מאמר שיטה

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק in vivo על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

DOI:

10.3791/64656

⸱

14 באוקטובר 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ויסות אפיגנטי של ביטוי גנים מושפע בדרך כלל מאנזימים משנים היסטון (HMEs) המייצרים סימני היסטון הטרוכרומטיים או אאוכרומטיים לדיכוי שעתוק או הפעלה, בהתאמה. HMEs מגויסים לכרומטין היעד שלהם על ידי גורמי שעתוק (TFs). לפיכך, זיהוי ואפיון אינטראקציות ישירות בין HMEs ו- TFs הם קריטיים להבנת תפקידם וספציפיותם טוב יותר. מחקרים אלה יהיו רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית אם יבוצעו in vivo בתוך רקמות חיות. כאן מתואר פרוטוקול להמחשת אינטראקציות בעלים של צמחים בין היסטון דאוביקוויטינאז צמחי לבין גורם שעתוק צמחי באמצעות העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET), המאפשרת זיהוי קומפלקסים בין מולקולות חלבון הנמצאות במרחק של <10 ננומטר זו מזו. מוצגות שתי וריאציות של טכניקת FRET: SE-FRET (פליטה רגישה) ו- AB-FRET (הלבנה מקבלת), שבהן האנרגיה מועברת באופן לא רדיאטיבי מהתורם למקבל או נפלטת באופן רדיאטיבי על ידי התורם עם הפוטו-הלבנה של המקבל. ניתן להתאים בקלות את שתי הגישות SE-FRET ו-AB-FRET כדי לגלות אינטראקציות אחרות בין חלבונים אחרים בפלנטה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היסטון דאוביקוויטינאזות צמחיות ממלאות תפקיד חשוב בשליטה על ביטוי גנים על ידי שינוי פוסט-תרגומי של היסטונים, במיוחד על ידי מחיקת סימני המונוביקוויטילציהשלהם 1. עד כה, OTLD1 הוא אחד הצמחים הבודדים היסטון deubiquitinases המאופיינים ברמה המולקולרית ב Arabidopsis 2,3. OTLD1 מסיר קבוצות מונוביקוויטין ממולקולות היסטון H2B, ובכך מקדם הסרה או הוספה של אצטילציה אאוכרומטית ושינויי מתילציה של H3 היסטונים בגן המטרה כרומטין 4,5. יתר על כן, OTLD1 מקיים אינטראקציה עם אנזים משנה כרומטין אחר, היסטון ליזין דמתילאז KDM1C, כדי להשפיע על דיכוי שעתוק של גני המטרה 6,7.

רוב האנזימים המשנים היסטון חסרים יכולות קשירת DNA, ולכן אינם יכולים לזהות את גני המטרה שלהם באופן ישיר. אפשרות אחת היא שהם משתפים פעולה עם חלבוני פקטורי שעתוק קושרי דנ"א הקושרים את האנזימים האלה ומכוונים אותם למטרות הכרומטין שלהם. באופן ספציפי, בצמחים, מספר אנזימים עיקריים המשנים את ההיסטון (כלומר, היסטון מתיל-טרנספראזות8,9, היסטון אצטילטרנספראזות 10, היסטון דמתילאזות 11, וקומפלקסים מדכאים של פוליקומב12,13,14) ידועים כמגויסים על ידי גורמי שעתוק. בהתאם לרעיון זה, לאחרונה, הוצע מנגנון אפשרי אחד לגיוס OTLD1 למקדמי היעד המבוסס על אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות של OTLD1 עם גורם שעתוק LSH1015.

LSH10 שייך למשפחה של חלבוני ALOG צמחיים (Arabidopsis LSH1 ו-Oryza G1) המתפקדים כמווסתי התפתחות מרכזיים 16,17,18,19,20,21,22. העובדה שחברי משפחת חלבוני ALOG מכילים מוטיבים קושרי דנ"א 23 ומציגים את היכולות של תקנת שעתוק22, לוקליזציה גרעינית19 והומודימריזציה24 תומכת עוד יותר ברעיון שחלבונים אלה, כולל LSH10, עשויים לפעול כגורמי שעתוק ספציפיים במהלך ויסות אפיגנטי של שעתוק. אחת הטכניקות הניסוייות העיקריות המשמשות לאפיון אינטראקציית LSH10-OTLD1 in vivo היא העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET)15.

FRET היא טכניקת הדמיה לגילוי ישיר של אינטראקציות קרובות טווח בין חלבונים בטווח של <10 ננומטר זה מזה25 בתוך תאים חיים. ישנן שתי וריאציות עיקריות של גישת FRET26: פליטה רגישה (SE-FRET) (איור 1A) והלבנה מקבלת (AB-FRET) (איור 1B). ב-SE-FRET, החלבונים המקיימים אינטראקציה - אחד מהם מתויג עם פלואורוכרום תורם (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) והשני עם פלואורוכרום מקבל (למשל, חלבון פלואורסצנטי אדום מונומרי, mRFP27,28) - מעבירים באופן לא רדיאטיבי את אנרגיית המצב הנרגש מהתורם למקבל. מאחר שלא נפלטים פוטונים במהלך העברה זו, נוצר אות פלואורסצנטי בעל ספקטרום פליטה רדיאטיבי הדומה לזה של המקבל. ב-AB-FRET, אינטראקציות חלבונים מזוהות ומכומתות על סמך פליטה רדיאטיבית מוגברת של התורם כאשר המקבל מושתק לצמיתות על ידי פוטו-הלבנה, ולכן אינו מסוגל לקבל את האנרגיה הלא-רדיאטיבית המועברת מהתורם (איור 1). חשוב לציין שהמיקום התת-תאי של פלואורסצנציה FRET מעיד על לוקליזציה של החלבונים המקיימים אינטראקציה בתא.

היכולת לפרוס FRET ברקמות חיות ולקבוע את הלוקליזציה התת-תאית של החלבונים המקיימים אינטראקציה בו זמנית עם גילוי אינטראקציה זו כשלעצמה, הופכת את FRET לטכניקה המועדפת למחקרים ולאפיון ראשוני של אינטראקציות חלבון-חלבון in vivo. מתודולוגיית הדמיה פלואורסצנטית דומה in vivo, השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC)29,30,31,32, היא גישה חלופית טובה, אם כי, בניגוד ל- FRET, BiFC עשויה לייצר תוצאות חיוביות כוזבות עקב הרכבה ספונטנית של כתבי BiFCהאוטומטיים 33, וכימות הנתונים שלה פחות מדויק.

מאמר זה משתף את הניסיון המוצלח ביישום טכניקות SE-FRET ו- AB-FRET ומציג פרוטוקול לפריסתן כדי לחקור את האינטראקציות בין OTLD1 ו- LSH10 בתאי צמחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניקוטיאנה בנתמיאנה, זן אגרובקטריום טומפצ'ינס EHA105, או GV3101 שימשו למחקר הנוכחי.

1. בניית וקטור FRET

  1. בחר תגי פלואורסצנט עבור זוג FRET התורם/מקבל.
    1. השתמש ב-EGFP מ-pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור את וקטור התורם.
    2. השתמש ב-mRFP מ-pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור את וקטור המקבל.
  2. צור את מבני FRET של התורם/מקבל באמצעות טכניקת שיבוט רקומבינציהספציפית לאתר 34, כגון מערכת שיבוט רקומבינציה של שער35.
    1. הגבר את רצפי הקידוד של החלבונים המעניינים36 (כלומר, Arabidopsis OTLD1 ו- LSH10)15.
      הערה: מומלץ גם להשתמש בבקרה שלילית המייצגת הומולוג של אחד החלבונים המקיימים אינטראקציה, אך אינה צפויה להפגין אינטראקציה; מחקר האינטראקציה OTLD1-LSH10 משתמש בהומולוג של LSH10, LSH4, שאינו מזהה OTLD1. ה-cDNAs OTLD1, LSH10 ו-LSH4 מוגברים על-ידי PCR באמצעות פריימרים המפורטים בטבלה 1.
    2. שיבוט OTLD1, LSH10 ו - LSH4 לתוך וקטור הכניסה pDONR207 על ידי טכניקת שיבוט רקומבינציה ספציפית לאתר34.
    3. השתמש בשער LR Clonase II (ראה טבלת חומרים) כדי להעביר את LSH10 ו- LSH4 מ- pDONR207 לווקטור היעד הבינארי pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 כדי ליצור את מבני התורם הבינאריים p35S::LSH10-GFP (מבנה נבדק) ו- p35S::LSH4-GFP (בקרה שלילית).
    4. השתמש באותו אנזים זמין מסחרית (שלב 1.2.3) כדי להעביר את OTLD1 מ- pDONR207 לווקטור היעד הבינארי pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 כדי ליצור את מבנה המקבל הבינארי p35S:: OTLD1-mRFP (מבנה שנבדק).
    5. PCR-הגבר36 mRFP מ- pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 באמצעות פריימרים המפורטים בטבלה 1, שכפל אותו על ידי טכניקת שיבוט רקומבינציה ל- pDONR207, ולאחר מכן השתמש ב- LR Clonase II כדי להעביר mRFP ל- pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 כדי ליצור את מבנה ההיתוך הבינארי p35S::mRFP-GFP (בקרה חיובית).
  3. לבצע טרנספורמציה של התורם ומקבל מבנים לתוך אגרובקטריום.
    1. יש להוסיף 1 מיקרוגרם מכל פלסמיד משלבים 1.2.3-1.2.5 עד 100 μL של תרבית התאים המוסמכים של זן אגרובקטריום טומפצ'ינס EHA105 או GV3101, שהוכן באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 37 או הושג באופן מסחרי, ודגירה בטמפרטורה של37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. הוסיפו 1 מ"ל של LB בינוני (1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים ו-1% NaCl; ראו טבלת חומרים) לתערובת התאים המתאימה, והתסיסו ב-200 סל"ד ו-28 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 × גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
    3. החזירו את התאים למדיום LB של 0.1 מ"ל על ידי פיפטינג והפיכתם על גבי LB agar בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה (למשל, 0.01% ספקטינומיצין ו-0.005% ריפאמפיצין; ראו טבלת חומרים). לגדול ב 28 °C במשך 2 ימים.
    4. בחרו מושבות בודדות וחסנו כל אחת מהן בנפרד ל-1 מ"ל של מרק LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה.
    5. לגדל את התאים ב 28 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ולהעביר 0.2 מ"ל של התרבית לתוך צינור חדש. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
    6. חלצו דנ"א פלסמיד על פי פרוטוקול סטנדרטי לבידוד פלסמידים מתאי אגרובקטריום 38 והחזירו את הדנ"א שחולץב-30 מיקרון מים. כדי לזהות את המושבות שבהן נמצאים הפלסמידים הרצויים, השתמש ב-2 μL של הכנת הדנ"א כתבנית ל-PCR עם פריימרים ספציפיים לגנים המפורטים בטבלה 1. מערבבים 0.7 מ"ל של התרבות המזוהה עם 0.3 מ"ל של גליצרול ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס.

2. הסתננות אגרואינפורמציה

  1. לגדל צמחי ניקוטיאנה בנתמיאנה .
    הערה: לאורך כל הניסוי, כל הצמחים חייבים להיות בריאים.
    1. לזרוע ולגדל זרעי N. benthamiana בעציץ המכיל אדמה רטובה בצפיפות גבוהה.
    2. שמור את הזרעים הנטועים בתא גידול שנקבע על 23 מעלות צלזיוס עם 16 שעות של אור ו 8 שעות של מחזור כהה עם 150-170 μmol/m2שניות עוצמת אור עד קוטר של euphyll מגיע 0.5 ס"מ.
    3. מעבירים את השתילים לעציצים גדולים יותר ומאפשרים להם לגדול באותו תא עם אותם פרמטרים.
      הערה: צמחים מוכנים לחדירה חקלאית כאשר העלים הגדולים ביותר שלהם הם בקוטר 5-7 ס"מ, בדרך כלל תוך 4-5 שבועות. בצמחים קטנים יותר שהם צעירים מדי, ההשפעות של חדירת אגרואינפורמציה יהיו חמורות מדי לניתוח FRET.
  2. הכן תאי חיידקים עבור agroinfiltration.
    1. לגדל כל מושבת אגרובקטריום המכילה את מבני FRET למשך הלילה ב-5 מ"ל של מדיום LB בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה (שלב 1.3.3) ו-150 μM אצטומסירינגטון בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים).
    2. צנטריפוגה של התאים ב 3,000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. השהה את התאים במאגר חדירת אגרואינפורמציה (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM acetosyringone) ל- OD600 = 0.5.
    4. שלב את התאים המחודשים ביחס V/V של 1:1 בין תאים בעלי המבנים המתאימים (שלב 2.2.5).
    5. עבור חדירות אגרו-קונסטרוקטיביות כפולות, ערבבו את האליקוטים של שתי תרבויות, ועבור חדירות אגרו-חדירות חד-מבנה, ערבבו את האליקוטים של אותה תרבות:
      1. חלבונים שנבדקו: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (חיידקים המאחסנים את מבני p35S::OTLD1-mRFP ו-p35S::LSH10-GFP).
      2. בקרה שלילית: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (חיידקים המאחסנים את מבנה p35S::OTLD1-mRFP ו-p35S::LSH4-GFP).
      3. בקרה שלילית: LSH10-GFP + mRFP חופשי (חיידקים המאחסנים את מבני p35S::LSH10-GFP ו-pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. בקרה חיובית: mRFP-GFP (חיידקים הנושאים את מבנה p35S::mRFP-GFP).
    6. דגירה של התאים ב 28 מעלות צלזיוס במשך 0.5-1 שעות.
  3. בצע אגרואינפורמציה.
    1. טען את תרבית החיידקים לתוך מזרק 1 מ"ל ללא מחט.
    2. לחץ בעדינות אך בחוזקה על פיית המזרק כנגד הצד האבקסיאלי של עלי N. benthamiana המורחבים במלואם תוך החזקת העלה עם אצבע כפפות בצד האדאקסיאלי.
    3. מסתננים עד ארבעה כתמים על עלה, שלושה עלים לצמח, שניים או שלושה צמחים לכל תרבית חיידקים. החלף כפפות בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב.
    4. שמור על הצמחים האגרו-חדורים באותו תא גידול באותם תנאים, כמתואר בשלב 2.1.2, למשך 24 שעות עד 36 שעות. אין לשמור את הצמחים האגרו-חדורים למשך יותר מ-36 שעות, מכיוון שהדבר יפחית את אות הפלואורסצנציה.

3. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. הכן שקופיות מיקרוסקופ להדמיה פלואורסצנטית.
    1. לאחר 24-36 שעות של חדירה, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך כל עלה אגרו-חדור לחתיכות קטנות (2 מ"מ x 4 מ"מ) בין הוורידים.
    2. הניחו את חתיכות העלים על מגלשת זכוכית כשמשטח העלה האבקסיאלי פונה כלפי מעלה. מניחים טיפת מים על חתיכות העלים ומכסים אותם בכוס הכיסוי. הקישו קלות על הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר.
    3. הפעל את המיקרוסקופ והלייזר (ראה טבלת חומרים). מקם את השקופית במחזיק שלב המיקרוסקופ לצורך הדמיה תחת הפרמטרים הספציפיים של FRET (שלבים 3.2 ו-3.3).
    4. התחל את התצפיות באמצעות עדשת מטרה של פי 10 כדי לזהות תאים המציגים הן את אותות ה-GFP והן את אותות ה-mRFP, ולאחר מכן השתמש בעדשה אובייקטיבית של פי 40 לתצפיות מפורטות לאחר מכן.
      הערה: חשוב לציין, SE-FRET ו-AB-FRET מבוצעים בדרך כלל על אותה דגימת רקמה, ומאפשרים שימוש באותן הגדרות ערוץ (שלב 3.2) למעט ערוץ FRET, אשר מופעל/כבוי עבור תצפיות SE-FRET ו-AB-FRET, בהתאמה (שלבים 3.2.2.3 ו-3.3.1).
  2. הגדר את הפרמטרים עבור SE-FRET (איור 1A).
    1. פתח את הכלי רכישה רב-ממדית (MDA).
    2. צרו קבוצה של שלושה ערוצים קונפוקליים באותו שדה ראייה (איור משלים 1).
      1. הגדר את ערוץ התורם (ערוץ GFP) לעירור ופליטה של פלואורוכרום התורם באמצעות לייזר עירור של 405 ננומטר ומסנן פליטה של 400-597 ננומטר.
      2. הגדר את ערוץ המקבל (ערוץ mRFP) לעירור ופליטה של הפלואורוכרום המקבל באמצעות לייזר עירור של 561 ננומטר ומסנן פליטה של 400-597 ננומטר.
        הערה: מסנן הפליטה עבור mRFP נקבע על 400-597 ננומטר כדי להפריד את אות ה-mRFP מהאות FRET ב-597-617 ננומטר (שלב 3.2.2.3), ולכן להפחית את פליטת ה-mRFP שאינה תלויה ב-FRET.
      3. הגדר את ערוץ FRET לעירור התורם והפליטה של הפלואורוכרומים המקבלים באמצעות לייזר עירור של 405 ננומטר ומסנן פליטה של 597-617 ננומטר.
    3. הגדר את עוצמת העירור של התורם ברמה מינימלית כדי לצפות ב- FRET תוך הימנעות מהלבנת תמונות, תוך הפחתת יעילות SE-FRET.
      הערה: עוצמת עירור זו נבחרת בניסוי לפני ביצוע הליך FRET כדי למנוע הלבנת תמונות. הוא משתנה בהתאם לעובי העלה, לגיל ולזמן שלאחר ביטוי יתר.
    4. לעורר את התורם ולסרוק אחר תאים המכילים את האות הפלואורסצנטי הצפוי של המקבל.
    5. בחר את האזור המכיל את אות העניין הפלואורסצנטי.
    6. רכוש רצף תמונות SE-FRET על-ידי לחיצה על לחצן הצמדה .
      1. תמונה 10-15 תאים המבטאים תחילה את מבנה mRFP-GFP (בקרה חיובית); התאימו את הפרמטרים של המיקוד, הזום והרווח החכם כדי להתמקד באזור העניין שיש ללכוד (איור משלים 2).
      2. באמצעות אותן הגדרות, תמונה 10-15 תאים, כל אחד מבטא OTLD1-mRFP, mRFP חינם, LSH10-GFP, או LSH4-GFP בנפרד.
        הערה: תמונות אלה נרכשות על-ידי התוסף "PixFRET" של ImageJ (ראה טבלת חומרים), ששימש לניתוחי הנתונים של FRET (שלב 3.4.1) כדי לקבוע את ערכי הגלישה הספקטרלית (SBT) עבור המקבלים והתורמים; תמונות אלה משמשות את התוכנה ליצירת תמונות SE-FRET עבור OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP, ו- LSH10-GFP + זוגות חלבוני mRFP חופשיים (שלב 3.2.6.3).
      3. כמו כן, באמצעות אותן הגדרות, תמונה 10-15 תאים המבטאים במשותף OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP, ו- LSH10-GFP + זוגות חלבוני mRFP חופשיים.
  3. הגדר פרמטרים עבור AB-FRET (איור 1B).
    1. השתמש בפרמטרים של ערוץ התורם ומקבל שהוגדרו עבור SE-FRET (שלב 3.2.2) אך כבה את ערוץ FRET.
    2. הגדר את הפרמטרים להלבנת תמונות של המקבל (mRFP) (איור משלים 3).
      1. ודאו שההלבנה מתחילה אחרי חמש תמונות. אפשר 200 איטרציות לכל אזור אקונומיקה. שמור על עוצמת לייזר של 100% ב-561 ננומטר.
      2. לשמור על משך הלבנה של 45 שניות. הבטח מהירות סריקה של 512 x 512 פיקסלים ב- 400 הרץ.
    3. צייר את האזור של התא להיות מולבן; לדוגמה, עבור אינטראקציות גרעיניות, אזורי עניין נמשכים סביב כל האזור של גרעין התא39.
    4. הפעל הלבנה על ידי לחיצה על לחצן התחל ניסוי ; הפעלת פונקציה זו תבצע את ההלבנה ולרכוש את רצף התמונות AB-FRET.
  4. נתח את נתוני FRET.
    1. לניתוח נתוני SE-FRET, השתמש בתוסף "PixFRET" עבור תוכנת ImageJ כדי ליצור תמונות מתוקנות של יעילות SE-FRET לאחר הפחתת SBT40 (שלב 3.2.6.2).
    2. לניתוח נתוני AB-FRET, חשב את %AB-FRET כעלייה באחוזים בפליטת GFP לאחר הלבנת תמונות mRFP באמצעות הנוסחההבאה 41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, כאשר GFPpost הוא פליטת GFP לאחר הלבנת תמונות mRFP, ו- GFPpre הוא פליטת GFP לפני הלבנת תמונות mRFP.
    3. בעת סקירת תמונות FRET, שים לב ללוקליזציה התת-תאית של אות FRET.
      הערה: במקרים רבים, ניתן לזהות בקלות את התאים הללו (למשל, גרעין, כלורופלסטים, ER וכו'), וכיתרון נוסף של טכניקת FRET, הם מספקים רמזים חשובים לתפקוד הביולוגי של החלבונים המקיימים אינטראקציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 ממחיש את התוצאות האופייניות של ניסוי SE-FRET, שבו גרעיני התא תועדו בו-זמנית בשלושה ערוצים (כלומר, תורם GFP, mRFP מקבל ו-SE-FRET). נתונים אלה שימשו ליצירת תמונות של יעילות SE-FRET המקודדות בסולם צבעים מדומה. בסולם זה, המעבר מכחול לאדום מתאים לעלייה ביעילות FRET, מדד של קרבה חלבון-חלבון מ -0% ל -100%. בניסוי מייצג זה, אות SE-FRET נרשם בגרעין התא, ועוצמתו לאחר הביטוי של LSH10 ו- OTLD1 הייתה דומה לזו שנצפתה לאחר הביטוי של mRFP-GFP (כלומר, בקרה חיובית). לא נצפתה SE-FRET בבקרות שליליות (כלו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול FRET זה פשוט וקל לשחזור; זה גם דורש השקעת אספקה מינימלית ומנצל ציוד סטנדרטי עבור מעבדות מודרניות רבות. באופן ספציפי, חמש תכונות טכניות עיקריות מבדילות את הרבגוניות של הליך זה. ראשית, מבני FRET נוצרים באמצעות רקומבינציה ספציפית לאתר, גישת שיבוט קלה לשימוש, מפיקה תוצאות מדויקות וחוסכת זמן בהשוואה לשיבוט מסורתי המבוסס על אנזימי הגבלה. שנית, צמחי N. benthamiana פשוטים לגידול, מייצרים כמויות גדולות יחסית של רקמות וזמינים ברוב המעבדות. שלישית, חדירת אגרואינפורמציה גורמת לביטוי חולף של המבנים הנמסרים, ולכן מיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה במעבדה של V.C. נתמכת על ידי מענקים מ- NIH (R35GM144059 ו- R01GM50224), NSF (MCB1913165 ו- IOS1758046) ו- BARD (IS-5276-20) ל- V.C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוסירינגון (3&פריים;,5&פריים;-דימתוקסי-4&פריים;-הידרוקסיאצטופנון)סיגמא-אולדריץ'#D134406-1G
בקטו אגרBD Biosciences#214010
בקטו טריפטוןBD Biosciences#211705
תמצית שמרי בקטוBD Biosciences#212750 
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)ZeissLSM900כל CLSM עם יכולות דומות מתאים
EHA105VWR104013-310אנו משתמשים במלאי באוסף מלאי מעבדת החיידקים של Citovsky
Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296אנו משתמשים במלאי באוסף מלאי מעבדת החיידקים של Citovsky
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana זרעיםצמחיים PtyRA4 או LABאנו משתמשים במלאי באוסף מלאי מעבדת הזרעים של Citovsky
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/ARefs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/Aנוצר על בסיס מבנה pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (ראה הפניות 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/Aנוצר על בסיס מבנה pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
מזרקים ללא מחטיםתוכנת BD309659
Zen להדמיית CLSMגרסת ZeissZEN 3.0התוכנה צריכה להיות תואמת ל-CLSM בשימוש

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56(2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83(2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125(2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39(2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712(2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511(2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237(2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Histone Modifying EnzymesTranscription FactorsProtein Protein InteractionFluorescence Resonance EnergySE FRETAB FRETPlant LeavesAgroinfiltrationConfocal MicroscopyImageJ Analysis

מאמרים קשורים