פרוטוקול זה מתאר גישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות להערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים בתעשיית החלב. גישה זו עשויה לשמש גם לבדיקת יעילותן של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוכחותם של ביופילמים בתעשיית החלב מעוררת דאגה רבה, שכן הם עלולים להוביל לייצור מוצרי חלב לא בטוחים ומשתנים בשל עמידותם הגבוהה לרוב נהלי הניקיון במקום (CIP) המשמשים לעתים קרובות במפעלי עיבוד. לכן, הכרחי לפתח אסטרטגיות חדשות לבקרת ביופילם עבור תעשיית החלב. פרוטוקול זה נועד להעריך את יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות (חומצות פראצטיות, פרפרופיוניות ופרלקטיות וחומר חיטוי מסחרי על בסיס חומצה פראצטית) להשמדת ביופילמים חלביים באמצעות שילוב של שיטות סטטיות ודינמיות. כל חומרי החיטוי נבדקו על החיידקים החזקים ביותר מייצרי ביופילם בביופילם יחיד או מעורב באמצעות בדיקת ריכוז מיגור הביופילם המינימלי (MBEC), שיטת סינון סטטית בעלת תפוקה גבוהה. זמן מגע של 5 דקות עם חומרי החיטוי בריכוזים המומלצים הצליח לחסל הן את הביופילמים הבודדים והן את הביופילמים המעורבים. מחקרים נמשכים כעת כדי לאשר תצפיות אלה באמצעות כור ביופילם של המרכז לבקרת מחלות (CDC), שיטה דינמית לחיקוי תנאים באתרם . סוג זה של ביוריאקטור מאפשר שימוש במשטח נירוסטה, המהווה את רוב הציוד והמשטחים התעשייתיים. נראה כי התוצאות הראשוניות מהכור מאשרות את יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות כנגד ביופילמים. הגישה המשולבת המתוארת במחקר זה עשויה לשמש לפיתוח ובדיקה של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים ולחיסול מיקרואורגניזמים.
מבוא
תעשיית החלב היא מגזר תעשייתי מרכזי ברחבי העולם, כולל בקנדה, שם יש יותר מ -10,500 רפתות המייצרות כמעט 90 מיליון hL חלב מדי שנה1. למרות דרישות ההיגיינה המחמירות המוטלות בתעשיית החלב, כולל במפעלי עיבוד, החלב מהווה מדיום תרבית נהדר למיקרואורגניזמים, ולכן מוצרי חלב עשויים להכיל מיקרואורגניזמים, כולל קלקול או מיקרואורגניזמים פתוגניים. פתוגנים אלה יכולים לגרום למחלות שונות; לדוגמה, Salmonella sp. ו Listeria monocytogenes יכול לגרום גסטרואנטריטיס ודלקת קרום המוח, בהתאמה2. מיקרואורגניזמים מקולקלים יכולים להשפיע על האיכות והתכונות האורגנולפטיות, של מוצרי חלב על ידי ייצור גזים, אנזימים חוץ-תאיים או חומצות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
העבודה הכלולה במאמר זה דורשת מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 ואושרה בעבר (פרויקט מספר 119689) על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת לאוואל.
הערה: תרשים הזרימה באיור 1 מייצג סיכום של מתודולוגיה המשלבת גישות סטטיות ודינמיות ששימשה להערכת היעילות של חומצות פרוקסי אורגניות להשמדת ביופילמים.
1. הכנת חומרים
- מבודדים מיקרוביאליים
- הפעל את ארון הבטיחות הביולוגי (BSC) 15 דקות לפני השימוש ונקה אותו עם תמיסת אלכוהול של 70% (v/v).
- ברגע שה-BSC סטרילי, הניחו בקבוקון של המבודד המיקרוביאלי לבדיקה (Pseudomonas azotoformans או Brevundi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתוח SEM מראה נוכחות של ביופילמים המיוצרים על-ידי P. azotoformans PFl1A על יתדות המיקרו-לוחות של הביופילם (איור 2A). ניתן להבחין במבנה ביופילם תלת מימדי. P. azotoformans PFl1A זוהה בעבר כיצרן ביופילם חזק (A570 > 1.5) באמצעות לוחות מיקרוטיטר96 בארות 12.
נוסף על כך, הביופילם P. azotoformans PFl1A שנוצר על שקופית מפלדת אל-חלד באמצעות הביוריאקטור נראה צפוף מאוד והציג את המאפיינים המורפולוגיים של ביופילם.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בדיקת MBEC (בדיקת מיקרו-צלחות ביופילם) הייתה השיטה הראשונה שהוכרה כבדיקת ביעור ביופילם סטנדרטית על ידי ASTM17. המחקר שלנו ואחרים הראו כי ישנם שני שלבים קריטיים בעת שימוש בבדיקה זו: שלב הסוניקציה (זמן ועוצמה) וזמן הטיפול בחומר חיטוי18. סטיוארט ופרקר הציעו גם פרמטרים אחרים שיכולים להשפיע על תוצאות הבדיקה, כגון מיני מיקרוביאליים, גיל הביופילם, יחס שטח פנים / נפח וכו '. 19. לבסוף, חשוב לציין כי היווצרות ביופילמים סביב היתדות על מכסי המיקרו-צלחות עשויה לה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc ומועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) (RDCPJ516460-17). אנו מודים לתרזה פניקוני על הביקורת על כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 ומיקרו; m מסננים | קורנינג | 09-754-28 | קוטר: 50 מ"מ, PTFE- ממברנה |
| 316 קופון דיסק נירוסטה | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 קופון שקופיות נירוסטה | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| צלחת 96 מיקרוטיטר | קורנינג | 07-200-89 | תרבית תאים מטופלת, מיקרופלטה תחתונה שטוחה |
| חומצה אצטית | סיגמא אולדריץ' | 27225 | חנות ב RT |
| דודי אלומיניום אלקטרונים | מיקרוסקופיה מדע | 75830-10 | 32x5 מ"מ |
| גלוטארלדהיד מימי EM כיתה 25% | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 16220 | חנות ב -20 & deg; C |
| AB204-S/FACT איזון אנליטי | מטלר טולדו | AB204-S | |
| (0.45 ומיקרו; m) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | חומר חיטוי מסחרי מבוסס חומצה פראצטית, אחסן ב- RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC כור ביופילם | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | ביו-ריאקטור |
| Cerium (IV) סולפט | Thermo Scientific | חנות 35650-K2 | |
| במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי RT LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley מרק מנטרל | Millipore | D3435-500G | חנות ב-4 מעלות; C |
| EMS950x + 350s זהב מתיז | מיקרוסקופיה אלקטרונית | ||
| שרף אפוקסי | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 14121 | עם אלכוהול אתילי BDMA |
| 95%, USP | Greenfield חנות P016EA95 | גלובלית בפתרון מחוון RT | |
| Ferroin | סיגמא אולדריץ' | 318922-100ML | חנות ב |
| RT כובע מילוי/אוורור | קול פארמר | RK-06258-00 | |
| ערכת כדאיות ביופילם FilmTracer LIVE/DEAD ערכת כדאיות | Invitrogen | L10316 | (SYTO 9: כתם פלואורסצנטי ירוק, פרופידיום יודיד: כתם פלואורסצנטי אדום), יש לאחסן בטמפרטורה של - 20 מעלות; |
| C זכוכית שבירת זרימה | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| זהב עם צבע כסף | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| סט צלחות חימום | Biosurface Technologies Corporation | 110V מברג משושה צלחת | |
| ערבוב Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | ||
| מי חמצן | סיגמא | חנות 216763 | ב-4 מעלות; C |
| לולאות חיסון | VWR | 12000-812 | סטריליות, 10 ומיקרו; l |
| Laboratoire MAT | LU-0200 | חומצה לקטית | ב-RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 עם משאבה פריסטלטית EASY-LOAD II ו-77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (ריכוז מיגור ביופילם מינימלי) בדיקת חיסון ביופילם עם בסיס 96 בארות | Innovotech | 19111 | צלחת מיקרוטיטר ביופילם |
| בסיס אגר אוקספורד | Thermo Scientific | חנות OXCM0856B | בטמפרטורה של 4 מעלות; |
| מחזיק קופון C פלסטיק | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| מוט מחזיק שקופיות מפלסטיק | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| אשלגן יודיד | פישר כימיקל | P410-500 | חנות ב RT |
| מברג מחורץ דיוק (1.5 מ"מ x 40 מ"מ) | Wiha | 26015 | |
| מעבדת חומצה פרופיונית | חנות MAT | PF-0221 | ב-RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II איזון טעינה עליונה בסיסי חיוני | קול פרמר | UZ-11976-3 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים סורק JSM-6360LV דגם | JEOL | JSM-6360LV | SEM וממשק בקרת משתמש |
| צינור מכסה בורג, 15 מ"ל | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 מ"מ, חומר: PP, בסיס חרוטי, שקוף, HD-PE |
| צינור מכסה בורג, 50 מ"ל | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 מ"מ, חומר: PP, בסיס חרוטי, שקוף, HD-PE |
| נתרן קקודילאט טריהידרט | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | חנות 12300 | ב-20 מעלות; C |
| נתרן תיוסולפט | Thermo Scientific | AC124270010 | חנות באמבט RT |
| סוניקציה | פישר | 15-336-122 | 5,7 ליטר |
| תמיסת עמילן | חנות Anachemia | AC8615 | בחנות RT |
| חומצה גופרתית | סיגמא אולדריץ' | 258105-500 מ"ל | בחנות RT |
| סויה טריפטית BD | Bacto | DF0369-17-6 | בחנות RT |
| מרק סויה טריפטי | BD Bacto | DF0370-17-3 | חנות ב RT |
| Tubing Masterflex L / S 16 25'Cole | Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L / S 18 25'Cole | Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 צינורות סיליקון | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 אינץ' x 7/16 אינץ'. |
| וורטקס | קול פארמר | UZ-04724-00 | |
| אמבט מים | VWR | 89202-970 | |
| תוכנת Zen | Zeiss |
מקורות
- Canada's dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre. , Available from: https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance (2017).
- Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
