כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) חולקת מאפיינים אימונולוגיים וקליניים דומים עם טרשת נפוצה (MS), ולכן נעשה בה שימוש נרחב כמודל לזיהוי מטרות תרופות חדשות לטיפול טוב יותר בחולים. טרשת נפוצה מאופיינת במספר מסלולי מחלה שונים: טרשת נפוצה חוזרת (RRMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית ראשונית (PPMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית משנית (SPMS), וצורה נדירה של טרשת נפוצה מתקדמת (PRMS). למרות שמודלים של בעלי חיים אינם מחקים במדויק את כל הפנוטיפים המנוגדים הללו של מחלות אנושיות, ישנם מודלים של EAE המשקפים חלק מהביטויים הקליניים השונים של טרשת נפוצה. לדוגמה, EAE המושרה על-ידי מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) בעכברי C57BL/6J מחקה PPMS אנושי, בעוד ש-EAE המושרה על-ידי חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP) בעכברי SJL/J דומה ל-RRMS. נוגדי חמצון עצמיים אחרים, כגון חלבון בסיסי מיאלין (MBP), ומספר זנים שונים של עכברים משמשים גם הם לחקר EAE. כדי לגרום למחלה במודלים אלה של חיסון נגד אנטיגנים עצמיים, מכינים ומזריקים תחליב מים בשמן באופן תת-עורי. רוב המודלים של EAE דורשים גם הזרקה של רעלן שעלת כדי שהמחלה תתפתח. להשראת EAE עקבית וניתנת לשחזור, יש צורך בפרוטוקול מפורט להכנת הריאגנטים לייצור תחליבי אנטיגן/אדג'ובנטיים. השיטה המתוארת כאן מנצלת שיטה סטנדרטית ליצירת תחליבי מים בשמן. הוא פשוט ומהיר ומשתמש בהומוגנייזר מטלטל במקום במזרקים להכנת תחליבים מבוקרי איכות.
מבוא
התמוטטות של סובלנות חיסונית יכולה לגרום ליצירת הפרעות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה (MS). ההערכה היא כי 2.8 מיליון אנשים חיים עם טרשת נפוצה ברחבי העולם1. למרות שהסיבה המדויקת לטרשת נפוצה עדיין אינה ידועה במידה רבה, חוסר ויסות של תאי T ו- B תגובתיים אוטומטיים, כמו גם פגמים בתפקוד Treg, ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של המחלה 2,3.
מודלים חייתיים של מחלות אוטואימוניות הם כלים חיוניים לחקר שיטות טיפוליות פוטנציאליות. המודל הניסיוני של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית (EAE) נמצא בשימוש כבר כמעט מאה שנה על ידי חוקרים המתעניינים בטרשת נפוצה4. בניסו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי נוהלי המועצה השוודית למחקר בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים, לונד-מאלמו, שבדיה (מספר היתר: M126-16).
הערה: זרימה סכמטית של השיטה מתוארת באיור 1.
1. הכנת חומרים
הערה: מכינים את כל הריאגנטים באופן אספטי במכסה מנוע סטרילי, ומכניסים ומאחסנים בטמפרטורה שצוינה. ניתן לאחסן את הריאגנטים עד שנתיים מבלי לאבד את השפעתם.
- יש להכין CFA המכיל 20 מ"ג/מ"ל מיקובקטריום שחפת כמתואר להלן.
- הוסיפו 100 מ"ג של שחפת M. מיובשת בהקפאה H37RA (ראו טבלת חומרים) וחמישה חרוזי פלדה בקוטר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המהיר, הפשוט והסטנדרטי להכנת אמולסיות CFA/MOG מתואר באיור 1. שיטה זו תוארה לאחרונה במקום אחר6. ניתן להכין תחליבי CFA/MOG גם בשיטות אחרות, כגון שיטת המזרק המסורתית או על ידי מערבולת. שיטות אלה הושוו כאן על ידי הערכת איכות התחליבים. כל השיטות הפיקו תחליבי מים בשמן; ההומוגניות והאיכות של תחליבים אלה הוערכו על ידי הוספת טיפה קטנה על מגלשת זכוכית ואחריה תצפית תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. אמולסיות שנוצרו בשיטת ההומוגניזציה הרועדת הציגו חלקיקים אפורים/לבנים בצורת ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תחליבי מים בשמן, כגון אדג'ובנט של אנטיגן/פרוינד, שימשו במשך יותר מחצי מאה להשראת EAE17. אין כיום שיטה סטנדרטית להכנת תחליבי אנטיגן שאינם תלויים בהשפעת האדם. ערבוב ידני באמצעות מזרקים הוא סטנדרטי עבור רוב המעבדות, אולם שיטה זו היא זמן רב, לעתים קרובות גורם לאובדן מוגזם של חומר, ואת האיכות משתנה בהתאם המדען מכין אותו.
השיטה המוצגת בכתב יד זה משתמשת במכונת הומוגניזציה סטנדרטית כדי להכין את תחליבי האנטיגן/CFA. בנוסף, כל ריאגנטים המשמשים כאן ניתן aliquoted ומאוחסן במשך תקופה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
BTB Emulsions AB הגישה בקשת פטנט לשימוש במכשיר ושיטה להכנת תחליבים לחיסון בעלי חיים ובני אדם (מספר בקשת פטנט אירופאית: EP3836884A1). BTB הוא המנכ"ל והמייסד של החברה, ובעל מניות באמולסיות BTB. ברטין-אינסטרומנטס מפיצה את ערכות האמולסיה המשמשות בפרסום זה ברחבי העולם.
תודות
המחבר מבקש להודות ליחידות הדיור לבעלי חיים באוניברסיטת לונד, קמילה ביורקלוב ואגניישקה צ'ופק, על תמיכתן, ולריצ'רד ויליאמס, מכון קנדי לראומטולוגיה, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה, על ביקורת בונה ותמיכה לשונית בהפקת כתב יד זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק הזרקה 1 מ"ל | ב. בראון | 9166017V | |
| מזרק הזרקה 1 מ"ל | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| צינורות ריקים 7 מ"ל עם כובעים | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | צינור 7 מ"ל |
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה סטרילי | פישר סיינטיפיק | 10788561 | 50 מ"ל שפופרת |
| Bordetella pertussis רעלן | סיגמא-אולדריץ' | P2980 | חנות ב-20 מעלות; C |
| Dispersant, שמן מינרלי קל | Sigma-Aldrich | M8410 | חנות |
| בערכת תחליב | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | מכיל צינור, מכסה ובוכנה |
| לא שלם של Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | חנות ב +4 & deg; C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | חנות ב-+4 מעלות; C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | מנתח גודל חלקיקים |
| Minilys-הומוגנייזר אישי | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | הומוגנייזר רועד |
| MOG 35-55 פפטיד | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | Pall Acrodisc מאושר על ידי ה-FDA |
| 0.2 μ m | פישר סיינטיפיק | 17124381 | מסנן סטרלי |
| PBS, Ca2+/Mg2+ חינם | תרמו פישר סיינטיפיק | 14190144 | PBS |
| פאזה-קונסטרסט מיקרוסקופ | אולימפוס | BX40-B | |
| חרוזי פלדה 3.2 מ"מ | פישר סיינטיפיק | NC0445832 | אוטוקלאב ואחסן בחנות RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | ב-RT |
מקורות
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
