הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64703

⸱

27 בינואר 2023

 ,  ,  , 
1ACA CELL Biotech GmbH, 2Departamento Ciencias Biomédicas, Universidad Cardenal Herrera-CEU

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה לא גנטית ליצירת ספרואידים אוטולוגיים אנושיים בכבד באמצעות תאים חד-גרעיניים שבודדו מדם היקפי במצב יציב.

תקציר

תאי כבד אנושיים יכולים ליצור מבנה תלת ממדי (3D) המסוגל לגדול בתרבית במשך כמה שבועות, תוך שמירה על יכולתם התפקודית. בשל טבעם להתקבץ בתרבית צלחות בעלות תכונות דבק נמוכות או ללא תכונות דבק, הם יוצרים צברים של תאי כבד מרובים הנקראים ספרואידים של כבד אנושי. היווצרותם של ספרואידים תלת-ממדיים בכבד מסתמכת על הנטייה הטבעית של תאי הכבד להצטבר בהיעדר מצע דביק. למבנים תלת-ממדיים אלה יש תגובות פיזיולוגיות טובות יותר מאשר לתאים, הקרובים יותר לסביבה in vivo . לשימוש בתרביות הפטוציטים תלת-ממדיות יש יתרונות רבים בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) קלאסיות, כולל מיקרו-סביבה רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית, מורפולוגיה אדריכלית המרכיבה מחדש איברים טבעיים, כמו גם חיזוי טוב יותר לגבי מצב המחלה ותגובות דמויות in vivo לתרופות. מקורות שונים יכולים לשמש ליצירת ספרואידים, כמו רקמת כבד ראשונית או קווי תאים אימורטליים. ניתן להנדס את רקמת הכבד התלת-ממדית גם באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) כדי להפיק הפטוציטים. השגנו ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) המופקים מדם היקפי ללא מניפולציה על ידי הפעלת חלבון הקשור לקרום אנושי הקשור ל- GPI ומובחן להפטוציטים אנושיים. תאי כבד אנושיים שמקורם ב-BD-PSCs וספרואידים של כבד אנושי נותחו במיקרוסקופ אור ואימונופנוטיפ באמצעות סמני כבד אנושיים.

מבוא

בשנים האחרונות מערכות תרבית ספרואידים תלת-ממדיות (3D) הפכו לכלי חשוב לחקר תחומים שונים של חקר סרטן, גילוי תרופות וטוקסיקולוגיה. תרביות כאלה מעוררות עניין רב משום שהן מגשרות על הפער בין חד-שכבות דו-ממדיות (2D) של תרביות תאים לבין איברים מורכבים1.

בהיעדר משטח דביק, בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית, היווצרות הספרואידים מבוססת על הזיקה הטבעית של תאים אלה להתקבץ בצורה תלת-ממדית. תאים אלה מתארגנים לקבוצות המורכבות מסוג אחד או יותר של תאים בוגרים. ללא חומרים זרים, תאים אלה מתקשרים זה עם זה כמו במיקרו-סביבה המקורית שלהם. התאים בתרבית תלת-ממדית קרובים הרבה יותר ובעלי אוריינטציה נכונה זה כלפי זה, עם ייצור מטריצה חוץ-תאית גבוה יותר מאשר תרביות דו-ממדיות, ומהווים סביבה טבעית קרובה 2.

מודלים של בעלי חיים שימשו במשך זמן רב לחקר ביולוגיה אנושית ומחלות3. בהקשר זה, ישנם הבדלים מהותיים בין בני אדם לבעלי חיים, מה שהופך מודלים אלה לא לגמרי מתאים למחקרים אקסטרפולטיביים. ספרואידים ואורגנואידים בתרבית תלת-ממדית מהווים כלי מבטיח לחקר ארכיטקטורה דמוית רקמה, אינטראקציה והצלבה בין סוגי תאים שונים המתרחשים in vivo ויכולים לתרום להפחתה או אפילו להחלפה של מודלים של בעלי חיים. הם מעניינים במיוחד לחקר הפתוגנזה של מחלות כבד, כמו גם פלטפורמות סינון תרופות4.

תרבית ספרואידים תלת-ממדית היא בעלת חשיבות מיוחדת לחקר הסרטן מכיוון שהיא יכולה לחסל את חוסר הרציפות בין התאים לסביבתם על ידי הפחתת הצורך בטריפסיניזציה או בטיפול בקולגנאז הדרוש להכנת חד-שכבות תאי הגידול לתרביות דו-ממדיות. ספרואידים סרטניים מאפשרים לחקור כיצד תאים נורמליים לעומת תאים ממאירים מקבלים ומגיבים לאותות מסביבתם5 והם חלק חשוב בלימודי ביולוגיה של גידולים.

בהשוואה לחד-שכבתיות, תרביות תלת-ממדיות המורכבות מסוגי תאים שונים דומות לרקמות הגידול בתכונותיהן המבניות והתפקודיות ולכן מתאימות לחקר גרורות ופלישה של תאי גידול. זו הסיבה שמודלים ספרואידים כאלה תורמים להאצת חקר הסרטן6.

ספרואידים גם עוזרים לפתח את הטכנולוגיה ליצירת אורגנואידים אנושיים מכיוון שביולוגיה של רקמות ואיברים מאתגרת מאוד למחקר, במיוחד בבני אדם. התקדמות בתרבית תאי גזע מאפשרת לפתח תרביות תלת ממדיות כמו אורגנואידים המורכבים מתאי גזע ואבות רקמות, כמו גם סוגים שונים של תאים בוגרים (רקמות) מאיבר עם כמה מאפיינים פונקציונליים כמו איבר אמיתי שניתן להשתמש בו כדי למדל התפתחות איברים, מחלות, אבל הם גם יכולים להיחשב שימושיים ברפואה רגנרטיבית7.

הפטוציטים אנושיים ראשוניים משמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה חוץ גופית של הפטוציטים אנושיים, תפקוד כבד ורעילות הנגרמת על ידי תרופות. לתרביות של הפטוציטים אנושיים יש שני חסרונות עיקריים, ראשית, הזמינות המוגבלת של רקמה ראשונית כמו הפטוציטים אנושיים, ושנית, הנטייה של הפטוציטים להתמיין במהירות בתרבית דו-ממדית ובכך לאבד את פונקציית הפטוציטים הספציפית שלהם8. תרביות כבד תלת-ממדיות הן טובות יותר בהקשר זה, ולאחרונה נוצרו מתאי גזע עובריים אנושיים ממוינים (hESCs) או מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs)9. ספרואידים תלת-ממדיים מהונדסים ביולוגית בכבד מעניינים במיוחד בחקר התפתחות, רעילות, מחלות גנטיות וזיהומיות של הכבד, כמו גם בגילוי תרופות לטיפול במחלות כבד10. לבסוף, יש להם גם פוטנציאל לשימוש קליני, בידיעה שלמחלות כבד חריפות יש שיעור תמותה של כמעט 80%, כבד ביו-מלאכותי ו / או ספרואידים בכבד יכולים להציל חולים אלה על ידי מתן תפקוד כבד חלקי עד שניתן למצוא תורם מתאים11.

קבענו פרוטוקול ליצירת ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) להכנת ספרואידים בגדלים שונים המכילים 4000 עד 1 x 106 תאים וניתחנו אותם באמצעות מיקרוסקופ אור ואימונופלואורסנציה. בדקנו גם את היכולת של תפקוד ספציפי לכבד, והערכנו את הביטוי של אנזימי ציטוכרום P450 3A4 (CYP3A4) ו-2E1 (CYP2E1) השייכים למשפחת הציטוכרום P450 שיש להם תפקידים חשובים במטבוליזם של תאים ותרופות באמצעות תהליך של ניקוי רעלים12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

התקבל אישור אתי (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) לביצוע ניסויים אלה והסכמה מדעת נחתמה על ידי כל התורמים לפני שאיבת הדם בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. הכנת תאים חד-גרעיניים (MNCs) מדם היקפי אנושי (PB)

  1. לחלץ 30 מ"ל דם מתורמים בריאים בעזרת צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.
  2. בודד PBMNCs באמצעות מדיה שיפוע צפיפות על פי הפרוטוקול שפורסם על ידי Becker-Kojić et al.13. בודדו, על ידי פיפטינג, את שכבת הביניים בין פלזמה ומדיה הדרגתית צפיפות והשתמשו במי מלח חיץ פוספט סטריליים (PBS) כדי לשטוף את התאים המבודדים.
  3. השתמש בתא ספירה וספור את מספר התאים בשיטות סטנדרטיות.

2. דיפרנציאציה של MNCs עם הפעלה עם גליקופרוטאין מעוגן GPI אנושי

  1. מניחים 6 x 106 תאים חד-גרעיניים באלבומין בסרום PBS / 1% בקר (BSA) בצינור פוליסטירן (15 מ"ל) ודגורים עם הנוגדן הספציפי למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על פי Becker-Kojić et al.13.
  2. צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר ולהחליף PBS / BSA עם מדיום Dulbecco של Iscove בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).
  3. לגדל את התאים בצינורות פוליסטירן 15 מ"ל באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C במשך 8-10 ימים כמתואר Becker-Kojić et al.13. ביום 5 (D5), הוסף 1-2 מ"ל של מדיום Iscove בתוספת 10% FBS לכל צינור 15 מ"ל.

3. מיון של תאים חדשים שנוצרו dedifferentiated

  1. תרחיף תאים בתרבית צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 300 x גרם ושואף עם פיפטה סטרילית את supernatant שנוצר על פי Becker-Kojić et al.13.
  2. גלולת השהיה המתקבלת על ידי צנטריפוגה ב-90 מיקרוליטר של חיץ PBS קר (PBS pH 7.2, 0.5% BSA ו-2 mM EDTA) ומוסיפים 10 μL של CD45 חרוזים מגנטיים חיוביים בגודל ננומטרי ודגרים על קרח למשך 15 דקות.
  3. שטפו את מתלה התא עם 2 מ"ל של חיץ PBS, צנטריפוגו אותו ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והוסיפו 500 μL של חיץ PBS לתאים והשהו מחדש ביסודיות.
  4. פיפטה 500 μL של חיץ PBS מקורר מראש לתוך העמוד כדי לשטוף ולמקם אותו בשדה המגנטי באמצעות מעמד מגנטי.
  5. שטפו את התאים שהונחו על העמודה, פעמיים עם 500 μL של חיץ PBS ואספו זרימה המכילה תאים שליליים CD45 בתווך של Iscove בתוספת 10% FBS.
  6. השתמש בתא ספירה כדי לקבוע את מספר התאים שתוכנתו מחדש.

4. הכנת כיסויי זכוכית לדור הפטוציטים האנושיים

  1. יש להפריד את כיסויי הזכוכית (14 מ"מ) ולדגור עליהם בחומר ניקוי לא יוני למשך 10 דקות. שטפו את כיסויי הזכוכית במים נטולי יונים, עד שלא יישארו בועות, ודגרו עליהם ב-1M HCl למשך 30 דקות (מעובד מ-Marchenko et al.14).
  2. יש לשטוף את כיסויי הזכוכית במים נטולי יונים, לפחות 3 פעמים ולייבש אותם למשך הלילה בטמפרטורת החדר. זכוכית מיובשת Autoclave מכסה במיכל מתאים.

5. ציפוי לוחות תרבית תאים עם biolaminin עבור התמיינות כבד 2D של BD-PSCs

  1. הניחו את כיסויי הזכוכית האוטומטיים עם זוג פינצטות סטריליות ב-4 צלחות באר והדליקו את אורות ה-UV למשך 30 דקות כדי להבטיח תנאים סטריליים.
  2. הפשירו אליציטוטים של ביולמינין והוסיפו 120 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל ביולמינין לכל החלקת כיסוי זכוכית. השאירו את כיסויי הזכוכית המצופים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  3. הסר את עודף של biolaminin ולהוסיף 200 μL של מדיום התמיינות hepatocyte כמתואר להלן.

6. הכנת מדיה הבחנה hepatocyte

  1. ייצור 500 מ"ל של תחליפי סרום נוקאאוט הפטובלסטים (KSR)/דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בינוני המורכב מ-76.4% נוקאאוט DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0.5% L-גלוטמין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.1% β-מרקפטואתנול, 1% DMSO ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen/Strep).
  2. הכינו 500 מ"ל של מדיום הבשלת הפטוציטים המכיל 1% L-גלוטמין, 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-המיסוקצינאט נתרן מלח (HCC) ו-1% עט/סטרפ.
  3. Aliquot בינוני מהמלאי ולהוסיף גורם גדילה הפטוציטים טרי (HGF) ו oncostatin M (OSM) בריכוזים סופיים של 10 ng / mL ו / או 20 ng / mL עבור כל שינוי בינוני.
    הערה: Oncostatin M הוא ציטוקין השייך לקבוצת הציטוקינים interleukin 6, חשוב להמטופויזיס כמו גם להתפתחות הכבד.

7. גידול תאי כבד ממוינים מ- BD-PSCs

  1. שים 3 x 105 תאי BD-PSCS לתוך כל באר של צלחת 4 באר מצופה biolaminin.
  2. מניחים את לוחות 4 בארות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2. תרבית את התאים במשך 5 ימים בתווך הפטובלסטים KSR/DMSO התומך בהתמיינות אנדודרמלית ושנה את המדיום כל יומיים.
  3. עברו למדיום הבשלת הפטוציטים ביום 5 ותרבו את התאים למשך 7-10 ימים נוספים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. שנה את המדיום כל 48 שעות.

8.3D התמיינות כבדית ספרואידית

  1. ספירת תאים באמצעות תא ספירה.
  2. צנטריפוגה BD-dedifferentiated תא השעיה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר supernatant והשהה מחדש תאים ללא התמיינות BD בתווך KSR/DMSO ב- 2 x 106 תאים/מ"ל.
  3. העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להבטיח תרחיף חד-תאי ולהסיר פסולת נוספת.
  4. ספרו תאים באמצעות תא ספירה והכינו נפח מספיק לכל צפיפות זריעה של תא על מנת לחלק את הנפח הנדרש לכל באר. הכינו שיפוע עם זריעה עליונה של 1 x 106 תאים לצפיפות זריעה נמוכה של 4000 תאים.
  5. יש להוציא 100 μL של KSR/DMSO בינוני ב-96 לוחות חיבור נמוכים היטב ולהוסיף 100 μL של דילול זריעת תאים.
  6. מניחים צלחת חיבור נמוכה באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 ו תרבית אותם במשך 5 ימים.
  7. שנה 50% מהתווך מימים 3-4 לאחר הזריעה כאשר הספרואידים קומפקטיים מספיק.
  8. ביום 5, לשנות את המדיום כדי hepatocyte התבגרות המדיום ואת תרבית התאים במשך 7-10 ימים נוספים להבשלה נוספת. החליפו את המדיום כל יומיים.

9. ניתוח אימונופלואורסנציה של תרביות תאי כבד דו-ממדיות שנוצרו לאחרונה

  1. תרבית את התאים בשיטת ההתמיינות שתוארה לעיל במשך 4, 8, 15 ו-24 ימים ותוציא מדיה.
  2. לדגור על תאים עם קיבוע שחומם מראש המורכב מ-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות. השליכו את הקיבוע ושטפו את התאים 2x עם PBS למשך 5 דקות כל אחד. הוסף מיד תמיסת טריטון X-100 0.1% וחדיר את התאים למשך 5 דקות. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
  3. הוסף תמיסת חסימה העשויה PBS ו- 5% BSA והנח על צלחת נדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. דילול נוגדנים ראשוניים במאגר דילול 1% BSA/PBS כדלקמן: אלבומין (ALB) 1:50, חלבון עוברי אלפא-1 (AFP) 1:250, ציטוקרטין 18 (CK18) 1:50, פקטור גרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) 1:1000 וטרנסתירטין (TTR) 1:50. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר.
  5. לדגור על התאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השליכו את תמיסת הנוגדנים, שטפו את התאים במשך 5 דקות וחזרו על שלב השטיפה 3x.
  6. הכינו את הנוגדנים המשניים הבאים במאגר דילול: ארנב נגד עוף IgG (אדום טקסס) 1:1000, עיזים נגד עכבר IgG (488) 1:1000, ועז נגד ארנב (488) 1:500. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר לדגור את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. שטפו את התאים 3x עם PBS במשך 5 דקות כל אחד והרכיבו את הכיסויים עם מדיית הרכבה המכילה DAPI לניתוח מיקרוסקופי.

10. צביעה חיה של ספרואידים חדשים שנוצרו בכבד

  1. יש להשליך בזהירות את אמצעי התרבית מבלי לגעת בכדורים, להוסיף PBS טרי עם תמיסת 0.1% טריטון X-100, ולדגור במשך 5 דקות כדי לחדור לתאים.
  2. שטפו את הספרואידים עם המדיום על ידי פיפטינג איטי במשך 5 דקות, חזרו על הפעולה 2x.
  3. לדגור על הספרואידים עם הנוגדנים העיקריים ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) ו-CYP3A4 (1:200) שהוכנו ב-PBS עם 1% BSA למשך שעה אחת באינקובטור CO2 של 5% ב-37°C. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר.
  4. בזהירות להסיר את תמיסת נוגדנים עודף לשטוף את spheroids עם בינוני 3x.
  5. הכינו את הנוגדנים המשניים המתאימים IgG נגד עכבר (Cy3), IgG נגד עכבר עיזים (488), וארנב נגד עוף IgG (אדום טקסס) בדילול של 1:1000 ו-1:500 נגד ארנב עיזים (488) ב-PBS ב-1% BSA. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר לדגור במשך 20 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.
  6. בזהירות לשטוף 3x עם בינוני ולהשאיר את הצלחת במשך 30 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 לפני ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

11. בדיקת ספרואידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי 10 דקות לפני השימוש, הפעל את המחשב ופתח את תוכנת ההדמיה.
  2. השתמש במטרה עם הגדלה 4x, לחץ על כפתור 4x בסרגל הכלים כדי לבחור את סרגל קנה המידה הנכון, ולאחר מכן הנח את צלחת 96 באר על הצלחת במרכז הבמה.
  3. הפעל את מקור תאורת ה- LED, השתמש במסנן brightfield ומקם את הצלחת לבאר המעניינת באמצעות ידית הכוונון של שלב ציר x-y.
  4. שנה לנתיב תאורת המצלמה, לחץ על הלחצן Live in תוכנת הדמיה כדי להמחיש את התמונה על המסך, ולוודא שהספרואיד ממורכז באמצעות ידיות ציר ה-x ולהתמקד באמצעות ידית המיקוד הגס/עדין.
    הערה: צורת הספרואידים נשארת קבועה לאחר מריחת כתמים חיים.
  5. בחרו בשיטת Brightfield Observation בסרגל הכלים, העבירו את הגדרות החשיפה למצב אוטומטי ולחצו על הלחצן Snapshot בלוח הבקרה של המצלמה כדי לצלם תמונה. לאחר מכן שמור את התמונה כקובץ .vsi באמצעות השם המתאים בתיקיה המעניינת.
  6. הנח את לוח סיכוך תאורת הסביבה כדי לכבות את אור ה- LED, שנה למסנן עבור עירור B, בחר שיטת תצפית 488 בסרגל הכלים, פתח תריס, צלם תמונה על ידי לחיצה על לחצן תצלום בזק, סגור תריס ולאחר מכן שמור קובץ כמתואר לעיל.
  7. חזור על כך עם מסנן לעירור G באמצעות שיטת התצפית המתאימה (אדום טקסס או CY3). לאחר מכן חזור על כל ההליך עבור כל באר של עניין.
  8. להחזיר את הצלחת לאינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C ולתרבת אותו כמתואר לעיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הבחנו בהצלחה BD-PSCs אנושיים לתאי אב אנדודרם / כבד והפטוציטים על ידי יישום פרוטוקול דו-שלבי. שינויים מורפולוגיים במהלך תהליך התמיינות הכבד מוצגים באיור 1. BD-PSCs מתמיינים להפטוציטים שעוברים שלושה שלבים שונים. השלב הראשון מייצג את ההתמיינות לתאים אנדודרמליים L4, השני, התמיינות לתאי אב כבדיים (הפטובלסט) L8, המציגים מורפולוגיה מצולעת טיפוסית, והשלישי, הבשלה להפטוציטים L15-L24.

ניתוח אימונופלואורסנציה בוצע כדי לאשר את התמיינות הכבד של BD-PSCs כפי שמוצג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכבד הוא איבר מרכזי בגוף האדם עם פונקציות ביולוגיות חיוניות רבות, כגון ניקוי רעלים של מטבוליטים. בשל אי ספיקת כבד חמורה כמו שחמת הכבד ו / או דלקת כבד ויראלית, ישנם כמעט 2 מיליון מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. השתלות כבד מדורגות במקום השני בהשתלות איברים מוצקים ברחבי העולם, אך רק כ-10% מהצורך הנוכחי מסופק22.

הפטוציטים אנושיים ראשוניים (PHH) משמשים לעתים קרובות לחקר רעילות הכבד. תאים אלה יכולים להישמר בתרבית לזמן קצר תוך שמירה על תפקודיהם הספציפיים. כמו כן, מספר התאים הזמיני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברת המקבילה מצהירה כי היא בעלת פטנט הקשור לחלבון מקושר GPI אנושי חדש. היא ייסדה ועובדת עם ACA CELL Biotech GmbH. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

תודות

המחברים אסירי תודה במיוחד על הסיוע הטכני שניתן על ידי אוקסנה וג'ון גרינאקר. עבודה זו נתמכה על ידי ACA CELL Biotech GmbH היידלברג, גרמניה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן אלבומיןSigma-AldrichSAB3500217מיוצר בעוף
Albumin Fraction VCarl Roth GmbH+Co. KGT8444.4
Alpha-1 FetoproteinProteintech Germany GmbH14550-1-APארנב פוליקלונלי IgG
Biolaminin 111 LNBioLamina LN111-02אנושי רקומביננטי
CD45 מיקרו-חרוזיםMiltenyi130-045-801חרוזים מגנטיים בגודל ננו
מסננת תאיםpluriSelect43-10040-40
CellSens תוכנת הדמיהאולימפוס
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל גריינר ביו-וואן210270
CEROplate 96 בארOLS OMNI מדעי החיים2800-109-96
CKX53 אולימפוס
חומר ניקוי זמין מסחריתפרוקטר & Gambleחומר ניקוי לא יוני
נוגדן ספציפי CYP2E1Proteintech גרמניה GmbH19937-1-APנוגדן רב-שבטי ארנב
IgG CYP3A4 Proteintech גרמניה GmbH67110-1-lgנוגדן חד שבטי לעכבר IgG1
Cytokeratin 18DakoCytomationM7010נוגדן חד שבטי לעכבר IgG1
DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
DPBSThermo Fisher Scientific14040091
FBSMerck MilliporeS0115/1030Bהופסק. זמין תחת: TMS-013-B
כיסוי זכוכית מחליק 14 מ"מR. Langenbrinck01-0014/1
GlutaMax 100x GibcoThermo Fisher Scientific35050038L-גלוטמין
גלוטראלדהיד 25%Sigma-AldrichG588.2-50ML
עיזים נגד עכבר IgG Cy3נוגדנים מקווניםABIN1673767עיזים פוליקלונליים
נגד עכבר IgG DyLight 488נוגדנים מקווניםABIN1889284עיזים רב-שבטיים
נגד ארנב IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11008
HClSigma-Aldrich30721-1LGL
HepatoZYME-SFM Thermo Fisher Scientific17705021מדיום התבגרות הפטוציטים
HGFThermo Fisher ScientificPHG0324רקומביננטי אנושי
HNF4 ואלפא; נוגדןSigma-AldrichZRB1457-25ULשיבוט 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (מלח נתרן)BiomolCay18226-100
החלפת סרום נוק אאוט - Multi Species Gibcoפישר סיינטיפיקA3181501KSR
נוקאאוט DMEM/F-12תרמו פישר סיינטיפיק12660012הופסק. זמין תחת קטלוג מס' 10-828-010
MACS BufferMiltenyi130-091-221
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303מעמד מגנטי
MEM NEAA 100x GibcoThermo Fisher Scientific11140035
MercaptoethanolThermo Fisher Scientific3135001050mM
MiniMACS עמודותMiltenyi130-042-201
Nunclon MultidishSigma-AldrichD67894 צלחות
באר Oncostatin MThermo Fisher ScientificPHC5015רקומביננטי
אנושי ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS סטריליCarl Roth GmbH+Co. KG9143.2
פניצילין/סטרפטומיציןBiochrom GmbHA221310000 U / ml
PS 15 מ"ל צינורות סטרילייםGreiner Bio-One188171
ארנב אנטי עוף IgG טקסס נוגדנים אדומיםבאינטרנטABIN637943
Roti Cell Iscoves MDMCarl Roth GmbH + Co. KG9033.1
Roti Mount FluorCare DAPICarl Roth GmbH + Co. KGHP20.1
Roti Sep 1077 אנושיCarl Roth GmbH + Co. KG0642.2
נוגדן טרנסתירטין SAB3500378 סיגמא-אולדריץ'מיוצר בעוף
Triton X-100Thermo Fisher ScientificHFH101%

מקורות

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  2. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620(2019).
  3. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  4. Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
  5. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
  6. Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
  7. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  8. Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
  9. Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
  10. Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964(2020).
  11. Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
  12. Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808(2021).
  13. Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634(2021).
  14. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267(2007).
  15. Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
  16. Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
  17. Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
  18. Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
  19. Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686(2022).
  20. Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
  21. Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
  22. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  23. Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית תאי כבד בתלת-ממדתאי גזע רב-עוצמה מוצאי דםגבייה כבדיתמצע הבשלה של תאי כבדאנליזת אימונופלואורסצנציהיצירת אורגנואידיםסממנים של תאי כבדפלטות בעלות הידבקות נמוכה
ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.