הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64650

⸱

3 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את השימוש בשברים מיקרו-וסקולריים שבודדו מרקמת מכרסם או מרקמת שומן אנושית כגישה פשוטה להנדסת רקמת שומן פונקציונלית בצבע בז' וסקולרית.

תקציר

רקמת שומן תרמוגנית הנדסית (למשל, רקמות שומן בצבע בז' או חום) נחקרה כטיפול פוטנציאלי למחלות מטבוליות או לתכנון מיקרו-רקמות מותאמות אישית לבדיקת בריאות ובדיקות סמים. האסטרטגיות הנוכחיות הן לעתים קרובות מורכבות למדי ואינן מצליחות לתאר במדויק את התכונות הרב-תאיות והתפקודיות של רקמת השומן התרמוגנית. שברים מיקרו-וסקולריים, מיקרו-כלים קטנים ושלמים המורכבים מעורקים, ורידים ונימים שבודדו מרקמת השומן, משמשים כמקור אוטולוגי יחיד של תאים המאפשרים וסקולריזציה ויצירת רקמת שומן. מאמר זה מתאר שיטות לאופטימיזציה של תנאי תרבית כדי לאפשר יצירה של רקמות שומן תרמוגניות תלת-ממדיות, וסקולריות ומתפקדות ממקטעים מיקרו-וסקולריים, כולל פרוטוקולים לבידוד מקטעים מיקרו-וסקולריים מרקמת השומן ומתנאי תרבית. בנוסף, נדונות שיטות עבודה מומלצות, כמו גם טכניקות לאפיון הרקמות המהונדסות, ותוצאות דגימה הן ממכרסמים והן מקטעים מיקרו-וסקולריים אנושיים מסופקות. לגישה זו יש פוטנציאל לשמש להבנה ופיתוח של טיפולים להשמנת יתר ומחלות מטבוליות.

מבוא

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר גישה לפיתוח רקמת שומן בז' וסקולרית ממקור יחיד, שעשוי להיות אוטולוגי, מקטע מיקרו-וסקולרי (MVF). רקמות שומן חומות ובז' הוכחו כבעלות תכונות מועילות הקשורות לוויסות מטבולי; עם זאת, הנפח הקטן של מחסני רקמת שומן אלה במבוגרים מגביל את ההשפעה הפוטנציאלית על חילוף החומרים המערכתי, במיוחד במצבים חולים כגון השמנת יתר או סוכרת מסוג 2 1,2,3,4,5,6,7. קיים עניין משמעותי בשומן חום/בז' כיעד טיפולי למניעת ההשפעות המטבוליות המזיקות הקשורות להשמנת יתר ותחלואה נלווית 8,9,10,11,12.

MVFs הם מבני כלי דם שניתן לבודד ישירות מרקמת השומן, לגדל בתרבית ולתחזק אותם בתצורה תלת ממדית לפרקי זמן ממושכים 13,14,15. עבודות קודמות של הקבוצה שלנו, ואחרות, החלו לנצל את היכולת הרב-תאית והרב-פוטנטית של MVFs, במיוחד בכל הנוגע להיווצרות רקמת שומן16,17,18. כהצטברות של עבודה זו, הדגמנו לאחרונה כי MVFs שמקורם במודלים של מכרסמים של סוכרת בריאה ומסוג 219 ומנבדקים אנושיים (מבוגרים מעל גיל 50)20 הכילו תאים המסוגלים לקבל השראה ליצירת רקמת שומן תרמוגנית, או בז'.

זוהי גישה חדשנית שממנה נעשה שימוש ב-MVF ממקור יחיד, המסוגל לא רק ליצור רקמת שומן בצבע בז' אלא גם את מרכיב כלי הדם הקשור והקריטי שלה21. השימוש בטכניקה זו יכול להיות בעל ערך רב עבור מחקרים המחפשים גישה פשוטה מהונדסת רקמות להיווצרות רקמת שומן תרמוגנית. בניגוד לשיטות אחרות השואפות להנדס רקמת שומן בצבע בז' 22,23,24,25,26,27,28, התהליך המתואר במחקר זה אינו דורש שימוש במספר סוגי תאים או משטרי אינדוקציה מורכבים. ניתן ליצור מודלים של שומן ובז' ולבן עם MVFs שמקורם במכרסמים ובמקורות אנושיים, מה שמדגים פוטנציאל תרגום גדול. התוצר הסופי של פרוטוקול זה הוא רקמת שומן תרמוגנית בצבע בז' מהונדס, בעלת מבנה ותפקוד מטבולי הדומים לרקמת שומן חומה. בסך הכל, פרוטוקול זה מציג את הרעיון כי MVF מקור נגיש ואולי אוטולוגי עשוי להיות התערבות טיפולית ראויה וכלי לחקר הפרעות מטבוליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו.

הערה: עבור השלבים המתוארים להלן, עכברושי לואיס זכרים משמשים. יש לבצע התאמות פרוטוקול קלות עבור נקבה, כמו גם אוסף מקטע כלי דם עכבר (MVF)29. עבור פרוטוקולים המשתמשים ב- MVFs אנושיים (h-MVFs), השלבים היחידים הנדרשים הם השעיית h-MVFs בעקבות פרוטוקול היצרן, הכנת מדיה גדילה (1.3), היווצרות הידרוג'ל פיברין (5) ותרבית (6). לקבלת סקירה כללית של הפרוטוקול, ראה איור 1.

תרשים היווצרות MVF; הכנת ריאגנטים, בידוד שומן, הידרוג'ל פיברין, תהליך תרבית MVF.
איור 1: מתווה ניסויי. פירוט של שישה שלבים מרכזיים, לפני ניתוח, להיווצרות רקמת שומן תרמוגנית באמצעות MVF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת מגיב

הערה: ריאגנטים להלן מתאימים לחולדה אחת, נשקלת ומיוצרת בתוך ביו-הוד.

  1. הכינו אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS.
    1. הכינו 10 מ"ג/מ"ל (1.0%) BSA ב-PBS לדילול לשלבי שטיפה (1 מ"ג/מ"ל, 0.1%) ועיכול (4 מ"ג/מ"ל, 0.4%).
    2. הכינו ריכוזים שונים של BSA, כמתואר בשלב 1.1.1, לפי שלבים 1.1.3-1.1.5.
    3. 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (1% BSA ב-PBS)
      1. הוסף 500 מ"ג של BSA ו 500 מ"ל של PBS לצינור חרוטי 50 מ"ל מערבולת את הפתרון להמסת BSA.
      2. אם נוצרות בועות מוגזמות, צנטריפוגו את התמיסה ב 350 x גרם למשך 2 דקות. סנן לעקר את התמיסה עם מסנן ניילון נטו 0.22 מיקרומטר.
    4. 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (0.1% BSA ב-PBS)
      1. יש לדלל 15 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS 1:10 עם PBS על ידי הוספת 15 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS ל-135 מ"ל PBS בבקבוק סטרילי של 500 מ"ל ולנער בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח תערובת הומוגנית.
    5. 4 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (0.4% BSA ב-PBS)
      1. יש לדלל 35 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS 1:2.5 עם PBS על ידי הוספת 35 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS + 57.5 מ"ל של PBS בבקבוק סטרילי של 100 מ"ל ולנער בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח תערובת הומוגנית.
  2. הכינו collagenase ב BSA לעיכול של כריות שומן טחון.
    1. הכינו 6 מ"ג/מ"ל קולגנאז.
      1. בצינור חרוטי של 50 מ"ל, שוקלים 72 מ"ג של collagenase (תווית "עבור Epi").
      2. בשלושה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל, שוקלים 144 מ"ג של collagenase (תווית "עבור Ing 1", "עבור Ing 2", ו "עבור SubQ") כל אחד.
      3. יש לאחסן את ה-collagenase השקוקל ב-4°C עד לשימוש.
        הערה: אין להוסיף BSA/PBS עד ממש לפני העיכול.
      4. הוסף 12 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS לצינור המכיל 72 מ"ג של collagenase.
      5. הוסף 24 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS לצינורות המכילים 144 מ"ג של collagenase.
      6. נערו את הצינורות כדי להבטיח תמיסה הומוגנית וסננו לעקר את התמיסה עם מסנן ניילון נטו 0.22 מיקרומטר.
  3. הכינו מצע גדילה בתוספת חומצה אמינוקפרואית (ACA) כדי להאכיל/להבדיל את ה-MVF המבודד.
    1. מצע גדילה (GM): תוסף DMEM עם 20% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (סטרפטוקוקוס עט), 0.2% מיקופלסמה מניעתית, ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
    2. הכינו מדיה אדיפוגנית לבנה (WAM).
      1. השראת WAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר של פורסקולין, 1 מיקרומטר של דקסמתזון, ו 1 מ"ג / מ"ל ACA.
        הערה: עבור h-MVFs, בנוסף, להוסיף 125 מיקרומטר של indomethacin.
      2. תחזוקת WAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
        הערה: עבור h-MVFs, שנה את ריכוז האינסולין ל -10 מיקרוגרם / מ"ל.
    3. הכינו מדיה אדיפוגנית בצבע בז' (BAM).
      1. השראת BAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר של פורסקולין, 1 מיקרומטר של דקסמתזון, 1 מיקרומטר של רוזיגליטזון, 20 ננומטר 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine (T3), ו 1 מ"ג / מ"ל ACA.
        הערה: עבור h-MVFs, שנה את הריכוז של T3 ל- 120 ננומטר.
      2. תחזוקת BAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר פורסקולין, 1 מיקרומטר רוזיגליטזון, 20 ננומטר T3 ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
        הערה: עבור h-MVFs, שנה את ריכוז האינסולין ל -10 מיקרוגרם / מ"ל ואת ריכוז T3 ל -120 ננומטר.
  4. הכינו טרומבין (רק צריך להיות מיוצר אם הפתרון aliquoted מלאי אינו זמין) כדי להפוך את סוכן קרישה לשמש ג'ל פיברין.
    1. תרומבין 10 U/mL ב- ddH2O:
      1. להשהות אבקת טרומבין באמצעות 1-5 מ"ל של ddH2O בבקבוקון מהיצרן ולהעביר את ההשעיה ל 250 מ"ל כד.
      2. להעלות את התמיסה ל 100 מ"ל ו pipet את הפתרון למעלה ולמטה פעמים רבות כדי להבטיח תערובת הומוגנית. Aliquot התמיסה לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל (~ 10 מ"ל / צינור) ולאחסן את aliquots במקפיא -20 ° C.
        הערה: כדי להשתמש, הפשיר את הטרומבין בטמפרטורת החדר (RT).

2. הכנת כלים/חומרים

הערה: כל המכשור צריך להיות autoclaved/מעוקר לפני השימוש.

  1. בידוד שומן אפידימלי/מפשעתי/תת עורי (ניתוח שייעשה באזור כירורגי מוגדר)
    1. ודא את זמינותם של תחתיכות חד פעמיות, שני מספריים, hemostat אחד (אופציונלי), שני מלקחיים, וארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל עם 10-15 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA (0.1%) ב- PBS.
  2. בידוד מקטע כלי דם
    1. לטחינה (שתיעשה בביוהוד), יש לוודא זמינות של שלוש צלחות פטרי סטריליות 100 מ"מ לא מצופות, זוג מלקחיים אחד וזוג מספריים מעוקלים.
    2. לעיכול ובידוד (שייעשה בביוהוד), יש לוודא זמינות של זוג מספריים אחד, זוג מלקחיים אחד, שמונה צלחות פטרי סטריליות לא מצופות בקוטר 100 מ"מ, שלוש צלחות פטרי סטריליות 35 מ"מ לא מצופות, קולגנאז במשקל ובטמפרטורה של 4°C, ארבע צלוחיות 250 מ"ל, מחזיק פלסטיק אחד עם חור במרכז, 4 רשתות 500 מיקרומטר (חתוכות ל-3 בריבועים מעוגלים), ארבעה מסכים 37 מיקרומטר (לחתוך ל 3 ריבועים מעוגלים), ו 11 50 מ"ל צינורות חרוטיים.
  3. תרחיף פיברין
    1. עבור הידרוג'ל פיברין (להיעשות בביוהוד), ודא כי פיברינוגן, תרומבין ומדיה גדילה (שנעשו במהלך הכנת מגיב) זמינים.

3. פרוטוקול בידוד שומן

  1. צעדים מקדימים
    1. מלא עם אתנול כדי לשטוף ולחטא את כלי הניתוח לפני השימוש בהם. לאחר מכן, הכינו את השולחן לטיפול בחולדה והכינו ואקום מוכן לשאוף את הפרווה שנוצרה במהלך שלב הגילוח.
    2. הכינו דלי עם קרח שבו יוצבו צינורות חרוטי 50 מ"ל שהוכנו בעבר, שכל אחד מהם מכיל 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA. תייגו את הצינורות בהתאם.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך בשני צינורות חרוטיים נפרדים עבור השומן המפשעה, שכן יש לחלץ שני צדדים וכמות השומן שנאספה מאזור זה נוטה להיות הגדולה ביותר בהשוואה לאפידידימלית ותת עורית אחורית.
    3. התחילו עם חולדה מורדמת באזור הכירורגי המוגדר עם כלי הניתוח הנדרשים. באופן כללי, CO2 משמש להרדים את החולדות בהתאם לפרוטוקולים של IACUC.
    4. בעזרת קוצצי שיער, לגלח את החולדה סביב האזור המעניין. באופן ספציפי, יש להתגלח בין המפשעות למחצית הבטן לצורך בידוד שומן אפידידימלי ומפשעתי (השתמש במכונת הגילוח הקטנה יותר עבור הפרווה באזור זה). יש לגלח את כל הגב כדי שהשומן התת עורי האחורי ימוקם בין השכמה (עדיף להשתמש במכונת גילוח גדולה יותר מכיוון שהפרווה עבה יותר בחלק האחורי של החולדה).
    5. הכינו את החולדה על ידי ריסוס שלה באתנול 70%. באופן כללי, מומלץ לנקות את האזור שעומד להיחתך פעמיים.
  2. בידוד מחסני שומן שונים
    1. מפשעתי (תת עורי)
      1. במצב שכיבה, להרים את העור מתחת לפין עם זוג מספריים. מתחילים את החתך עם מספריים, מתחילים במרכז וחותכים לרוחב, יוצרים צורת "V" ולולאה לחלק האחורי של החולדה כדי לגשת לכל מחסן השומן. זכרו לחתוך באופן שטחי כך שהשומן למטה יהיה שלם. במהלך שלב החיתוך, הקפידו על הפרדת העור מהשומן על-ידי חיתוך רקמת הפאשיה המחוברת (איור 2A).
      2. לאחר חיתוך הפאשיה כראוי, ודא ששני הצדדים של השומן המפשעתי נראים לעין (השומן המפשעתי משתרע מאזור המפשעה לכיוון הגב). לאחר מכן, הסירו את השומן משני הצדדים בשתי צינוריות חרוטיות נפרדות המכילות 10 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA (איור 2B).
    2. אפידידימל (קרביים)
      1. קצרו את השומן האפידידיסמלי על-ידי חיתוך דרך עור הבטן ובזהירות דרך השכבה הדקה שמקיפה את האשכים (איור 2C).
      2. בעזרת מלקחיים, משכו בעדינות את רקמת השומן החוצה וגזרו אותה באמצעות מספריים. הימנעו מלנתח כלי דם גדולים הנראים לעין (אם האשכים והאפידידימיס נקצרים, הסירו אותם במהלך שלב הניקוי בביו-הוד).
      3. מניחים בזהירות את השומן שהוסר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS.
        הערה: הסרת השומן האפידידימלי צריכה להיעשות לאחר הסרת השומן המפשעתי. השומן האפידידימלי הוא בדרך כלל קטן יותר בנפחו וממוקם מתחת לשומן המפשעה, מתחת לעור הבטן סביב האשכים והאפידידימיס.
    3. תת עורית אחורית
      1. סובבו את החולדה נוטה (הצד הגבי כלפי מעלה) ובעזרת מספריים גדולים חתכו את עור הגב (העור באזור הזה עבה) עד לקרקפת, תוך הקפדה לא לחתוך עמוק מדי, ממש מתחת לעור (איור 2D).
      2. חותכים את הפאשיה המחברת את העור לרקמה; השומן ממוקם באזור interscapular. שימו לב להבדיל/להפריד את השומן התת עורי מהשומן החום. השומן החום קרוב יותר לעמוד השדרה (איור 2E).
      3. בודדו והניחו את השומן בצינור(ות) החרוטיות המתאימות של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS.

תרשים דיסקציה של רקמת שומן בעכבר; מיקומי שומן מפשעתי, אפידימלי ואחורי.
איור 2: בידוד של מחסני רקמת שומן שונים . (A) חתכים ראשוניים הדרושים לכריתה של רקמת השומן המפשעתית. (ב) מיקום מחסן השומן המפשעה. (C) מיקום מחסן השומן האפידידימלי, תוך ציון חתך העור החיצוני הדרוש לגישה. (D) חתכים נוספים הדרושים לאחר שהעכברים ממוקמים מועדים לגישה לשומן נוסף. (ה) מיקום מחסן השומן התת עורי האחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. פרוטוקול בידוד שברים מיקרו-וסקולריים

  1. מניחים 50 מ"ל צינוריות חרוטיות המכילות שומן נכרת מהחולדה לתוך biohood.
  2. באמצעות מלקחיים, הניחו את השומן בצלחת פטרי סטנדרטית של 100 מ"מ (עם ~0.5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS כדי לשמור על לחות הרקמה).
  3. נקו והוציאו את כל כלי הדם הנראים לעין ואת רקמת השריר/חוץ מהשומן.
  4. טוחנים את השומן עם מספריים במשך ~ 10 דקות (טחון מספיק כדי שניתן יהיה להעביר אותו עם פיפט 10 מ"ל).
  5. בדוק גושים על ידי הוספת ~ 0.5 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS; ממשיכים לטחון במידת הצורך.
  6. מעבירים את השומן הטחון לבקבוק סטרילי של 250 מ"ל עם פיפט של 10 מ"ל.
    הערה: שים לב לעוצמת הקול באמצעות פיפט.
  7. הוסף מספיק BSA (1 מ"ג / מ"ל) כך נפח הסופי הוא 20 מ"ל.
  8. הוסף 4 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS ל- collagenase (ריכוז סופי של collagenase: 6 מ"ג / מ"ל) (כלומר, 12 מ"ל עבור 72 מ"ג של collagenase או 24 מ"ל עבור 144 מ"ג של collagenase).
    הערה: אין להוסיף עד לסיום הטחינה, שכן היא רגישה לזמן.
  9. נערו בעדינות את הצינור החרוטי כדי להבטיח תמיסה הומוגנית וסננו לעקר את התמיסה עם מסנן רשת ניילון 0.22 מיקרומטר.
  10. עבור שומן epididymal, לעכל במשך ~ 8-10 דקות; עבור השומן התת עורי המפשעה והאחורי, לעכל במשך ~ 15-20 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, לנער את הבקבוק בתנועה סיבובית לאורך כל הדרך (לעצור ברגע שהשומן מגיע למקום שבו נותרו רק כמה גושים).
  11. מעבירים את השומן המעוכל לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל (צריך להיות ~30 מ"ל / צינור), ותייגו את הצינור כ"שומן מעוכל".
  12. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 4 דקות; לאחר סיבוב, הגלולה חייבת להיות אדומה (איור 3A).
  13. במהלך הסיבוב, הניחו את המסך הסטרילי בגודל 37 מיקרומטר ומסכי 500 מיקרומטר בצלחת פטרי סטרילית עם 5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS כדי להשרות לפני השימוש.
  14. לאחר הסיבוב, דקנט את הסופרנאטנט לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל המסומן כ"פסולת". בצעו את הדקציה בעדינות כדי להסיר את השומן השטחי ולא להפריע לגלולה העשויה MVFs.
  15. הוסף 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS לצינור המכיל את הגלולה ("שומן מעוכל"). טריטוראט (פייפ למעלה ולמטה) את הגלולה 2x.
  16. הימנע להיות גס מדי על הגלולה כדי לא לשבש את השברים.
  17. הניחו את המסך בגודל 500 מיקרומטר בצלחת פטרי חדשה מעל מחזיק מסך הפלסטיק (איור 3B).
  18. פיפט 10 מ"ל מצינור "גלולה מעוכלת" מעל מסך של 500 מיקרומטר באמצעות מעגלים קונצנטריים (איור 3C).
  19. שטפו את המסנן עם 5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יסתננו דרך צלחת הפטרי; לכן, השליכו את מסך 500 מיקרומטר אך שמרו את הנוזל המסונן בתוך צלחת הפטרי.
  20. הניחו את המסך בגודל 37 מיקרומטר בצלחת פטרי חדשה מעל מחזיק מסך הפלסטיק.
  21. החליפו את הצינור כדי לסלק גושים לפני השימוש במסך 37 מיקרומטר.
  22. פיפט את הנוזל המתקבל מהסינון הראשון על מסך 37 מיקרומטר באמצעות מעגלים קונצנטריים.
  23. שטפו את המסנן עם 5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יישארו בפילטר, ולכן השליכו את הנוזל המסונן, אך שמרו את מסך 37 מיקרומטר.
  24. החלק את המסך בגודל 37 מיקרומטר לתוך צלחת פטרי חדשה המכילה 5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS.
  25. נערו את התבשיל על ידי הדבקתו על מחזיק חרוטי כדי לעקור את השברים. אין לנער במרץ רב מדי, שכן הנוזל/התאים עלולים להישפך מתוך צלחת הפטרי.
  26. יש לשטוף את המסנן ב-5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יישארו בתמיסה נוזלית בצלחת הפטרי. שמור את המסך בגודל 37 מיקרומטר ואת המקטע שנעקר ממקומו המכיל נוזל בתוך צלחת הפטרי לשלבים הבאים.
  27. מעבירים את BSA + קטע המכיל נוזל לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
  28. חזור על שטיפה של מסך 37 מיקרומטר מספר פעמים נוספות (בכל פעם עם ~ 5 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS) והוסף לצינור החרוט. חזור על הפעולה עד שהנפח הכולל שנאסף הוא ~ 15-20 מ"ל. בסופו של דבר, התאים הרצויים ייאספו מהתמיסה הנוזלית בצלחת הפטרי ויונחו בצינור חרוט; בשלב זה, השליכו את מסך 37 מיקרומטר לאחר השטיפה הסופית, אך שמרו את השברים שנעקרו ממקומם המכילים נוזל בתוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל.
  29. גזור את קצהו של קצה צינור 200 μL באמצעות מספריים. נערו בעדינות את צינור 50 מ"ל, הסירו שתי דגימות של 20 מיקרוליטר והניחו אותן בצלחת פטרי נקייה של 35 מ"מ.
  30. ספרו את מספר השברים בכל דגימה בצלחת הפטרי כדי לקבל את המספר הכולל של MVF שבודדו.
    סה"כ שברים = משוואה לחישוב ריכוז הדגימה הממוצע בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  31. סובב את החלק שנותר שנעקר המכיל נוזל בצינור חרוטי של 50 מ"ל ב 400 x גרם במשך 4 דקות כדי לאסוף את ה- MVF.

תרשים תהליך צנטריפוגה עם הוראות הגדרת גלולה, בידוד סופרנטנט וסינון.
איור 3: בידוד של MVFs. (A) לאחר עיכול של רקמת השומן, תיאור ההפרדה של MVFs המכילים גלולה וסופרנאטנט לאחר ספין-דאון. (B) פריסת חומרים לסינון ולכידה של MVFs. (C) איור של שיטת המעגל הקונצנטרי לשלבי סינון/שטיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. היווצרות הידרוג'לים פיברין

  1. חישובים לדוגמה:
    הערה: להלן החישובים עבור MVFs שנזרעו ב~15,000-20,000 MVF/mL ויחס ג'ל פיברינוגן:טרומבין ב-2:5, כאשר פיברינוגן משמש בריכוז של 20 מ"ג/מ"ל.
    1. לייצור חמישה ג'לים של 250 מיקרוליטר, נדרש נפח כולל של 1,250 מיקרוליטר. תמיד חשבון שגיאות pipetting, ולכן, לעשות מספיק עבור 1.5 מ"ל של ג'לים.
      1. חישוב נפח הפיברינוגן הנדרש כדלקמן:
        נוסחת היחס \( \frac{2}{7} = \frac{X_1}{1500 \, \mu L} \), חישוב במערך ניסוי., X1 = 428.57 μL של פיברינוגן,
      2. חשב את נפח התרומבין הנדרש כדלקמן:
        נוסחת חישוב דילול, משוואה; 5/7 = X<sub>2</sub>/1500 מיקרוליטר, תרשים כימיה חינוכית, X2 = 1,071.43 מיקרוליטר של טרומבין
      3. עבור נפח נדרש של 428.57 μL, לעשות 500 μL של פיברינוגן כדלקמן:
        20 מ"ג / מ"ל * 0.5 מ"ל = 10 מ"ג פיברינוגן. להשעות את זה ב 500 μL של DMEM
      4. כדי להשיג כל ג'ל, לחשב את נפח פיברינוגן וטרומבין כדלקמן:
        1. פיברינוגן:
          משוואה המציגה נוסחת דילול, 2/7=X1/250μL, המשמשת בחישובי מעבדה לכימיה.,X 1 = 71.43 מיקרוליטר של פיברינוגן (ב-DMEM) + MVF
        2. טרומבין:
          משוואת פרופורציה, 5/7=X2/250μL, המשמשת בחישובי דילול; פורמולה לשימוש חינוכי., X2 = 178.57 מיקרוליטר של טרומבין
  2. יציקת ג'ל פיברין MVF
    1. דקנט את רוב הנוזל בשבר המסובב למטה בצינור החרוטי 50 מ"ל. השתמש פיפטה כדי להסיר את נפח קטן של נוזל שתופס על שפת הצינור החרוט.
    2. הוסיפו תרומבין לבארות שבהן ייוצרו ג'לים (איור 4A).
    3. יש לגזור את קצהו של קצה פיפט של 200 μL ולהשהות מחדש את ה-MVFs בעדינות באמצעות פיברינוגן כדי לקבל צפיפות סופית של ~15,000-20,000 MVF/mL פעם אחת בג'ל.
    4. יש לקצץ קצה של 200 מיקרוליטר פיפט ופיפט MVF+פיברינוגן לתמיסת הטרומבין בעדינות. מזלפים במהירות למעלה ולמטה כדי להבטיח תערובת הומוגנית. חזרו על הפעולה עד שכל הג'לים מיוצרים (איור 4B).
    5. הניחו את לוחות הבאר באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך ~15 דקות כדי לאפשר הצלבת ג'ל (איור 4C).
    6. הוסף 100-150 μL של מצע צמיחה לכל באר.

הפעלת תרומבין בתרשים היווצרות פיברין הידרוג'ל: פיברינוגן פיפטה, MVFs, הגדרת 37 מעלות צלזיוס.
איור 4: היווצרות של ג'ל פיברין MVF . (A) תערובת תרומבין בת 5/7 חלקים מוחדרת לבאר המתאימה. (B) לאחר מכן, עם קצה פיפט חתוך (כדי לא להפריע ל-MVFs), תערובת פיברינוגן+MVF בת 2/7 חלקים מוחדרת לתוך הבאר ומעורבבת בעדינות. (C) לבסוף, כל הג'לים שהושלמו ממוקמים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, מה שמאפשר להידרוג'ל להתמצק באופן מלא לפני שהמדיה מונחת למעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. תנאי טיפוח של MVFs

  1. לטיפוח רקמת שומן לבנה ובז' לא וסקולרית (+ GM Control), השתמשו בצירי הזמן19 המוצגים באיור 5.
  2. לתרבית של רקמת שומן לבנה ובז' וסקולרית (+ GM Control), השתמשו בצירי הזמן19 המוצגים באיור 6.
  3. הידרוג'לים צריכים להישמר באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך התרבית למחקר, כאשר התקשורת מתחלפת כל יומיים. לקיבוע וטיפול בדוגמאות לניתוח, עיין בעבודות שפורסמו בעבר16,19,20.

דיאגרמת ציר זמן של אנגיוגנזה לעומת אדיפוגנזה: השוואת תהליכים של 14 יום עבור GM, WAM, BAM.
איור 5: תזמון להיווצרות רקמת שומן לא וסקולרית. נתון זה שונה מ Acosta et al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת ציר זמן של אנגיוגנזה ואדיפוגנזה המפרטת אינדוקציה והתבגרות של GM ו-WAM/BAM.
איור 6: תזמון להיווצרות רקמת שומן וסקולרית. נתון זה שונה מ Acosta et al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ישנם מספר מאפיינים מורפולוגיים פנוטיפיים עיקריים של רקמת שומן בצבע בז'/חום: הוא רב-לוקולרי/מכיל טיפות שומנים קטנות, בעל מספר רב של מיטוכונדריה (הסיבה להופעתו ה"חומה" האופיינית in vivo), יש לו בהתאמה קצב צריכת חמצן גבוה/ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית, הוא מאוד וסקולרי, יש לו ספיגת גלוקוז מוגברת בליפוליזה/אינסולין, והכי ידוע לשמצה, מבטא רמות גבוהות של חלבון uncoupling protein 1 (UCP1), חלבון מיטוכונדריאלי המעורב בנשימה תרמוגנית19,30.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תחום הנדסת רקמת השומן החומה/בז' אינו בשל ברובו 22,23,24,25,26,27,28, כאשר רוב דגמי השומן מפותחים עבור רקמת שומן לבנה 8,22,31. מיקרו-רקמות מהונדסות/בז' מורכבות בדרך כלל ממקורות תאים מרובים או שינויים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

ד"ר אקוסטה נתמך על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות CA148724 ו- TL1TR002647. ד"ר גונזלס פוראס נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של המכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס מספר F32-0DK122754. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (5SC1DK122578) ואוניברסיטת טקסס במחלקה להנדסה ביו-רפואית בסן אנטוניו. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. הדמויות נוצרו חלקית עם Biorender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אמינוקפרואיתסיגמא אולדריץ'A2504-100Gנוסף ב-DMEM בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל
מספריים קהות קצהפישר מדעי12-000-172עיקור בחיטוי
אלבומין סרום בובין (BSA)Millipore126575-10GMמדולל ב-PBS ל-4 מ"ג/מ"ל ו-1 מ"ג/מ"ל
קולגנאז סוג 1פישר מדעיNC9633623מדולל ל-6 מ"ג/מ"ל ב-BSA 4 מ"ג/מ"ל, עיכול שומן טחון
דקסמתזוןתרמו סיינטיפיקAC230302500מדולל באתנול בריכוז מלאי של 2 מ"ג/מ"ל
רפידות תחתונות חד פעמיותפישר סיינטיפיק23-666-062לספיגת נוזלים במהלך ניתוח
ניתוח מספרייםפישר מדעי08-951-5עיקור בחיטוי
דולבקו&פריים; s Modified Eagle ′ s Medium (DMEM)Fisher Scientific11885092
Dulbecco′ s Modified Eagle ′ s תערובת בינונית/תזונתית F-12 חזיר (DMEM/F12)Sigma AldrichD8062
סרום בקר עוברי 16140089 מדעי של פישרנוספה ב-DMEM ל-20% v/v.
פיברינוגן Sigma AldrichF8630-25Gמסיס ב-DMEM בריכוז של 20 מ"ג/מ"ל, חלבון המצוי בפלסמת הדם והמרכיב העיקרי של בקבוק הידרוג'ל
, 250 מ"לפישר מדעיFB500250מאפשר עיכול שומן באמצעות שטח פנים גדול
מלקחייםפישר מדעי50-264-21עיקור בחיטוי, לטיפול ברקמות ומסננים
פורסקוליןסיגמא אולדריץ'F6886מדולל באתנול בריכוז מלאי של 10 מ"מ
MVFAdvanced Solutions Life Scienes, LLChttps://www.advancedsolutions.com/microvesselsMVFs אנושיים (hMVFs) שבודדו משלושה חולים שונים (נשים בנות 52, 54 ו-56) שימשו במחקר הנוכחי.
אינדומתצין Sigma AldrichI7378מדולל באתנול בריכוז מלאי של 12.5 מ"מ
אינסולין מלבלב חזירSigma AldrichI5523מדולל ב-0.01 N HCl בריכוז מלאי של 5 מ"ג/מ"ל
MycoZapFisher ScientificNC9023832נוסף ב-DMEM ל-0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)פישר 15140122 מדעינוסף ב-DMEM ל-1% v/v.
צלחות פטרי, פוליסטירן (100 מ"מ על 15 מ"מ).פישר סיינטיפיק3510293 להסרת כלי דם וטחינה, 8 (מכסה) להשרייה מוקדמת של מסכים ו-8 (צלחת) לשימוש בעת סינון עם 500 או 37 ומיקרו; M מסנן
צלחות פטרי, פוליסטירן (35 מ"מ על 10 מ"מ).פישר מדעי50-202-036לספירת שברים
מאגר פוספט מלח (PBS)פישר מדעי14-190-250מדולל ל-1x במים סטריליים נטולי יונים.
קוצץ חולדות (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)פישר NC0854141
Rosiglitazoneפישר R0106200MG מדעימדולל ב-DMSO בריכוז מלאי של 10 מ"מ
מספרייםFine Science Tools14059-111 לחתך ראשוני, 1 לחתך אפידידימלי, 1 לחיתוך קצה
מסך  37 µ M חברת האספקה הביולוגית של קרולינה652222Rחתוך לריבועים מעוגלים בגודל 3 אינץ' ומעוקר בתחמוצת אתילן, לכידת שברים והסרה של שברים קטנים מאוד/תאים בודדים ופסולת
מסך 500 ומיקרו; M חברת האספקה הביולוגית של קרולינה652222Fחתוך לריבועים מעוגלים בגודל 3 אינץ' ומעוקר בתחמוצת אתילן, מסיר שברים/פסולת גדולים יותר
HemostatFisher scientific12-000-171לעקר בחיטוי, להידוק העור לפני חתך
מסנן Steriflip 0.22 μ מ MilliporeSE1M179M6
ThrombinFisher Scientific6051601KUמדולל במים נטולי יונים ל-10 U/mL, משמש כחומר קרישה שהופך פיברינוגן לפיברין
הורמון בלוטת התריס (T3)Sigma AldrichT2877מדולל ב-1N NaOH בריכוז מלאי של 0.02 מ"מ
חולדות שמנות סוכרתיות (ZDF) - שמנות (FA/FA) או רזות (FA/+) זכר נהר צ'ארלסhttps://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		הושג מנהר צ'ארלס (ווילמינגטון, מסצ'וסטס). החולדות נרכשו בגיל 4 שבועות והוזנו בפורינה 5008 עד להמתת חסד (גיל 15-19 שבועות). רמות הגלוקוז (דם מהווריד הספנוס הצדדי) היו גבוהות מ-300 מ"ג/ד"ל בכל חולדות FA/FA ששימשו במחקר. כל בעלי החיים שוכנו בסביבה מבוקרת טמפרטורה עם מחזור אור-חושך של 12 שעות והוזנו אד ליביטום.
Humanמדעי

מקורות

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061(2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27(2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38(2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629(2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022(2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337(2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395(2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861(2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523(2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687(2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114(2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134(2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

v
תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.