרי כריכה או יותר שדווחו הן על ידי Targetscan והן על ידי miRanda
      -מזוהה בעמודות "AGO" או "מאומת"
      -לסנן ללא אינטראקציות באזור הזרעים
    5. כתוב את ה- circRNA שמעביר את התנאים המסוננים משלב 4.2.3 לקובץ טקסט חדש בשם circRNA_miRNA.txt. סינון כזה יכול להגביר את הביטחון של האינטראקציות החזויות.

5. בניית רשת ceRNA

הערה: מדריך מפורט כיצד להשתמש ב-Cytoscape ניתן למצוא בכתובת: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ ו-https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction

  1. הורדה והכנה
    1. הורידו את הגרסה האחרונה של Cytoscape38 מ: https://cytoscape.org/download.html.
    2. הפעל את אשף ההתקנה שהורדת בשלב 5.1.1 ובחר את מיקום הקובץ עבור תוכנת Cytoscape.
    3. הכינו קובץ מופרד בטאבים המכיל את ה-circRNA המעניינים ואת miRNA היעד שלהם. העמודה הראשונה מורכבת משם ה-circRNA; העמודה השנייה מציינת את סוג הרנ"א מהעמודה הראשונה; העמודה השלישית היא miRNA המטרה; והעמודה הרביעית מציינת את סוג הרנ"א מהעמודה השלישית. דוגמה של הקובץ מוצגת בטבלה 3.
  2. בניית מפת רשת ceRNA
    1. פתח את תוכנת Cytoscape המותקנת בשלב 5.1.2.
    2. ב- Cytoscape, נווט אל File > Import > Network from File. בחר את הקובץ שהוכן בשלב 5.1.3.
    3. בכרטיסייה החדשה, בחר את העמודה הראשונה והשנייה כ"צומת מקור" ו"תכונת צומת מקור" ואילו בחר את העמודה השלישית והרביעית כ"צומת יעד" ו"תכונת צומת יעד" בהתאמה. לחץ על אישור והרשת תופיע בפינה השמאלית העליונה של Cytoscape.
    4. כדי לשנות את הסגנון החזותי של הרשת, לחץ על הלחצן Style בצד שמאל של Cytoscape.
    5. לחצו על החץ בצד ימין של 'צבע מילוי'. בחר Type עבור העמודה ו - Disdisc Mapping עבור סוג המיפוי. לאחר מכן, בחר את הצבע הרצוי עבור כל אחד מסוגי RNA.
    6. לאחר שינוי הצבע, שנה את צורת הצמתים על-ידי ניווט אל צורה וביצוע שלב 5.2.5.

6. ניתוח העשרה פונקציונלית

  1. ניתוח אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) עבור הגן ההורי של ה-circRNA
    1. ודא את clusterProfiler39,40 ו- org. Hs.eg.db41 חבילות הותקנו ב-Rstudio. הארגון. חבילת Hs.eg.db41 היא חבילת ביאור כלל גנומית לבני אדם בלבד. אם האורגניזם המעניין הוא מין אחר, עיין ב: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb
    2. יבא את המידע DE_circRNA משלב 2.3.1 לסביבת העבודה של Rstudio.
    3. השתמש בגן ההורים של circRNA שסופק בקובץ זה לניתוח העשרה בשלבים הקרובים. עם זאת, אם המשתמש מעוניין להמיר את סמל הגן לפורמטים אחרים, כגון מזהה Entrez, השתמש בפונקציה כגון "bitr".
    4. על ידי שימוש במזהה הגן כקלט, הפעל את ניתוח העשרת GO באמצעות הפונקציה enrichGO בתוך חבילת clusterProfiler39,40 באמצעות פרמטרי ברירת מחדל.
    5. על ידי שימוש במזהה הגן כקלט, הפעל את ניתוח העשרת KEGG באמצעות הפונקציה enrichKEGG בתוך חבילת clusterProfiler39,40 באמצעות פרמטרי ברירת המחדל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שגויס בסעיף הקודם שונה והוגדר כך שיתאים למערכת ההפעלה לינוקס. הסיבה העיקרית היא שרוב ספריות המודולים והחבילות המעורבות בניתוח circRNAs יכולות לעבוד רק על פלטפורמת לינוקס. בניתוח זה, מערכי נתונים של ספריית RNA-seq ריבוזומלית (rRNA)-מדולדלת RNA-seq שהוכנו מתאי המקרופאגים האנושיים הנגועים בנגיף שפעת A הורדו ממסד הנתוניםGEO 42 ושימשו ליצירת התוצאות המייצגות.

חיזוי וכימות CircRNA
בניתוח זה, מערכי נתונים של ספריית RNA-seq ריבוזומלית (rRNA) שהוכנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש את התועלת של פרוטוקול זה, RNA-seq מתאי מקרופאג אנושיים נגועים בנגיף שפעת A שימש כדוגמה. נבדקו סירקרנ"א המתפקדים כספוגי miRNA פוטנציאליים באינטראקציות פונדקאי-פתוגן והעשרה תפקודית של GO ו-KEGG בתוך פונדקאי. למרות שיש מגוון רחב של כלי circRNA זמין באינטרנט, כל אחד מהם הוא חבילה עצמאית שאינה אינטראקציה אחד עם השני. כאן, ריכזנו כמה מהכלים הדרושים לחיזוי וכימות circRNA, העשרה תפקודית circRNA, חיזוי אינטראקציה circRNA-miRNA ובניית רשת ceRNA. פרוטוקול יעיל זה חוסך זמן וניתן ליישם אותו על דגימות קליניות כדי לזהות מועמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר רוצה להודות לטאן קה אן ולד"ר קמרון בראקן על ביקורתם על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית מענקי מחקר בסיסית (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) ומענק מחקר בעל השפעה גבוהה באוניברסיטת מלאיה (UM. ג/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BedtoolsGitHubhttps://github.com/arq5x/bedtools2/מתייחס לסעיף 4.1.2. דרוש לסירקר.
BWA Burrows-Wheeler Alignerhttp://bio-bwa.sourceforge.net/מתייחס לסעיף 2.1.1 ו-2.1.2. דרוש להריץ את CIRIquant, ולאנדקס את הגנום
CircrGitHubhttps://github.com/bicciatolab/Circrבהתייחס לסעיף 4. השתמש כדי לחזות את אתרי קשירת ה-miRNA
CIRIquantGitHubhttps://github.com/bioinfo-biols/CIRIquantבהתייחס לסעיף 2.1.3. כדי לחזות circRNAs
ClusterprofilerGitHubhttps://github.com/YuLab-SMU/clusterProfilerבהתייחס לסעיף 7. להעשרה פונקציונלית של GO ו-KEGG
מעבדIntel  מעבד Intel(R) Xeon(R) E5-2620 v2 @ 2.10 GHz    ליבות: מעבד 6 ליבות זיכרון: 65 ג'יגה-בייט כרטיס מסך: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) מפרטים המשמשים להפעלת פרוטוקול זה כולו.
CytoscapeCytoscapehttps://cytoscape.org/download.htmlבהתייחס לסעיף 5.2. דרוש כדי לשרטט רשת ceRNA
FastQCBabraham Bioinformaticshttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/מתייחס לסעיף 1.2.1. בדיקת איכות בקבצי Fastq
HISAT2http://daehwankimlab.github.io/hisat2/בהתייחס לסעיף 2.1.1 ו- 2.1.2. דרוש כדי להריץ את CIRIquant, וכדי להוסיף לאינדקס את הגנום
לינוקסאובונטו 20.04.5 LTS (Focal Fossa)https://releases.ubuntu.com/focal/דרוש כדי להריץ את הפרוטוקול כולו. גרסאות אחרות של אובונטו עשויות עדיין להיות תקפות לביצוע הפרוטוקול.
miRandahttp://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doמתייחס לסעיף 4.1.2. דרוש עבור Circr
Pybedtools pybedtools0.8.2https://pypi.org/project/pybedtools/דרוש למניפולציה גנומית של קובץ BED
PythonPython 2.7 ו-3.6 או aboverhttps://www.python.org/downloads/להפעלת מודולי הספרייה הדרושים
Rרשת הארכיון המקיפה R https://cran.r-project.org/למניפולציה של מסגרות נתונים
RNAhybridBiBiServhttps://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybridמתייחס לסעיף 4.1.2. דרוש לסביבת עבודה של Circr
RStudioRStudiohttps://www.rstudio.com/A להפעלת R
samtools SAMtoolshttp://www.htslib.org/מתייחס לסעיף 2.1.2. דרוש להפעלת CIRIquant
StringTieאוניברסיטת ג'ונס הופקינס: המרכז לביולוגיה חישוביתhttp://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlבהתייחס לסעיף 2.1.2. דרוש כדי להפעיל את CIRIquant
TargetScanGitHubhttps://github.com/nsoranzo/targetscanבהתייחס לסעיף 4.1.2. דרוש ל-Circr

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Yang, E., Li, M. M. H. All About the RNA: Interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes. Frontiers in Immunology. 11, 605024(2020).
  4. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: A complex web of host defenses. Annual Review of Immunology. 32 (1), 513-545 (2014).
  5. Shirahama, S., Miki, A., Kaburaki, T., Akimitsu, N. Long non-coding RNAs involved in pathogenic infection. Frontiers in Genetics. 11, 454(2020).
  6. Chandan, K., Gupta, M., Sarwat, M. Role of host and pathogen-derived microRNAs in immune regulation during infectious and inflammatory diseases. Frontiers in Immunology. 10, 3081(2019).
  7. Chen, X., et al. Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics. 9 (2), 588-607 (2019).
  8. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  9. Ashwal-Fluss, R., et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 56 (1), 55-66 (2014).
  10. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  11. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  12. Robic, A., Demars, J., Kuhn, C. In-depth analysis reveals production of circular RNAs from non-coding sequences. Cells. 9 (8), 1806(2020).
  13. Eger, N., Schoppe, L., Schuster, S., Laufs, U., Boeckel, J. N. Circular RNA splicing. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1087, 41-52 (2018).
  14. Barrett, S. P., Wang, P. L., Salzman, J. Circular RNA biogenesis can proceed through an exon-containing lariat precursor. eLife. 4, 07540(2015).
  15. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  16. Misir, S., Wu, N., Yang, B. B. Specific expression and functions of circular RNAs. Cell Death and Differentiation. 29 (3), 481-491 (2022).
  17. Bai, S., et al. Construct a circRNA/miRNA/mRNA regulatory network to explore potential pathogenesis and therapy options of clear cell renal cell carcinoma. Scientific Reports. 10 (1), 13659(2020).
  18. Sakshi, S., Jayasuriya, R., Ganesan, K., Xu, B., Ramkumar, K. M. Role of circRNA-miRNA-mRNA interaction network in diabetes and its associated complications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 1291-1302 (2021).
  19. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  20. Lu, M. Circular RNA: functions, applications, and prospects. ExRNA. 2 (1), 15(2020).
  21. Liu, K. S., Pan, F., Mao, X. D., Liu, C., Chen, Y. J. Biological functions of circular RNAs and their roles in occurrence of reproduction and gynecological diseases. American Journal of Translational Research. 11 (1), 1-15 (2019).
  22. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  23. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  24. Weigelt, C. M., et al. An insulin-sensitive circular RNA that regulates lifespan in Drosophila. Molecular Cell. 79 (2), 268-279 (2020).
  25. Guo, Y., et al. Identification and characterization of circular RNAs in the A549 cells following Influenza A virus infection. Veterinary Microbiology. 267, 109390(2022).
  26. Qu, Z., et al. A novel intronic circular RNA antagonizes influenza virus by absorbing a microRNA that degrades CREBBP and accelerating IFN-β production. mBio. 12 (4), 0101721(2021).
  27. Kawarada, Y., et al. TGF-β induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Scientific Reports. 6 (1), 35483(2016).
  28. Yu, T., et al. Circular RNA GATAD2A promotes H1N1 replication through inhibiting autophagy. Veterinary Microbiology. 231, 238-245 (2019).
  29. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  30. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  31. Zhang, J., Chen, S., Yang, J., Zhao, F. Accurate quantification of circular RNAs identifies extensive circular isoform switching events. Nature Communications. 11 (1), 90(2020).
  32. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  33. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. 37 (8), 907-915 (2019).
  34. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  35. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  37. Dori, M., Caroli, J., Forcato, M. Circr, a computational tool to identify miRNA:circRNA associations. Frontiers in Bioinformatics. 2, 852834(2022).
  38. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  39. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The Innovation. 2 (3), 100141(2021).
  40. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS: A Journal of Integrative Biology. 16 (5), 284-287 (2012).
  41. Carlson, M. org.Hs.eg.db: Genome wide annotation for human. 2022. R package version 3.15.0. , Available from: https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html (2022).
  42. Barrett, T., et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Research. 41, 991-995 (2012).
  43. Gao, Y., Zhang, J., Zhao, F. Circular RNA identification based on multiple seed matching. Briefings in Bioinformatics. 19 (5), 803-810 (2018).
  44. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  45. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  46. Wang, K., et al. MapSplice: Accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), 178(2010).
  47. Song, X., et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Research. 44 (9), 87(2016).
  48. Hansen, T. B. Improved circRNA identification by combining prediction algorithms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 20(2018).
  49. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  50. Ma, X. K., et al. CIRCexplorer3: A CLEAR pipeline for direct comparison of circular and linear RNA expression. Genomics Proteomics Bioinformatics. 17 (5), 511-521 (2019).
  51. Gaffo, E., Buratin, A., Dal Molin, A., Bortoluzzi, S. Sensitive, reliable and robust circRNA detection from RNA-seq with CirComPara2. Briefings in Bioinformatics. 23 (1), (2022).
  52. Glažar, P., Papavasileiou, P., Rajewsky, N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 20 (11), New York, N.Y. 1666-1670 (2014).
  53. Tan, S., et al. Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 17 (1), 138(2018).
  54. Guarnerio, J., et al. Oncogenic role of Fusion-circRNAs Derived from cancer-associated chromosomal translocations. Cell. 165 (2), 289-302 (2016).
  55. McGeary, S. E., et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 366 (6472), (2019).
  56. Enright, A. J., et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology. 5 (1), 1(2003).
  57. Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M., Giegerich, R. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 10 (10), 1507-1517 (2004).
  58. Zhang, D., et al. AllEnricher: a comprehensive gene set function enrichment tool for both model and non-model species. BMC Bioinformatics. 21 (1), 106(2020).
  59. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNARNAcircRNAcircRNAGene OntologyKEGGcircRNA miRNA

מאמרים קשורים