פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים ליצירה ולאפיון אורגנואידים תלת-ממדיים אוראליים-ושטיים המייצגים נגעים נורמליים, פרה-נאופלסטיים ונגעי קרצינומה של תאי קשקש הנגרמים באמצעות קרצינוגנזה כימית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
קרצינומה של תאי קשקש בוושט (ESCC) נפוצה ברחבי העולם, ומהווה 90% מכלל מקרי סרטן הוושט מדי שנה, והיא הקטלנית ביותר מבין כל קרצינומות תאי הקשקש האנושיים. למרות ההתקדמות האחרונה בהגדרת השינויים המולקולריים המלווים את ההתחלה וההתפתחות של ESCC, הפרוגנוזה של המטופלים נותרה גרועה. הביאור הפונקציונלי של שינויים מולקולריים אלה הוא השלב הבא ההכרחי ודורש מודלים שגם לוכדים את התכונות המולקולריות של ESCC וגם ניתנים למניפולציה בקלות ובזול לביאור פונקציונלי. עכברים שטופלו בעשן טבק מחקה תחמוצת 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) באופן צפוי יוצרים ESCC ופרנאופלזיה של הוושט. יש לציין כי נגעים 4NQO מתעוררים גם בחלל הפה, לרוב בלשון, כמו גם בקדמת הבטן, אשר כולם חולקים את אפיתל הקשקש המרובד. עם זאת, לא ניתן פשוט לתמרן עכברים אלה לבדיקת השערות פונקציונליות, מכיוון שיצירת מודלים של עכברים איזוגניים דורשת זמן ומשאבים. כאן, אנו מתגברים על מגבלה זו על ידי יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בתא יחיד מעכברים שטופלו ב-4NQO כדי לאפיין תאי ESCC (ESCC) או תאים פרה-נאופלסטיים ex vivo. אורגנואידים אלה לוכדים את התכונות הבולטות של ESCC ופרנאופלזיה של הוושט, ניתן למנף אותם בזול ובמהירות ליצירת מודלים איזוגניים, וניתן להשתמש בהם לניסויי השתלה סינגניים. אנו מדגימים כיצד ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים מרקמת ושט רגילה, פרנאופלסטית ו-SCC מורין ולתחזק ולשמר בהקפאה אורגנואידים אלה. היישומים של אורגנואידים מגוונים אלה הם רחבים וכוללים שימוש בעכברים מהונדסים גנטית ואפיון נוסף על ידי ציטומטריית זרימה או אימונוהיסטוכימיה, יצירת קווי אורגנואידים איזוגניים באמצעות טכנולוגיות CRISPR, וסינון תרופות או השתלות סינגניות. אנו מאמינים כי האימוץ הנרחב של הטכניקות המוצגות בפרוטוקול זה יאיץ את ההתקדמות בתחום זה כדי להילחם בנטל החמור של ESCC.
מבוא
קרצינומה של תאי קשקש בוושט (ESCC) היא הקטלנית ביותר מבין קרצינומות תאי הקשקש האנושיים, בשל האבחנה המאוחרת שלה, עמידות לטיפול וגרורות 1,2. ESCC נובע מאפיתל קשקשי מרובד, אשר מצפה את פני השטח הלומינליים של הוושט. אפיתל הקשקש מורכב מתאי בסיס מתרבים ותאים ממוינים בתוך שכבת התא העל-בסיסי. בתנאים פיזיולוגיים, תאי בסיס מבטאים סמנים כגון p63, Sox2 וציטוקרטין K5 ו-K14, בעוד שתאים ממוינים מבטאים K4, K13 ו-IVL. תאי הבסיס עצמם הם הטרוגניים וכוללים תאי גזע משוערים המוגדרים על ידי סמנים כגון K153 ו- CD734. בהומאוסטזיס, תאי הבסיס עוברים התמיינות טרמינלית פוסט-מיטוטית בתוך שכבת ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסויי המורין תוכננו ובוצעו בהתאם לתקנות ותחת פרוטוקול בעלי חיים #AABB1502, נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה. העכברים שוכנו במתקן ראוי לטיפול בבעלי חיים המבטיח טיפול הומני בעכברים ומספק טיפול וטרינרי הולם לעכברים והדרכות בטיחות מעבדה לאנשי המעבדה.
1. טיפול בעכברים עם 4NQO לגרימת נגעי IEN ו-ESCC בוושט (שיקול זמן: עד 28 שבועות)
הערה: כדי ליצור MEOs המייצגים נגעים ניאופלסטיים בוושט, העכברים נתונים למסרטן כימי בתיווך 4NQO כפי שתואר קודם לכן על ידי Tang et al.14. MEOs רגילים/לא ניאופלסטיים נוצרים מעכברים לא מטופלים.
- עכבר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מתאר את התהליך של יצירת אורגנואידים של הוושט (MEOs) מרקמת ושט רגילה או מרקמת גידול ESCC מעכברים שטופלו ב-4NQO בהתאם למשטר טיפול ספציפי המורכב מ-16 שבועות של 4NQO הניתנים במי שתייה, ולאחר מכן תקופת תצפית של 10 שבועות עד 12 שבועות (איור 1). לאחר מכן מרדימים את העכברים לצורך נתיחת הלשון או רקמת הוושט (איור 2 ואיור 3). אנו מתארים שיטה לבידוד שכבת האפיתל מהוושט השלם (איור 4) שתשמש לבידוד חד-תאי ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנם מספר שלבים ושיקולים קריטיים ליצירה וניתוח של MEOs בפרוטוקולים המתוארים כאן. כדי להבטיח יכולת שחזור וקפדנות בניסויי MEO, שכפולים ביולוגיים וטכניים חשובים שניהם. עבור שכפולים ביולוגיים, שניים עד שלושה עכברים עצמאיים הנושאים ESCC מספיקים בדרך כלל לכל תנאי ניסוי. עם זאת, המספר המתאים של שכפולים ביולוגיים עשוי להשתנות בהתאם לפרמטרים שייבדקו במחקרים בודדים. לדוגמה, כיום לא ידוע כמה מוקדם ובאיזו תדירות ניתן לזהות אורגנואידים ניאופלסטיים מעכברים שטופלו ב-4NQO ללא נגעים נראים לעין מקרוסקופיים או נגעים היסטולוגיים מסוג IEN ו-.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים למשאבים המשותפים (ציטומטריית זרימה, פתולוגיה מולקולרית ומיקרוסקופיה קונפוקלית ומיוחדת) במרכז הסרטן המקיף ע"ש הרברט אירווינג באוניברסיטת קולומביה על התמיכה הטכנית. אנו מודים לד"ר אלן דיהל, אדם ג'יי בס וד"ר קווק-קין וונג (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) ולחברי מעבדות Rustgi ו-Nakagawa על דיונים מועילים. מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH הבאים: P01CA098101 (H.N. ו- A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(י.ג.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. ו-H.N.) ו-P30CA013696....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.05% טריפסין-EDTA | תרמו פישר סיינטיפיק | 25-300-120 | |
| 0.25% טריפסין-EDTA | תרמו פישר סיינטיפיק | 25-200-114 | |
| 0.4% טריפאן כחול | תרמו פישר סיינטיפיק | T10282 | |
| 1 מ"ל מזרק טוברקולין ללא מחט | BD | 309659 | |
| 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה | תרמו פישר סיינטיפיק | 05-408-129 | |
| 100 ומיקרו; מסננת תאים m | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| צינורות חרוטיים 15 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 ומיקרו; L קצות מיקרופיפטה רחבות נשא | תרמו פישר סיינטיפיק | 212361A | |
| 21 גרם מחטים | BD | 305167 | |
| צלחת 24 בארות | תרמו פישר סיינטיפיק | 12-556-006 | |
| 4-ניטרוקווינולין-1-תחמוצת (4NQO) | טוקיו תעשייה כימית | NO250 | |
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים | תרמו פישר סיינטיפיק | 12-565-270 | |
| 6 באר צלחת | תרמו פישר סיינטיפיק | 12556004 | |
| 70 ומיקרו; מסננת תאים m | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% אתילן פרופילן גליקול | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | ריכוז מלאי 250 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 0.5 ומיקרו; גרם/מ"ל |
| אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית | תרמו פישר סיינטיפיק | 15240062 | ריכוז מלאי 100x, ריכוז סופי 1x |
| תוסף B-27 | תרמו פישר סיינטיפיק | 17504044 | ריכוז מלאי 50x, ריכוז סופי 1x |
| בקטו אגר | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, למשל Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | או שווה ערך |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | או שווה ערך |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | ריכוז מלאי 50 יח'/מ"ל, ריכוז סופי 2.5– 5 מספריים |
| לניתוח | VWR | 25870-002 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | ריכוז מלאי 1x |
| סרום בקר עוברי (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| מלקחיים | VWR | 82027-386 | |
| מיכל הקפאה | קורנינג | 432002 | או שווה ערך |
| ג'לטין | תרמו פישר מדעי | G7-500 | |
| GlutaMAX | תרמו פישר 35050061 מדעי | ריכוז מלאי 100x, ריכוז סופי 1x | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 ריכוז מלאי 1 M, ריכוז סופי 10 מ"מ | |
| פלטה חמה/בוחש | Corning | PC-420D | או מעבדה שווה ערך |
| אמבט חרוזי שריון (או אמבט מים) | VWR | 89409-222 | או שווה ערך |
| איזון מעבדה | Ohaus | 71142841 | או שווה ערך |
| תמצית קרום בסיס מטריג'ל (BME) | קורנינג | 354234 | |
| מיקרוצנטריפוגה Minispin | Eppendorf | 22620100 או שווה ערך | |
| מתלה צינור מיקרוצנטריפוגה | Southern Labware | 0061 | |
| תוסף N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | ריכוז מלאי 100x, ריכוז סופי 1x |
| N-אצטילציסטאין (NAC) | סיגמא-אולדריץ' | A9165 | ריכוז מלאי 0.5 M, ריכוז סופי 1 מ"מ |
| Parafilm M עטיפת | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| קלטת פתולוגיה | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| מיקרוסקופ ניגודיות פאזה | Nikon | או | |
| גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי שווה ערך (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | ריכוז מלאי 500 ng/µ L, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל |
| מדיום מותנה בתא RN המבטא R-Spondin1 ו-Noggin (RN CM) | N/A | N/A | זמין דרך ליבת האורגנואיד ותרבית התאים על פי בקשה, ריכוז סופי 2% |
| צנטריפוגה Sorval ST 16R Thermo | Fisher Scientific | 75004380 | או שווה ערך |
| מעכב טריפסין פולי סויה (STI) | MilliporeSigma | T9128 | ריכוז מלאי 250 ומיקרו; g/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | או שווה ערך |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ריכוז מלאי 10 מ"מ, ריכוז סופי 10 ומיקרו; מ |
מקורות
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
