Method Article

שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

DOI:

10.3791/64634

⸱

December 9th, 2022

1The Rausing Laboratory, Autoimmunity Section, Division of Neurosurgery, Department of Clinical Sciences, Lund University, 2Department of Autoimmunity, BTB Emulsions

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) חולקת מאפיינים אימונולוגיים וקליניים דומים עם טרשת נפוצה (MS), ולכן נעשה בה שימוש נרחב כמודל לזיהוי מטרות תרופות חדשות לטיפול טוב יותר בחולים. טרשת נפוצה מאופיינת במספר מסלולי מחלה שונים: טרשת נפוצה חוזרת (RRMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית ראשונית (PPMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית משנית (SPMS), וצורה נדירה של טרשת נפוצה מתקדמת (PRMS). למרות שמודלים של בעלי חיים אינם מחקים במדויק את כל הפנוטיפים המנוגדים הללו של מחלות אנושיות, ישנם מודלים של EAE המשקפים חלק מהביטויים הקליניים השונים של טרשת נפוצה. לדוגמה, EAE המושרה על-ידי מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) בעכברי C57BL/6J מחקה PPMS אנושי, בעוד ש-EAE המושרה על-ידי חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP) בעכברי SJL/J דומה ל-RRMS. נוגדי חמצון עצמיים אחרים, כגון חלבון בסיסי מיאלין (MBP), ומספר זנים שונים של עכברים משמשים גם הם לחקר EAE. כדי לגרום למחלה במודלים אלה של חיסון נגד אנטיגנים עצמיים, מכינים ומזריקים תחליב מים בשמן באופן תת-עורי. רוב המודלים של EAE דורשים גם הזרקה של רעלן שעלת כדי שהמחלה תתפתח. להשראת EAE עקבית וניתנת לשחזור, יש צורך בפרוטוקול מפורט להכנת הריאגנטים לייצור תחליבי אנטיגן/אדג'ובנטיים. השיטה המתוארת כאן מנצלת שיטה סטנדרטית ליצירת תחליבי מים בשמן. הוא פשוט ומהיר ומשתמש בהומוגנייזר מטלטל במקום במזרקים להכנת תחליבים מבוקרי איכות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התמוטטות של סובלנות חיסונית יכולה לגרום ליצירת הפרעות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה (MS). ההערכה היא כי 2.8 מיליון אנשים חיים עם טרשת נפוצה ברחבי העולם1. למרות שהסיבה המדויקת לטרשת נפוצה עדיין אינה ידועה במידה רבה, חוסר ויסות של תאי T ו- B תגובתיים אוטומטיים, כמו גם פגמים בתפקוד Treg, ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של המחלה 2,3.

מודלים חייתיים של מחלות אוטואימוניות הם כלים חיוניים לחקר שיטות טיפוליות פוטנציאליות. המודל הניסיוני של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית (EAE) נמצא בשימוש כבר כמעט מאה שנה על ידי חוקרים המתעניינים בטרשת נפוצה4. בניסויים מוקדמים, שכיחות המחלה הייתה נמוכה יחסית. הכנסת האדג'ובנט השלם של פרוינד (CFA), המכיל מיקובקטריום ורעלן שעלת, אפשרה השראה עקבית של EAE בעכברים4. והכי חשוב, יש צורך לערבב CFA עם אנטיגן ספציפי למערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי ליצור תחליב מים הומוגני בשמן לגרימת EAE. המודלים הנפוצים ביותר של EAE הזמינים כיום מבוססים על חיסון פעיל של עכברים עם פפטידים אנצפליטוגניים. הרקע הגנטי של העכברים ממלא תפקיד חשוב ברגישות למחלות, כאשר גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG35-55) וחלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP139-151) משמשים להשראת EAE בעכברי C57BL/6J ו-SJL, בהתאמה5. עם זאת, ניתן להשתמש גם בזני עכברים אחרים ובפפטידים שמקורם במערכת העצבים המרכזית.

האיכות של תחליב CFA/פפטיד היא גורם קריטי שקובע את חדירות המחלה בחיסון הפעיל EAE מודל6. יש להכין תחליב מים הומוגני בשמן על ידי ערבוב הפפטידים האנצפליטוגניים המומסים בחיץ מימי עם CFA, אחרת בעלי חיים לא יפתחו את המחלה. פרוטוקולים רבים פורסמו על הכנת תחליבי CFA/פפטידים. דוגמאות כוללות שימוש במערבולת7, סוניקציה8, מזרקים ומחבר T תלת-כיווני9, או מזרק אחד בלבד5. עם זאת, כל השיטות הללו קשות לסטנדרטיזציה ולעתים קרובות קשורות לפרוטוקולים ארוכים ומסובכים.

בהשוואה לכל השיטות הנ"ל, השיטה הפשוטה המתוארת כאן להכנת תחליב מציעה את היתרונות של היעדר הבדלים בין אדם לאדם והיותה מהירה יחסית. האמולסיה נוצרת על ידי הומוגנייזר שמטלטל את הריאגנטים במהירות, זמן וטמפרטורה מוגדרים, מה שמבטיח תוצאות מהירות ועקביות. בנוסף לגרימת מחלות במודל EAE, שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר מודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן (CIA) ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי אנטיגן (AIA)6. לכן, צפוי כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום באופן עקבי למחלות במודלים אחרים של בעלי חיים התלויים בתחליבי מים בשמן עם אנטיגנים עצמיים, כגון דלקת עצבים אוטואימונית ניסיונית (EAN)10, דלקת אוטואימונית ניסיונית של בלוטת התריס (EAT)11, אובאיטיס אוטואימונית (EAU)12, ומיאסטניה גרביס (MG)13. שיטה זו גם גורמת לתגובות חיסוניות כלליות כגון רגישות יתר מסוג מושהה (DTH) באופן עקבי6, ולכן יכולה לשמש להעברת חיסונים נגד סרטן ומלריה (ראו דיון).

לפיכך, פותחה שיטה מהירה (זמן הכנה כולל ~ 30 דקות), פשוטה (ניתן להכין את כל הריאגנטים מראש ולאחסן אותה), וסטנדרטית (התחליב מתבצע באמצעות הומוגנייזר מטלטל) ומוצגת כאן. תחליבי CFA/אנטיגן שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה גורמים באופן עקבי למחלות במודלים אוטואימוניים של בעלי חיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי נוהלי המועצה השוודית למחקר בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים, לונד-מאלמו, שבדיה (מספר היתר: M126-16).

הערה: זרימה סכמטית של השיטה מתוארת באיור 1.

1. הכנת חומרים

הערה: מכינים את כל הריאגנטים באופן אספטי במכסה מנוע סטרילי, ומכניסים ומאחסנים בטמפרטורה שצוינה. ניתן לאחסן את הריאגנטים עד שנתיים מבלי לאבד את השפעתם.

  1. יש להכין CFA המכיל 20 מ"ג/מ"ל מיקובקטריום שחפת כמתואר להלן.
    1. הוסיפו 100 מ"ג של שחפת M. מיובשת בהקפאה H37RA (ראו טבלת חומרים) וחמישה חרוזי פלדה בקוטר 3.2 מ"מ לצינור של 7 מ"ל (ראו טבלת חומרים). נערו את הצינור בהומוגנייזר (ראו טבלת חומרים) במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר (5,000 סל"ד).
    2. הוסיפו 5 מ"ל של אדג'ובנט (IFA) לא שלם של פרוינד לצינור ונערו שוב במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר. מעבירים את ה-slurry של שחפת M . הומוגנית ב-IFA (כיום נקראת CFA) לצינור טרי עם פיפטה, משאירים את החרוזים מאחור, ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. הוסיפו מים אולטרה-פוריים לאבקה המיובשת בהקפאה של פפטיד MOG35-55 (ראו טבלת חומרים) כדי לקבל ריכוז פפטידי סופי של 10 מ"ג/מ"ל. לעקר את התמיסה על ידי העברתה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. יש להכין 60 μL aliquots ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
    הערה: הפפטיד MOG35-55 המשמש לניסוי זה הוא של טוהר ImmunoGrade (~ 70%), הוא מפוצל TFA, מתמוסס בקלות במים, ומכיל אמיד מסוף C (-NH2) כדי להגביר את יציבות in vivo 14. אליקוטים פפטידיים מעולם לא הופשרו והוקפאו מחדש יותר מפעמיים, ואוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. הכינו 100 מ"ל של מאגר רעלני שעלת: המסו 2.9 גרם של NaCl ב-80 מ"ל של 1x Ca 2+/Mg 2+ PBS חופשי והוסיפו 100 μL של 10% טריטון X-100. התאם את עוצמת הקול ל-100 מ"ל באמצעות PBS ועקר את התמיסה על-ידי העברתה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר. מכינים 10 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. הכנת תחליבי CFA/פפטידים

  1. חישוב כמות התחליב הדרושה לחיסון. בפרוטוקול סטנדרטי זה, כל עכבר מקבל 50 מיקרוגרם של MOG35-55 פפטיד ו-300 מיקרוגרם של שחפת M. המפוזרת באדג'ובנט של פרוינד (CFA). ניתן לחשב את הכמות של כל מגיב (פפטיד MOG35-55 , PBS, CFA ו- IFA) הנדרשת להכנת התחליבים באמצעות קובץ משלים 1. 20% נוספים מכלל הריאגנטים, כדי לפצות על אובדן קטן של תחליב, נכלל בחישוב.
    הערה: ערכת האמולסיה המסחרית (ראה טבלת חומרים) ששימשה במחקר זה כוללת צינור, מכסה בורג ובוכנה בשקית מעוקרת. כל צינור של ערכת האמולסיה מכיל מקסימום של 9.6 מ"ל, מה שמאפשר להכין 8 x 1 מ"ל מזרקים המספיקים לחיסון 40 עכברים (או 80 עכברים אם משתמשים בתחליב 100 μL לכל חיה).
  2. הניחו את הצינור המכוסה בבורג (מתוך ערכת האמולסיה המסחרית) ואת הריאגנטים לשימוש על קרח.
  3. הוסף את רכיבי האמולסיה בסדר הבא בנפחים המחושבים בשלב 2.1: PBS, לאחר מכן את הפפטיד, לאחר מכן את M. שחפת ב- CFA, ולבסוף IFA.
  4. סגור את הצינור עם המכסה בחוזקה על ידי הידוק ושחרור אותו מספר פעמים. יש לנער את השפופרת במרץ במשך 5-10 שניות ביד כדי לערבב מראש את הריאגנטים.
  5. מניחים את הצינור בהומוגנייזר הרועד ומהדקים אותו באמצעות המוט. הגדר את המהירות להגדרה הגבוהה ביותר ואת הזמן ל-60 שניות. לאחר סיום הריצה, הניחו את הצינור על הקרח למשך 3 דקות. חזור על ההפעלה פעם או פעמיים נוספות עם אותן הגדרות.
  6. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 1 דקה כדי להסיר אוויר לכוד לדחוס את האמולסיה.
  7. הסר את המכסה מהצינור, הכנס את הבוכנה לתוך הצינור, ודחף אותו למטה לאט עד שהוא מגיע לחלק העליון של האמולסיה. הסר את סגירת ההצמדה בתחתית הצינור על ידי סיבובו.
  8. הסר את הבוכנה ממזרק הזרקה (1 מ"ל; ראה טבלת חומרים). מוסיפים מחט (רצוי 25-27 גרם) למזרק ההזרקה.
  9. חברו את הקצה האחורי של מזרק ההזרקה למנעול הייעודי בתחתית הצינור ונעלו אותו עם טוויסט קצר.
  10. העבר את האמולסיה מהצינור למזרק ההזרקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות. עצור כאשר האמולסיה מגיעה לסיום 0.15 מ"ל של מזרק ההזרקה.
  11. הפרד את מזרק ההזרקה מהצינור והכנס את הבוכנה בזהירות, תוך הקפדה על כך ששום אוויר לא ייכנס למזרק. דוחפים את הבוכנה עד שהתחליב יוצא מהמחט.
    הערה: בשלב זה, חלק מהתחליב יכול לשמש לבקרת איכות (ראה שלב 3).
  12. חזור על שלבים 2.8-2.11 עבור שאר האמולסיה הקיימת בצינור.
    הערה: כדי למזער את הבזבוז של תחליבי CFA/אנטיגן יקרים, יש להשתמש במזרקים של 1 מ"ל. ניתן להשתמש במזרקים אחרים המתאימים למנעול הייעודי בתחתית הצינור; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להכין נפח גדול יותר של תחליב. ניתן לאחסן את תחליב הפפטיד CFA/MOG35-55 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 15 שבועות מבלי לאבד את יכולת גרימת ה-EAE שלו.

3. בקרת איכות של אמולסיה

  1. בדיקת טיפה: הוסף טיפה קטנה של התחליב לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל מלא 20 מ"ל של מים קרים. סגור את הצינור ולחץ אותו ביד במשך כמה שניות. המראה של טיפות זעירות ומובהקות מאשר את היווצרותו של תחליב מים בשמן.
  2. בחן את האמולסיה באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה.
    1. כדי לנתח את הגודל של חלקיקי המים בשמן, הוסיפו טיפה זעירה (2-3 μL) של האמולסיה למגלשה במיקרוסקופ, מרחו אותה עם כיסוי מחליק, ואז דחפו חזק בתנועה מעגלית כדי לשטח את התחליב.
    2. בחנו את התחליב המרוח תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (ראו טבלת חומרים) בהגדלה של פי 400 והתמקדו בשדה עם חד-שכבתי של התחליב. ודאו שחלקיקים אפורים/לבנים קטנים ואחידים נראים לעין (איור 2A).
  3. נתח את גודל חלקיקי האמולסיה באמצעות עקיפת לייזר.
    הערה: עקיפת לייזר מודדת התפלגויות גודל חלקיקים באמצעות קרן לייזר. זהו מבחן בקרת האיכות האולטימטיבי לתחליבים. תוצאה מייצגת של התפלגות גודל החלקיקים בשיטה המתוארת כאן מוצגת באיור 2B (לתיאור מפורט, ראו Topping et al.6). עם זאת, בדיקת הנפילה ובדיקת המיקרוסקופ מספיקות כדי לאמת אם נוצר תחליב משביע רצון.
    1. הגדר את מדדי השבירה עבור לייזרים אדומים וכחולים עבור חומר הפיזור (ראו טבלת חומרים) ל-1.456 ועבור הדגימה ל-1.33 במנתח גודל החלקיקים (ראו טבלת חומרים). הגדר את ספיגת מקדם השבירה ל- 0.02.
    2. מוסיפים טיפה אחת מהמזרק המכיל את תחליב הפפטיד ליחידת הפיזור המכילה שמן מינרלי קל. התחל את רכישת הנתונים מיד לאחר פיזור האמולסיה.
      הערה: מודל למטרות כלליות הופעל, והונחו חלקיקים כדוריים, להערכת התפלגות גודל החלקיקים.

4. אינדוקציה של EAE באמצעות תחליב פפטיד MOG 35-55 בעכברי C57BL6/J

הערה: בכל הניסויים נעשה שימוש בחמישה עכברי C57BL6/J בני 8-12 שבועות.

  1. לפני החיסון, מרדימים את העכברים באמצעות 2.5% איזופלורן מאודה ומאשרים באמצעות צביטה מוצקה של הבוהן.
  2. להזריק לכל עכבר תת עורית באמצעות מזרקים של 1 מ"ל לשני אתרים שונים, בצד ימין ובצד שמאל של האגף האחורי עם 200 μL של תחליב המכיל 50 מיקרוגרם של פפטיד MOG35-55 ביחס של 1:1 (v/v) של פפטיד/CFA.
  3. לפחות 1.5 שעות לאחר החיסון עם תחליב, ולאחר מכן שוב לאחר 24 שעות, לתת סך של 80 ng של שעלת Bordetella רעלן ב 200 μL של חיץ רעלן שעלת לכל עכבר, באמצעות זריקות intraperitoneal (100 μL בצד שמאל ו 100 μL באתר הימני של הבטן).
    הערה: לוקליזציה מדויקת של הזרקה תוך-צפקית עם רעלן שעלת הוכחה כחיונית להפעלת תאי T בבלוטת הלימפה המתנקזת15.
  4. אופציונלי: הזרקת פפטיד MOG35-55 שוב ביום 7 (כפי שנעשה שימוש בפרוטוקוליםמסוימים 16) על ידי חזרה על שלב 4.2.
    הערה: והכי חשוב, יש לוודא שהמזרקים והמחטים המשמשים לחיסון המכילים MOG/CFA או רעלן שעלת מושלכים כראוי לשקיות/מיכלים ביולוגיים.
  5. הערך את הציון הקליני מדי יום, תוך שימוש בסולם של 0-6 כפי שתואר קודםלכן 6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המהיר, הפשוט והסטנדרטי להכנת אמולסיות CFA/MOG מתואר באיור 1. שיטה זו תוארה לאחרונה במקום אחר6. ניתן להכין תחליבי CFA/MOG גם בשיטות אחרות, כגון שיטת המזרק המסורתית או על ידי מערבולת. שיטות אלה הושוו כאן על ידי הערכת איכות התחליבים. כל השיטות הפיקו תחליבי מים בשמן; ההומוגניות והאיכות של תחליבים אלה הוערכו על ידי הוספת טיפה קטנה על מגלשת זכוכית ואחריה תצפית תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. אמולסיות שנוצרו בשיטת ההומוגניזציה הרועדת הציגו חלקיקים אפורים/לבנים בצורת ש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחליבי מים בשמן, כגון אדג'ובנט של אנטיגן/פרוינד, שימשו במשך יותר מחצי מאה להשראת EAE17. אין כיום שיטה סטנדרטית להכנת תחליבי אנטיגן שאינם תלויים בהשפעת האדם. ערבוב ידני באמצעות מזרקים הוא סטנדרטי עבור רוב המעבדות, אולם שיטה זו היא זמן רב, לעתים קרובות גורם לאובדן מוגזם של חומר, ואת האיכות משתנה בהתאם המדען מכין אותו.

השיטה המוצגת בכתב יד זה משתמשת במכונת הומוגניזציה סטנדרטית כדי להכין את תחליבי האנטיגן/CFA. בנוסף, כל ריאגנטים המשמשים כאן ניתן aliquoted ומאוחסן במשך תקופה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BTB Emulsions AB הגישה בקשת פטנט לשימוש במכשיר ושיטה להכנת תחליבים לחיסון בעלי חיים ובני אדם (מספר בקשת פטנט אירופאית: EP3836884A1). BTB הוא המנכ"ל והמייסד של החברה, ובעל מניות באמולסיות BTB. ברטין-אינסטרומנטס מפיצה את ערכות האמולסיה המשמשות בפרסום זה ברחבי העולם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מבקש להודות ליחידות הדיור לבעלי חיים באוניברסיטת לונד, קמילה ביורקלוב ואגניישקה צ'ופק, על תמיכתן, ולריצ'רד ויליאמס, מכון קנדי לראומטולוגיה, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה, על ביקורת בונה ותמיכה לשונית בהפקת כתב יד זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מזרק הזרקה 1 מ"לב. בראון9166017V 
מזרק הזרקה 1 מ"לSigma-AldrichZ683531
צינורות ריקים 7 מ"ל עם כובעיםBertin-InstrumentsP000944LYSK0A.0צינור 7 מ"ל
50 מ"ל צינור צנטריפוגה סטרילי פישר סיינטיפיק1078856150 מ"ל שפופרת
Bordetella pertussis רעלןסיגמא-אולדריץ'P2980חנות ב-20 מעלות; C
Dispersant, שמן מינרלי קלSigma-AldrichM8410חנות
בערכת תחליבBertin-InstrumentsD34200.10 eaמכיל צינור, מכסה ובוכנה
לא שלם של Freund's AdjuvantSigma-Aldrich  F5506חנות ב +4 & deg; C
Mycobacterium tuberculosis, H37RAFisher ScientificDF3114-33-8חנות ב-+4 מעלות; C
Mastersizer 2000 Malvern PanalyticalN/Aמנתח גודל חלקיקים
Minilys-הומוגנייזר אישיBertin-InstrumentsP000673-MLYS0-Aהומוגנייזר רועד
MOG 35-55 פפטיד     InnovagenN/A
Montanide ISA 51 VGSeppic36362ZPall Acrodisc מאושר על ידי ה-FDA
0.2 μ mפישר סיינטיפיק17124381מסנן סטרלי
PBS, Ca2+/Mg2+ חינםתרמו פישר סיינטיפיק14190144PBS
פאזה-קונסטרסט מיקרוסקופאולימפוסBX40-B
חרוזי פלדה 3.2 מ"מפישר סיינטיפיקNC0445832אוטוקלאב ואחסן בחנות RT
Triton X-100Sigma-Aldrich648463ב-RT
RT מסנני מזרק

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
  2. van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760(2020).
  3. Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947(2019).
  4. Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
  5. Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
  6. Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251(2022).
  7. Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
  8. Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
  9. Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
  10. Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
  11. Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
  12. Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
  13. Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
  14. Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
  15. Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
  16. Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
  17. Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
  18. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  19. Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778(2012).
  20. Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603(2022).
  21. Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612(2022).
  22. Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Experimental Autoimmune EncephalomyelitisAntigen Adjuvant EmulsionHomogenization MethodMultiple Sclerosis ModelWater Oil EmulsionAutoimmune Disease ModelCancer Vaccine PreparationPhase Contrast MicroscopyParticle Size AnalysisComplete Freund s Adjuvant

Related Articles