מאמר זה מפרט את שיטות האבחון של מחלת לב מולדת (CHD) באמצעות אקוקרדיוגרפיה עוברית, נקרופסיה, ולכידת תמונה פלואורסצנטית אפיסקופית (EFIC) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM) ואחריו שחזור תלת ממדי (3D).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
צינור לאפיון מומי לב מבניים בעכבר העוברי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלות לב מולדות (CHDs) הן הגורמים העיקריים למוות תינוקות בארצות הברית. בשנות השמונים ולפני כן, רוב החולים עם CHD בינוני או חמור מתו לפני הבגרות, עם התמותה המקסימלית בשבוע הראשון לחיים. התקדמות יוצאת דופן בטכניקות כירורגיות, גישות אבחון וניהול רפואי הובילו לשיפור ניכר בתוצאות. כדי לענות על הצרכים המחקריים הקריטיים של הבנת מומי לב מולדים, מודלים של מורין סיפקו פלטפורמת מחקר אידיאלית, מכיוון שיש להם אנטומיה דומה מאוד לבני אדם ושיעורי הריון קצרים. השילוב של הנדסה גנטית עם כלי פנוטיפ בעלי תפוקה גבוהה איפשר שכפול ואבחון של מומי לב מבניים כדי להבהיר עוד יותר את המסלולים המולקולריים שמאחורי CHDs. השימוש באקוקרדיוגרפיה עוברית לא פולשנית כדי לסנן את הפנוטיפים הלבביים במודלים של עכברים יחד עם הנאמנות הגבוהה של לכידת תמונה פלואורסצנטית אפיסקופית (EFIC) באמצעות היסטופתולוגיה של מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM) עם שחזורים תלת ממדיים (3D) מאפשרים מבט מפורט על האנטומיה של מומי לב מולדים שונים. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מלאה של שיטות אלה כדי לקבל אבחנה מדויקת של מומי לב מולדים. יישום פרוטוקול פנוטיפ זה על אורגניזמים מודל יאפשר אבחון מדויק של CHD, ויניב תובנות לגבי המנגנונים של CHD. זיהוי המנגנונים הבסיסיים של CHD מספק הזדמנויות לטיפולים והתערבויות פוטנציאליים.
מבוא
מחלות לב מולדות (CHDs) הן המומים המולדים הנפוצים ביותר בילוד 1,2, המשפיעות על כ-0.8%-1.7% מהיילודים וגורמות לתמותה ותחלואה משמעותית בילוד3. אטיולוגיה גנטית מסומנת בחוזקה עם CHDs 4,5. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית שימשו באופן נרחב כדי להבין את המורכבות של CHDs ואת המנגנונים הגורמים להם עקב עכברים בעלי לבבות בעלי ארבעה חדרים ורצפי DNA התפתחותיים לבביים דומים בעכברים ובעוברים אנושיים6. זיהוי הפנוטיפ של מוטציות העכבר הוא הצעד הראשון הבסיסי באפיון תפקודו של גן היעד. מודלים עכבריים המבטאים השפעות מינון גנים, שבהם מוטציה גנטית אחת יכולה לגרום לספקטרום של פגמים לבביים המחקים CHDs אנושיים, חשובים להבנת המורכבות של CHDs והמנגנונים הגורמים להם.
מאמר זה מתאר צינור לאפיון פנוטיפים לבביים במודלים של עכברים. השיטות המיושמות משתמשות באקו לב עוברי 7, ואחריו נקרופסי והיסטופתולוגיה ECM7,8, שיכולים להציג את האנטומיה המפורטת של התפתחות פנוטיפים לבביים. אקו לב עוברי הוא שיטה לא פולשנית המאפשרת הדמיה ישירה של עוברים מרובים ברזולוציית הדמיה סבירה. בנוסף, אקו לב עוברי מספק קביעה מהירה של המספר הכולל של עוברים בהמלטה, שלבי התפתחותם, ואת הכיוון והמיקום היחסי בקרן הרחם. באמצעות זרימת דופלר/צבע ספקטרלית, ניתן לזהות עוברים חריגים על סמך המבנה, ההפרעה ההמודינמית, הגבלת הגדילה או התפתחות ההידרופים. מכיוון שמחקר אקו לב עוברי הוא טכניקה לא פולשנית, ניתן להשתמש בו כדי לסרוק מספר ימים ולצפות בשינויים בהמודינמיקה או במורפולוגיה של הלב. השגת הדמיה איכותית של אקו לב עוברי דורשת תרגול ומיומנות, שכן מומי לב ספציפיים עלולים להחמיץ בשל חוסר ניסיון וידע. בגלל זה, ניתוח סופי יותר של מורפולוגיה הלב ניתן להשיג באמצעות שילוב של נקרופסי היסטופתולוגיה ECM. נקרופסי מספק הדמיה ישירה של מבנה הקשת, היחסים היחסיים של אבי העורקים ועורק הריאה, גודל החדרים והאטריה, מיקום הלב ביחס לחזה והמבנים הברונכופולמונריים. עם זאת, תכונות פנים כגון שסתומי הלב ועובי הדופן עשויים להיות קשים להערכה באמצעות נקרופסי בלבד. לכן, היסטופתולוגיה ECM מומלץ לאבחנה חד משמעית. היסטופתולוגיה ECM היא טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת שחזור דו-ממדי ותלת-ממדי של מחסנית התמונות9. תמונות אלה מתקבלות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית אפיסקופית סדרתית של דגימה משובצת פרפין כפי שהיא חתך דק במרווח קבוע על ידי מיקרוטום אוטומטי. שלא כמו היסטולוגיה קלאסית, תמונות נלכדות כמקטע לפני שהוא נחתך מהבלוק כך שכל התמונות נלכדות באותה מסגרת התייחסות. מסיבה זו, מחסנית התמונות הדו-ממדית המיוצרת על ידי היסטופתולוגיה ECM עשויה להיות משוחזרת בקלות ובאמינות בשלושה ממדים. הדבר נעשה באמצעות מציג DICOM, המאפשר הדמיה תלת ממדית של התמונות בשלושת המישורים האנטומיים: קורונלי, קשת ורוחבי. משחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה אלה, ניתן לבצע אבחנה לבבית סופית. היישום של שלוש שיטות הדמיה שונות אלה, בנפרד או בשילוב, יכול לספק אפיון מדויק של מומי לב מבניים בעוברי עכברים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השימוש בעכברים למחקרים אלה הכרחי מכיוון שלעכברים יש לבבות בעלי ארבעה חדרים שיכולים לחקות CHD אנושיים. עכברים קיבלו טיפול וטרינרי ושוכנו במתקן לטיפול בבעלי חיים של האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC) של המוסד. פרוטוקולים קפדניים נשמרו כדי למזער את אי הנוחות, הלחץ, הכאב והפציעה של העכברים. עכברים הומתו באמצעות גזCO2 , המקובל על מכרסמים קטנים על פי הנחיות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית בנושא המתת חסד. המחקרים על עכברים בכתב יד זה בוצעו עם פרוטוקול IACUC מאושר באוניברסיטת פיטסבורג.
1. אקו לב עוברי
הערה: אקו לב הוא כלי רב עוצמה לזיהוי מום קרדיווסקולרי ומומים חוץ-לבביים בעכברים. בשל גודלם הקטן של עוברי העכבר (כ 1-2 מ"מ באמצע ההריון, 3.5 מ"מ בלידה), ציוד אקו לב בתדר גבוה במיוחד עם ביומיקרוסקופיה אולטרסאונד (UBM) נדרש. UBM מספק בדיקות שונות בתדר גבוה (30-50 MHz) עם חלון הדמיה קטן (15 מ"מ x 14 מ"מ) המספק את הרזולוציה (30 מיקרומטר אקסיאלי x 68 מיקרומטר לרוחב) כדי לדמיין עובר עכבר אחד בכל פעם. מתמר 40 MHz מספק תמונות ברזולוציה גבוהה לזיהוי פנוטיפים קרדיווסקולריים7.
- הפעל את מכשיר האקו לב ובחר את התוכנית קרדיולוגיה.
הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול הבא עבור כל רקע עכבר מהיום העוברי (E) 14.5 עד 19.5. - מרדימים את העכבר הרצוי בתא אינדוקציה הרדמה. יש להשרות הרדמה באמצעות ריכוז של 4% איזופלורן וחמצן רפואי בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה ולהפחית אותו ל-2%-3% לצורך תחזוקה.
- הנח את העכבר על פלטפורמת ההדמיה במהירות. פלטפורמת ההדמיה כוללת פלדה מחוממת כדי לשמור על חום העכבר במהלך ההליך. שים את הפה והאף של העכבר לתוך חרוט האף הרדמה. אבטח את הגפיים עם סרט כדי למנוע תנועה. נטרו את הדופק כדי לוודא שהוא נשאר בין 400-450 פעימות לדקה.
- עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות בדיקת מדחום רקטלי וודא שהיא נחה ב 37 ° C ± 0.5 ° C. לפקח על הנשימה כדי למנוע היפוקסיה. שמור על כוח עדין על הבדיקה כדי למנוע נזק.
הערה: ניתן להציב מנורת חום מעל העכבר כדי למנוע היפותרמיה מתחת וכדי להתאושש מהרדמה. משחה אופתלמית פטרולטום יכולה לשמש כחומר סיכה כדי למנוע עיניים יבשות. - הסר את הפרווה מבית החזה והבטן באמצעות קרם depilatory. יש למרוח את הקרם ולהמתין 3 דקות לפני ההסרה. נקו את האזור עם 70% אתנול. אתנול עובד טוב יותר ממים כחומר סיכה לגילוח.
- יש לחמם את ג'ל האולטרסאונד לטמפרטורת גוף רגילה. מרחו את ג'ל האולטרסאונד בנדיבות והניחו את המתמר על הבטן כדי לכוון אותו במישור אופקי ולזהות את שלפוחית השתן על המסך. לאחר זיהוי שלפוחית השתן, יש לסרוק גולגולת משלפוחית השתן ולחפש את העובר. מדדו את אורך הכתר עד העכוז כדי לקבוע את גילההיריון 10 (איור 1 וטבלה 1).
הערה: שנו את מיקומי המתמרים כדי להמחיש מישורים שונים, כולל מישורי הדימות הרוחביים בעלי ארבעת החדרים, הקשת ומישורי ההדמיה הקדמית/קורונלית7 (איור 1). - השתמש בצבע דופלר כדי לנתח את זרימת הדם מהלב.
- החזירו את העכבר לכלוב אם העוברים לא הגיעו לשלב המיועד. אחרת, להכין את העכבר לקציר.
הערה: ודא שהעכבר כבר ער ומתאושש היטב מההרדמה לפני החזרתו לכלוב. - כבו איזופלורן וחמצן, נקו את אזור העבודה וכבו את המכונה.
הערה: חשוב להסיר את הג'ל מהמתמר.
2. נקרופסי
הערה: ברגע שיש חשד לפנוטיפים לבביים חריגים באמצעות אקוקרדיוגרפיה עוברית, העוברים נאספים ומקובעים באמצעות טבילה של כל הגוף בתמיסה המקבעת: 10% פורמלין פוספט חוצץ או 4% פרפורמלדהיד (PFA). בדוק את המורפולוגיה החיצונית והפנימית של הדגימה, וחפש חריגות אנטומיות מקרוסקופיות או מומים מקרוסקופיים.
- הכן את העכבר.
- אם העכבר הוא מבוגר, להרדים את העכבר באמצעות פרוטוקול CO2 סטנדרטי. השתמש במלקחיים או מספריים לנתח כדי לבצע חתכים (כ -3 ס"מ) בבית החזה והבטן לרוחב כדי לאפשר חדירה של הקיבוע לתוך האיברים הפנימיים.
הערה: הדגימה צריכה להיות קבועה לפחות 24 שעות לפני נקרופסי אם העובר הוא מעל E14.5.
- אם העכבר הוא מבוגר, להרדים את העכבר באמצעות פרוטוקול CO2 סטנדרטי. השתמש במלקחיים או מספריים לנתח כדי לבצע חתכים (כ -3 ס"מ) בבית החזה והבטן לרוחב כדי לאפשר חדירה של הקיבוע לתוך האיברים הפנימיים.
- לנתח את החלק החיצוני של הגוף.
- הגדר את התוכנה לשמירת התמונות עם שם, כולל זיהוי הדגימה, הגדלת המיקרוסקופ ותוכן התמונה.
הערה: הגדלה של פי 1.0 עד פי 3.2 צריכה להתאים להדמיה של רוב המבנים בעכברי E14.5 ומעלה. - הניחו את העכבר על הצלחת מתחת לעדשת המיקרוסקופ. מלא את הצלחת במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי לכסות לחלוטין את הדגימה כדי למנוע התייבשות והשתקפות בתמונות. כוונן את ההגדלה כך שהמסך יכלול את כל העובר, ולאחר מכן צלם תמונה של הצד השמאלי והימני של העובר.
הערה: תחתית הצלחת צריכה להיות מצופה בפרפין, סיליקון או מצע אחר כזה כדי להקל על ההצמדה. - נעצו את הדגימה בגרונו, כשפניו כלפי מעלה, וצלמו תמונה נוספת.
הערה: כוון את הסיכה מעט כלפי מעלה כדי להבטיח שלא ינוקבו מבנים חשובים של חלל בית החזה.
- הגדר את התוכנה לשמירת התמונות עם שם, כולל זיהוי הדגימה, הגדלת המיקרוסקופ ותוכן התמונה.
- לנתח את החזה.
- תוך כדי הרמת העור באמצע הצוואר עם מלקחיים, חותכים את העור לכיוון שני בתי השחי עם המספריים לפני חיתוך העור לאורך הציר החציוני לכיוון הזנב. לאחר מכן, לחתוך את העור מן הטבור אל הרגליים. הצמידו את הדגימה דרך פרקי הידיים והקרסוליים.
הערה: יש להקפיד לחתוך רק את העור. מומלץ להחזיק את להבי המספריים אופקית או בזווית כלפי מעלה. - כדי לנתק את רקמת החיבור, הרימו את העור עם זוג מלקחיים אחד תוך החזקת הרקמה הבסיסית במקומה עם הזוג השני. נעצו את הדגימה דרך העור כדי לעזור לחשוף את החזה והבטן (איור 2).
הערה: מתיחה רבה מדי בזמן הצמדה, חיתוך או גירוד עלולה לגרום נזק לרקמות. - צלם תמונה של השרירים החשופים, ולאחר מכן לגרד בעדינות את השרירים כדי לחשוף את הצלעות.
- צלמו את הצלעות החשופות. מפרידים את הצלעות מהסרעפת וחותכים את הצלעות משני הצדדים ככל האפשר על הציר הצידי לכיוון הצוואר.
- לחשוף את הלב על ידי הסרת צלעות לחתוך. צלם תמונה של הלב.
- הוציאו את בלוטת התימוס על-ידי קילוף עם זוג מלקחיים אחד. השתמשו בזוג המלקחיים השני כדי לייצב את בסיס בלוטת התימוס כדי למנוע קריעת כלי הדם שמתחתיו. צלמו את הלב ואת הכלים הגדולים.
הערה: שימוש בפינים כדי למתוח מבנים סמוכים עשוי לסייע בקבלת תצוגות הדמיה טובות יותר. בנוסף, צלמו תמונות נפרדות המתמקדות בעורקים הגדולים, בלב ובמבנים מעניינים אחרים מכיוון שהם עשויים שלא להיות בפוקוס יחד.
- תוך כדי הרמת העור באמצע הצוואר עם מלקחיים, חותכים את העור לכיוון שני בתי השחי עם המספריים לפני חיתוך העור לאורך הציר החציוני לכיוון הזנב. לאחר מכן, לחתוך את העור מן הטבור אל הרגליים. הצמידו את הדגימה דרך פרקי הידיים והקרסוליים.
- לנתח את הבטן.
- משוך את הסרעפת כדי להסיר אותה ולחשוף את הכבד. צלמו תמונה.
- הצמידו לאחור את הכבד כדי לחשוף את הקיבה והלבלב. צלמו תמונה.
- חותכים את הוושט. הסר את המעי הגס ואת המעיים על ידי משיכתם החוצה עם מלקחיים. לחתוך ממש מעל הכבד ולהסיר אותו כדי לחשוף את הכליות ואת בלוטות יותרת הכליה. צלמו תמונה.
הערה: יש לשמור את האיברים שהוסרו בתמיסה המקבעת.
- בודד את בית החזה עבור ניתוח ECM.
- חותכים את בית החזה התחתון לאורך קו ישר בין הכבד לריאות. חותכים את הראש גבוה מספיק כדי לא לחתוך את ההסתעפויות של עורקי התרדמה.
- הסירו בעדינות את הצלעות הצידיות תוך שמירה על הצלעות הגביות ועמוד השדרה. מקלפים ומגרדים את השומן הגבי.
- נתקו את בית החזה משאר הגוף והניחו אותו בתמיסת פורמלין פוספט חוצצת 10%.
3. הטבעה
- דקקו את הקיבוע לבקבוק פסולת מסוכנת מתאים. שטפו את הדגימות עם 1x PBS במשך 15 דקות שלוש פעמים.
- השתמש בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול, וקסילן כדי לייבש את הדגימות. משך כל השלבים הבאים תלוי בשלב העוברים. עיין בטבלה 2 לקבלת פרטים.
הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת שינוי פתרונות כדי למנוע נזק לדגימות. הפרמטרים האופטימליים לעיבוד מדגם ניתנים להתאמה אמפירית. קסילן ימיס פלסטיק מסוים; יש להשתמש בכלי זכוכית ומיכלים. - החלף קסילן עם פרפין למשך הזמן הרצוי. השאירו את הבקבוקים באינקובטור של 65°C למשך הזמן המתאים (טבלה 2).
- השתמש פרפין טרי להטביע את הדגימות במיקום הרצוי.
הערה: מומלץ לכוון את הדגימה לאמצע גוש הפרפין, כאשר הצד הגבי שלה פונה למעלה והצד האחורי פונה לקדמת הבלוק. בעת כיוון הדגימה, זכור כי הדגימה מוטבעת כאשר הבלוק פונה הפוך.
4. מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM)
הערה: לאחר הטבעה מתאימה, עוברים עוברים איסוף תמונות סדרתי באמצעות ECM לצורך ניתוח היסטופתולוגי. ניתן לשחזר שקופיות בודדות מהמיקרוטום למחקרים נוספים.
- מוציאים את גוש הפרפין מהמקפיא בטמפרטורה של -20°C ומסירים את תבניות המתכת.
- השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את השעווה בקצוות ובגב הקלטת. חותכים את השעווה המקיפה את הדגימה עד שהיא עטופה בריבוע שעווה קטן המחובר לקלטת.
הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול בלהבים. - השתמש בידית המתכת כדי להדק את בלוק הפרפין לשלב החיתוך של המיקרוטום. בחר את פונקציית MAN (ידנית) במצב הפעלה, הרם את פני השטח של הפרפין קרוב ללהב והפעל כמה שקופיות כדי לוודא שהלהב בא במגע עם בלוק הפרפין.
- פתח את יישום LAS AF ובחר MatrixScreener. בחר מטריצה רגילה יחידה וטען את התבנית המתאימה שנשמרה בעבר. לחץ על כפתור Quick LUT כדי לעבור לאומברה לבנה וכתומה.
- בחר Set Up Jobs וגרור את מדפסת הלייזר הגלויה של 405 ננומטר למקסימום. התאם את הקצה השמאלי של גוש הספקטרום לקו 405 ננומטר וגרור את הקצה הימני לקו 800 ננומטר. סמן את האפשרות Pinhole והפעל את תצוגת Live .
- התאם את מיקום הקרנת הלייזר כדי למרכז את הדגימה על המסך וכוונן את ידית הזום ל~20x. כדי למטב את הרזולוציה, הגדר את הרווח ל- 1,250 V והגדל את האזור הכחול באמצעות ידית המיקוד; לאחר מכן, אפס את הרווח ל- 750 V בקירוב לצורך הדמיה.
הערה: ערכים ספציפיים עשויים להשתנות בהתאם למצב העובר. - העבר את שיטת החיתוך לאוטומטי, הגדר את העובי לסביבות 50 מיקרומטר, והפעל את השקפים. הפסיקו לחתוך כאשר הריאות ודרכי הנשימה גלויות.
- בחר עובי חיתוך בין 8-10 מיקרומטר ועצור את תצוגת Live . פתח את Microtome Communicator כדי להתחיל בהדמיה. ודא שתיקיית האחסון הזמני ריקה לפני איסוף תמונות.
- יש להפסיק לחתוך כאשר לא מדמיינים מבנה לב נוסף. סגור את היישום Microtome Communicator וייצא את הקובץ הזמני לסדרת תמונות אחת .tiff באמצעות תוכנת עיבוד התמונה לשחזורים תלת-ממדיים מאוחר יותר.
5. שחזור תלת מימדי (3D)
הערה: מטרת השחזור התלת-ממדי היא לעבד מחסנית תמונות דו-ממדית מהדמיית ECM לסרטוני תלת-ממד בכיווני העטרה, הקשת והרוחב ולהשתמש בסרטוני התלת-ממד לאבחון הפרעות מבניות ואנטומיות בדגימות.
- פתח את אוסף התמונות ECM בתוכנת עיבוד התמונה.
- גרור ושחרר את הקבצים לתוך תוכנת עיבוד התמונה. הפוך אופקית את תמונות ECM באמצעות בחירה באפשרות Image > Transform > Flip Horizontally בשורת התפריטים.
- שמור את התמונה ההפוכה וסגור את תוכנת עיבוד התמונה.
- ייבא את אוסף התמונות ECM בתוכנת התצוגה DICOM.
- גרור ושחרר את תמונות ECM הפוכות אופקית בתוכנת התצוגה DICOM. ודא שיש גבול כחול בהיר מסביב לרשימה לדוגמה, או שתמונות עשויות להתווסף לתיקיית דוגמאות קיימת.
- בחר את הקישורים או הקבצים שברצונך להעתיק למסד הנתונים כשהחלון הנפתח מופיע. דוגמה חדשה תופיע ברשימה לדוגמה בשם זהה לשם הקובץ שהועתק לתוכנת התצוגה DICOM.
- לחץ על הקובץ החדש שנוסף כדי לפתוח אותו.
- בצע שחזור תלת מימד.
- לאחר פתיחת הקובץ, לחץ על תפריט כלי שחזור 2D/ 3D מסרגל הכלים ובחר 3D MPR.
- עבור רזולוציית Pixel X ורזולוציית Pixel Y, הזן את רזולוציית התמונה על-ידי מתן הזום המשמש במהלך הדמיית ECM. עבור מרווח הפרוסה, הזן את עובי הפרוסה המשמש לחיתוך במהלך הדמיית ECM.
הערה: רזולוציית המצלמה משתנה בהתאם לזום המצלמה ועשויה להיות שונה ממצלמה למצלמה.
- השתמש בכלים השונים מהכרטיסייה כלים בצד שמאל כדי להתאים אוספי תמונות כרצונך.
- השתמש בכלי WW/WL כדי להתאים את רוחב החלון ואת רמת החלון. לחצו וגררו את הכלי בתמונה כלפי מעלה כדי להקטין את בהירות התמונה וכלפי מטה כדי להגדיל אותה. לחצו וגררו את הכלי בתמונה ימינה כדי להקטין את ניגודיות התמונה ושמאלה כדי להגדיל אותה.
הערה: הגדרות WW/WL האופטימליות עבור מבנה אחד עשויות להיות לא אופטימליות עבור מבנה אחר. מסיבה זו, מומלץ ליצור סרטונים נפרדים לצפייה במבנים שונים. - השתמשו בכלי פנורמה לגרירת התמונות למיקומים הרצויים. השתמשו בכלי זום להגדלה או כיווץ של התמונה כרצונכם, ובכלי סיבוב כדי לסובב את התמונה כרצונכם.
הערה: הגדלת תמונות עלולה לגרום לירידה באיכות התמונה. היזהר בעת סיבוב תמונות, שכן הדבר עלול לגרום לצירים להתהפך.
- השתמש בכלי WW/WL כדי להתאים את רוחב החלון ואת רמת החלון. לחצו וגררו את הכלי בתמונה כלפי מעלה כדי להקטין את בהירות התמונה וכלפי מטה כדי להגדיל אותה. לחצו וגררו את הכלי בתמונה ימינה כדי להקטין את ניגודיות התמונה ושמאלה כדי להגדיל אותה.
- לחצו וגררו את הציר הצבעוני של החלונית הראשונה. שימו לב כיצד סיבוב ציר זה משנה את הכיוון של שתי החלוניות האחרות. סובבו את צירי שלושת הלוחות עד ששלושת הלוחות ייצגו תצוגות קורונליות, קשתות ורוחביות של הדגימה.
הערה: בעת כיוון מחדש של הדגימות, שמור על כיוון קדמי/אחורי נכון. - צור סרטונים.
- לאחר שכל שלושת הלוחות ממוקמים, מכוונים ומובהרים כראוי, לחץ על החלונית המייצגת את תצוגת העטרה.
- לחץ על ייצוא סרטים בצד ימין של שורת התפריטים. לחץ על אצווה וגרור את המחוונים From ו - To כדי להקיף את כל אזור העניין. בתיבה ' מרווחי זמן', בחר באפשרות 'זהה לעובי '. שמור את הסרטון המציין את כיוון התצוגה.
- עיין בסרטון כדי לראות אם ניתן לזהות כראוי את מבני העניין. אם לא, השתמש בכלים (שלב 5.4) כדי להתאים מחדש את הסרטונים לפי הצורך ולשמור מחדש את הסרטון.
- חזור על שלב 5.6 עבור תצוגות רוחביות ותצוגות קשת. אבחן את הדגימות באמצעות סרטונים משוחזרים.
הערה: צפו בקפידה בסרטוני הווידיאו בכל כיוון כדי לבצע הערכה מלאה אם הדגימה מציגה הפרעות אנטומיות או פנוטיפים של מחלות (איור 3).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עוברי עכברים עם פגמים המודינמיים משמעותיים נמצאו קטלניים עובריים. ניתן לזהות מגוון רחב של CHDs באמצעות אקו לב עוברי בעל תפוקה גבוהה ולא פולשנית באמצעות תצוגות שונות (איור 1).
מומים מחיצתיים: ה- CHDs הנפוצים ביותר הם פגמים מחיצתיים כגון פגם מחיצה חדרית (VSD), פגם מחיצה אטריובנטריקולרי (AVSD), ופגם מחיצה פרוזדורי (ASD)1. ניתן להמחיש בקלות VSD או AVSD באמצעות תמונות דו-ממדיות ותמונות זרימת צבע. ניתן לזהות בקלות זרימת דם דרך הח...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עכברים מהונדסים גנטית שימשו להבנת הפתומנגנונים של מומי לב מולדים. הפרוטוקולים שאנו מספקים במחקר זה מנסים לייעל ולתקנן את תהליך הערכת מומי הלב של העובר. עם זאת, ישנם שלבים קריטיים שיש לציין במהלך הפרוטוקול. עוברי עכבר גדלים באופן משמעותי במהלך כל יום של הריון, ואת הזמן הנכון לקצור עכבר ניתן לקבוע על ידי ביצוע אקו לב עוברי במדויק. ניתן להשתמש באקו לב עוברי כדי לסנן את הפתולוגיה הקרדיווסקולרית של העובר. תמונה דו-ממדית מאפשרת זיהוי אנטומיה ותפקוד לב לא תקינים, בעזרת דופלר צבע לבדיקת זרימת הדם ואיתור תקשורת בין חדרי הלב או יצ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בכתב יד זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 מ"ל צינורות אפנדורף (או בקבוקון מועדף לאחסון רקמות) | SealRite | 1615-5599 | |
| תמיסת פורמלין פוספט 10% חוצץ | פישר כימיקל | SF100-4 | |
| 100% אתנול | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% פרפורמלדהיד (PFA) מקבע | ThermoScientific | 28908 | 4% ריכוז עבודה מוכן טרי ב-1x PBS ב-4 מעלות; C |
| 50 מ"ל צינורות | Falcon | 352070 | |
| 6– צלחת 12 באר או בקבוקון 20 מ"ל לאחסון עוברים | פלקון | 353046 | |
| מיקרוסקופ ניתוח | Leica | MDG36 | |
| סיכות חיתוך (דרגה A1 או A2) | FST | 26002-15 | |
| צלחת חיתוך | צלחת פטרי FB0875713 FST | עם בסיס פרפין | |
| תבניות הטבעה | Sakura | 4133 | |
| מספריים צרות במיוחד (10.5 ס"מ) | FST | 14088-10 | 1– 2 זוגות |
| יישום פיג'י/תמונה J | NIH | Fiji.sc | |
| קצה עדין (0.05 מ"מ x 0.01 מ"מ) מלקחיים לניתוח (11 ס"מ) | FST | 11252-00 | 2 זוגות |
| מלקחיים חמים | FST | 11252-00 | לכיוון עוברים |
| סמן תעשייתי לבלוקי שעווה | Sharpie | 2003898 | מעוצב לשימוש במעבדה |
| Jenoptik ProgRes C14plus מיקרוסקופ מצלמה | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro רכש תוכנה | Jenoptik | jenoptik.com | |
| זכוכית גדולה | פישר סיינטיפיק | S111053 | להמסת פרפין |
| Leica M165 FC מיקרוסקופ דו-עיני (אופטיקה זום 16.5:1) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD גרסה 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast הטמעת שעוות פרפין | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| זכוכית קטנה | Fisher Scientific | S111045 | |
| כף קטנה ומחוררת (14.5 ס"מ) | FST | 10370-17 | |
| מספריים ישרים Vannas (4– 8 מ"מ) | FST | 15018-10 | זוג |
| ביומיקרוסקופ אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד Vevo2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| קסילן | פישר כימיקל | UN1307 |
מקורות
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
