כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את השימוש בשברים מיקרו-וסקולריים שבודדו מרקמת מכרסם או מרקמת שומן אנושית כגישה פשוטה להנדסת רקמת שומן פונקציונלית בצבע בז' וסקולרית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים
במאמר זה
סיכום
תקציר
רקמת שומן תרמוגנית הנדסית (למשל, רקמות שומן בצבע בז' או חום) נחקרה כטיפול פוטנציאלי למחלות מטבוליות או לתכנון מיקרו-רקמות מותאמות אישית לבדיקת בריאות ובדיקות סמים. האסטרטגיות הנוכחיות הן לעתים קרובות מורכבות למדי ואינן מצליחות לתאר במדויק את התכונות הרב-תאיות והתפקודיות של רקמת השומן התרמוגנית. שברים מיקרו-וסקולריים, מיקרו-כלים קטנים ושלמים המורכבים מעורקים, ורידים ונימים שבודדו מרקמת השומן, משמשים כמקור אוטולוגי יחיד של תאים המאפשרים וסקולריזציה ויצירת רקמת שומן. מאמר זה מתאר שיטות לאופטימיזציה של תנאי תרבית כדי לאפשר יצירה של רקמות שומן תרמוגניות תלת-ממדיות, וסקולריות ומתפקדות ממקטעים מיקרו-וסקולריים, כולל פרוטוקולים לבידוד מקטעים מיקרו-וסקולריים מרקמת השומן ומתנאי תרבית. בנוסף, נדונות שיטות עבודה מומלצות, כמו גם טכניקות לאפיון הרקמות המהונדסות, ותוצאות דגימה הן ממכרסמים והן מקטעים מיקרו-וסקולריים אנושיים מסופקות. לגישה זו יש פוטנציאל לשמש להבנה ופיתוח של טיפולים להשמנת יתר ומחלות מטבוליות.
מבוא
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר גישה לפיתוח רקמת שומן בז' וסקולרית ממקור יחיד, שעשוי להיות אוטולוגי, מקטע מיקרו-וסקולרי (MVF). רקמות שומן חומות ובז' הוכחו כבעלות תכונות מועילות הקשורות לוויסות מטבולי; עם זאת, הנפח הקטן של מחסני רקמת שומן אלה במבוגרים מגביל את ההשפעה הפוטנציאלית על חילוף החומרים המערכתי, במיוחד במצבים חולים כגון השמנת יתר או סוכרת מסוג 2 1,2,3,4,5,6,7. קיים עניין משמעותי בשומן חום/בז' כיעד טיפולי למניעת ההשפעות המטבוליות המזיקות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו.
הערה: עבור השלבים המתוארים להלן, עכברושי לואיס זכרים משמשים. יש לבצע התאמות פרוטוקול קלות עבור נקבה, כמו גם אוסף מקטע כלי דם עכבר (MVF)29. עבור פרוטוקולים המשתמשים ב- MVFs אנושיים (h-MVFs), השלבים היחידים הנדרשים הם השעיית h-MVFs בעקבות פרוטוקול היצרן, הכנת מדיה גדילה (1.3), היווצרות הידרוג'ל פיברין (5) ותרבית (6). לקבלת סקירה כללית של הפרוטוקול, ראה איור 1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ישנם מספר מאפיינים מורפולוגיים פנוטיפיים עיקריים של רקמת שומן בצבע בז'/חום: הוא רב-לוקולרי/מכיל טיפות שומנים קטנות, בעל מספר רב של מיטוכונדריה (הסיבה להופעתו ה"חומה" האופיינית in vivo), יש לו בהתאמה קצב צריכת חמצן גבוה/ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית, הוא מאוד וסקולרי, יש לו ספיגת גלוקוז מוגברת בליפוליזה/אינסולין, והכי ידוע לשמצה, מבטא רמות גבוהות של חלבון uncoupling protein 1 (UCP1), חלבון מיטוכונדריאלי המעורב בנשימה תרמוגנית19,30.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תחום הנדסת רקמת השומן החומה/בז' אינו בשל ברובו 22,23,24,25,26,27,28, כאשר רוב דגמי השומן מפותחים עבור רקמת שומן לבנה 8,22,31. מיקרו-רקמות מהונדסות/בז' מורכבות בדרך כלל ממקורות תאים מרובים או שינויים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.
תודות
ד"ר אקוסטה נתמך על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות CA148724 ו- TL1TR002647. ד"ר גונזלס פוראס נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של המכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס מספר F32-0DK122754. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (5SC1DK122578) ואוניברסיטת טקסס במחלקה להנדסה ביו-רפואית בסן אנטוניו. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. הדמויות נוצרו חלקית עם Biorender.com.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומצה אמינוקפרואית | סיגמא אולדריץ' | A2504-100G | נוסף ב-DMEM בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל |
| מספריים קהות קצה | פישר מדעי | 12-000-172 | עיקור בחיטוי |
| אלבומין סרום בובין (BSA) | Millipore | 126575-10GM | מדולל ב-PBS ל-4 מ"ג/מ"ל ו-1 מ"ג/מ"ל |
| קולגנאז סוג 1 | פישר מדעי | NC9633623 | מדולל ל-6 מ"ג/מ"ל ב-BSA 4 מ"ג/מ"ל, עיכול שומן טחון |
| דקסמתזון | תרמו סיינטיפיק | AC230302500 | מדולל באתנול בריכוז מלאי של 2 מ"ג/מ"ל |
| רפידות תחתונות חד פעמיות | פישר סיינטיפיק | 23-666-062 | לספיגת נוזלים במהלך ניתוח |
| ניתוח מספריים | פישר מדעי | 08-951-5 | עיקור בחיטוי |
| דולבקו&פריים; s Modified Eagle ′ s Medium (DMEM) | Fisher Scientific | 11885092 | |
| Dulbecco′ s Modified Eagle ′ s תערובת בינונית/תזונתית F-12 חזיר (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
| סרום בקר עוברי | 16140089 מדעי של פישר | נוספה ב-DMEM ל-20% v/v. | |
| פיברינוגן | Sigma Aldrich | F8630-25G | מסיס ב-DMEM בריכוז של 20 מ"ג/מ"ל, חלבון המצוי בפלסמת הדם והמרכיב העיקרי של בקבוק הידרוג'ל |
| , 250 מ"ל | פישר מדעי | FB500250 | מאפשר עיכול שומן באמצעות שטח פנים גדול |
| מלקחיים | פישר מדעי | 50-264-21 | עיקור בחיטוי, לטיפול ברקמות ומסננים |
| פורסקולין | סיגמא אולדריץ' | F6886 | מדולל באתנול בריכוז מלאי של 10 מ"מ |
| MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | MVFs אנושיים (hMVFs) שבודדו משלושה חולים שונים (נשים בנות 52, 54 ו-56) שימשו במחקר הנוכחי. |
| אינדומתצין | Sigma Aldrich | I7378 | מדולל באתנול בריכוז מלאי של 12.5 מ"מ |
| אינסולין מלבלב חזיר | Sigma Aldrich | I5523 | מדולל ב-0.01 N HCl בריכוז מלאי של 5 מ"ג/מ"ל |
| MycoZap | Fisher Scientific | NC9023832 | נוסף ב-DMEM ל-0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
| פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) | פישר 15140122 מדעי | נוסף ב-DMEM ל-1% v/v. | |
| צלחות פטרי, פוליסטירן (100 מ"מ על 15 מ"מ). | פישר סיינטיפיק | 351029 | 3 להסרת כלי דם וטחינה, 8 (מכסה) להשרייה מוקדמת של מסכים ו-8 (צלחת) לשימוש בעת סינון עם 500 או 37 ומיקרו; M מסנן |
| צלחות פטרי, פוליסטירן (35 מ"מ על 10 מ"מ). | פישר מדעי | 50-202-036 | לספירת שברים |
| מאגר פוספט מלח (PBS) | פישר מדעי | 14-190-250 | מדולל ל-1x במים סטריליים נטולי יונים. |
| קוצץ חולדות (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | פישר NC0854141 | ||
| Rosiglitazone | פישר R0106200MG מדעי | מדולל ב-DMSO בריכוז מלאי של 10 מ"מ | |
| מספריים | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 לחתך ראשוני, 1 לחתך אפידידימלי, 1 לחיתוך קצה |
| מסך 37 µ M | חברת האספקה הביולוגית של קרולינה | 652222R | חתוך לריבועים מעוגלים בגודל 3 אינץ' ומעוקר בתחמוצת אתילן, לכידת שברים והסרה של שברים קטנים מאוד/תאים בודדים ופסולת |
| מסך 500 ומיקרו; M | חברת האספקה הביולוגית של קרולינה | 652222F | חתוך לריבועים מעוגלים בגודל 3 אינץ' ומעוקר בתחמוצת אתילן, מסיר שברים/פסולת גדולים יותר |
| Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | לעקר בחיטוי, להידוק העור לפני חתך |
| מסנן Steriflip 0.22 μ מ | Millipore | SE1M179M6 | |
| Thrombin | Fisher Scientific | 6051601KU | מדולל במים נטולי יונים ל-10 U/mL, משמש כחומר קרישה שהופך פיברינוגן לפיברין |
| הורמון בלוטת התריס (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | מדולל ב-1N NaOH בריכוז מלאי של 0.02 מ"מ |
| חולדות שמנות סוכרתיות (ZDF) - שמנות (FA/FA) או רזות (FA/+) זכר | נהר צ'ארלס | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 | הושג מנהר צ'ארלס (ווילמינגטון, מסצ'וסטס). החולדות נרכשו בגיל 4 שבועות והוזנו בפורינה 5008 עד להמתת חסד (גיל 15-19 שבועות). רמות הגלוקוז (דם מהווריד הספנוס הצדדי) היו גבוהות מ-300 מ"ג/ד"ל בכל חולדות FA/FA ששימשו במחקר. כל בעלי החיים שוכנו בסביבה מבוקרת טמפרטורה עם מחזור אור-חושך של 12 שעות והוזנו אד ליביטום. |
מקורות
- Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
- Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
