מעקב אחר הדינמיקה של וריאנטים מבניים באוכלוסיות שהתפתחו בניסוי

Summary

פיתחנו שיטה חסכונית לעקוב אחר דינמיקת אלל פולימורפיזם של נוקלאוטידים שאינם יחידים, שניתן להתאים בקלות לארכיונים קפואים של אבולוציה ניסיונית. טכניקת PCR משולשת שולבה עם אלקטרופורזה אוטומטית מקבילית של נימים כדי לכמת את התדירות היחסית של אלל החדרה במהלך האבולוציה הניסויית.

Abstract

וריאנטים מבניים (SVs) (כלומר, מחיקות, הוספות, כפילויות והיפוכים) ידועים כיום כממלאים תפקיד חשוב בווריאציה פנוטיפית, וכתוצאה מכך בתהליכים כגון קביעת מחלות או הסתגלות לסביבה חדשה. עם זאת, וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים מקבלים הרבה יותר תשומת לב מאשר SVs, כנראה משום שקל יותר לזהות אותם, וההשפעות הפנוטיפיות שלהם קלות יותר לחיזוי. הפיתוח של טכנולוגיות ריצוף עמוק לקריאה קצרה וארוכה שיפר מאוד את הזיהוי של SVs, אך כימות התדירות שלהם מנתוני ריצוף מאוגד (poolseq) עדיין מורכב ויקר מבחינה טכנית.

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה וזולה למדי, המאפשרת לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה של תדירות אלל SV. כדוגמה ליישום, אנו עוקבים אחר התדירות של החדרת רצף החדרה (IS) באוכלוסיות אבולוציוניות ניסיוניות של חיידקים. שיטה זו מבוססת על תכנון שלישיות פריימרים סביב גבולות הווריאנטים המבניים, כך שהאמפליקונים המיוצרים על ידי הגברה של האללים מסוג פרא (WT) ונגזרים נבדלים בגודלם בלפחות 5%, וכי יעילות ההגברה שלהם דומה. הכמות של כל אמפליקון נקבעת על ידי אלקטרופורזה נימית מקבילה ומנורמלת לעקומת כיול. ניתן להרחיב שיטה זו בקלות לכימות התדירות של וריאנטים מבניים אחרים (מחיקות, כפילויות והיפוכים) ולגישות pool-seq של אוכלוסיות טבעיות, כולל אוכלוסיות פתוגנים בתוך המטופל.

Introduction

וריאנטים מבניים (SVs) הם שינויים ברצף הגנומי, המשפיעים בדרך כלל על 50 bp או יותר. ארבע הקטגוריות של SVs המתוארים הן הוספות גדולות, מחיקות גדולות, היפוכים וכפילויות. עד לאחרונה, תשומת לב רבה יותר הוקדשה לווריאנטים חד-נוקלאוטידים (SNVs) מאשר לווריאנטים מבניים, במונחים של ההשפעות הפנוטיפיות שלהם ותפקידם כגורמים גנטיים של מחלות, או תרומתם להסתגלות. זה כנראה בגלל שקל יותר גם לזהות SNV וגם לחזות את ההשפעות הפנוטיפיות שלהם. עם זאת, טכנולוגיות ריצוף עמוק לקריאה קצרה וארוכה שיפרו מאוד את הזיהוי של SVs, לפחות בגנום בודד או שבטי¹. במקביל, ההשפעות הפנוטיפיות שלהם אופיינו טוב יותר, ותועדו דוגמאות רבות להשלכותיהם כגורמים גנטיים של מחלות אנושיות ^2,3 או הסתגלות לסביבה חדשה⁴.

מחיקות והחדרות, לעתים קרובות עקב החדרת אלמנטים גנטיים ניידים (MGE), משבשות הרבה יותר מפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) ומובילות למוטציות בהסטת מסגרת ולשינויים במבנה החלבון. מחיקות והחדרות MGE בתוך גנים כמעט תמיד גורמות להשבתה של גנים, והחדרות לאזורים שאינם מקודדים יכולות להוביל לדיכוי או לביטוי מכונן של גנים סמוכים כאשר רצפי החדרה (ISs) מכילים רצפי מקדם או סיום⁵. בעוד שפגיעה בגנים חיוניים מובילה להשפעות מזיקות ברורות על כושר החיידקים, אובדן גנים לא חיוניים מועיל במקרים מסוימים. למרות העלויות הטבועות בהן, כפילויות יכולות גם להיות יתרון, ולהשתתף בהסתגלות מכיוון שהן מובילות לשינוי במינון הגנים; עלייה בפעילות של חלבון מסוים יכולה להיות יתרון בהתאם לתנאים⁶.

אוכלוסיות אבולוציה ניסיוניות מיקרוביאליות מתחילות בדרך כלל עם שיבוטים. היעדר ראשוני זה של מגוון גנטי, בשילוב עם "הסביבה הסגורה" המאפיינת מבחנות, מוביל לפוטנציאל מוגבל מאוד של אבולוציה על ידי רווח גנים באמצעות העברה אופקית של גנים ורקומבינציה. בתנאים ספציפיים אלה, התרומה להסתגלות של מחיקות, כפילויות והחדרת MGE תוך גנומית חשובה במיוחד; חיידקים מסתגלים לעתים קרובות באמצעות מוטציות של אובדן תפקוד (בעיקר עקב מחיקות או החדרות MGE), המשפיעות על גנים שאינם שימושיים בסביבות מלאכותיות יציבות, לעתים קרובות עשירות בחומרים מזינים,^{מונוקולטורה 7}. בניסוי האבולוציה הארוך ביותר של E. coli , החדרות IS150 שכיחות במיוחד בקרב אוכלוסיות שהתפתחו לאחר 50,000 דורות, כאשר רכיבי IS מייצגים 35% מהמוטציות המגיעות לתדירות גבוהה באוכלוסיות השומרות על שיעור המוטציות של נקודת אבותיהם⁸.

מחקרי פיתוח וריצוף מחדש משלבים אבולוציה ניסיונית וטכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS) כדי לחקור כיצד חיידקים מסתגלים ברמה הפנוטיפית והגנומית לתנאים סביבתיים שונים וללחצים שונים, כגון מקורות פחמן ואנרגיה שונים, אנטיביוטיקה ועקה אוסמוטית 9,10,11 . מחקרים אלה בדרך כלל משיגים מידע גנומי על אוכלוסיות מפותחות או שיבוטים אך ורק בנקודת הסיום של הניסוי, ובמקרים מסוימים, במספר נקודות זמן ביניים^12,13,14. נתונים אלה מספקים תובנה לגבי גנים ומסלולים המעורבים בהסתגלות לסביבה נתונה, אך רק לעתים רחוקות מאפשרים לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה של אללים מתפתחים וסוחפים דה נובו לאורך זמן.

גישה אחת לעקוב אחר דינמיקות אלה היא לבחור מספר מוגבל של אללים מפרידים בעלי עניין (בגלל תפקוד הגנים שהם משפיעים עליהם, מכיוון שהם סוחפים במקביל באוכלוסיות עצמאיות וכו ') ולהשתמש בריצוף אמפליקון כדי לכמת את יחס האלל, איגום נקודות זמן רבות באותו ריצוף¹⁵. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי לעקוב אחר הדינמיקה של וריאנטים בגודל קטן (SNPs או 1 bp indels) בניסויים¹⁶ ו -¹⁷ אוכלוסיות טבעיות של חיידקים. עם זאת, במקרה של אינדל גדול יותר או החדרות MGE, הפרש הגודל של האמפליקונים גורם להבדלי יעילות PCR, אשר מעוותים את הקשר בין פרופורציות קריאה ואלל. במקרים מסוימים, הפרש הגודל בין שני האללים עדיף על האורך הקלאסי של האמפליקון. כאן, שילבנו טכניקת PCR משולשת עם אלקטרופורזה אוטומטית מקבילית של נימים כדי לכמת את התדירות היחסית של אלל החדרה בהתבסס על הבחנה בגודל. גישה זו מאפשרת ניצול של נקודות זמן ניסיוניות שאינן מנוצלות מספיק כדי לקבוע את הדינמיקה של אלל מוטנטי מתפתח ולעקוב אחר התדירות שלו לקיבוע או אובדן, באופן חסכוני. יישמנו שיטה זו כדי לעקוב אחר אללים מוטטיביים מתפתחים, שעברו מוטציה באמצעות החדרת IS10, וסיפקנו לגנוטיפ שעבר מוטציה פנוטיפ היפרמוטטור.

שיטה זו דורשת שני אללי מטרה עם הבדל של ≥5% בגודל. ראשית, שלישיות פריימר מתוכננות לייצר מקטעים בגודל דומה, החולקים פריימר משותף. שנית, תנאי PCR ממוטבים, ועקומת כיול נוצרת באמצעות תערובות של wild-type (WT) ו-gDNA מוטנטי. לבסוף, הדגימות מוגברות על ידי PCR, והתדירות היחסית של כל אלל מכומתת על ידי אלקטרופורזה קפילרית כמותית מקבילה.

Protocol

הגדרת פרוטוקול זה דורשת ידע מדויק של נקודת ההכנסה, המחיקה, ההיפוך או השכפול בתוך רצף האבות. מידע זה מתקבל בדרך כלל על ידי ריצוף גנום שלם (WGS) של דגימות נקודת הקצה או הביניים. בפרוטוקול הבא ניתן העיקרון הכללי למקרה של מוטציית החדרה לכל שלב, לצד מקרה מייצג שבו עוקבים אחר תדירות החדרת IS10 לגן mutS באוכלוסיית אבולוציה ניסיונית של E. coli. באוכלוסייה זו, WGS של אוכלוסיית נקודות הקצה זיהה הכנסה של 1,329 bp IS10 בין מיקומים 2,463 ו- 2,471, וכתוצאה מכך נוצר שכפול של אתר החדרה זה. שיטה זו ישימה לשלושת סוגי SV האחרים, והספציפיות של כל מקרה ניתנת בדיון.

1. עיצוב פריימרים לשלישייה

1. השתמש בשיטות עיצוב פריימר קלאסיות (18-24 bp, תוכן GC של 40%-60%, התחלה/סיום עם זוגות G/C במידת האפשר, הפרש_{T m} < 5°C) כדי לייצר פריימרים FW1 ו- RV1. תכננו פריימרים כדי להגביר אמפליקון קצר על אלל WT סביב אתר החדרת האלל המוטנטי (איור 1).
   הערה: גודל האמפליקון יכול לנוע בין 100 bp עד 3,000 bp, בהתאם לסולם גודל ה- DNA המשמש באלקטרופורזה נימית. בדוגמה זו, אמפליקון של 155 bp הוגדל. גודל המקטע הקטן שנבחר כאן מונע הגברה מחוץ למטרה של כל רצף החדרת IS10 (ראה סעיף 2).
2. תכננו פריימר קדמי שני FW2 בתוך רצף ההחדרה, כדי להפיק אמפליקון שני שהוא בערך 5% גדול או קטן יותר מאפליקון WT (איור 1). הבדל גודל זה של 5% הוא הפרש הגודל המינימלי שמכשיר אלקטרופורזה נימית מקבילית יכול להבחין באופן אמין. לכן, תכננו את הפריימרים כך שלשני האמפליקונים יהיה הבדל בגודל, שהוא מעל אך קרוב ככל האפשר לסף היחסי.
   הערה: הקפד למזער את הפרש T_m ואת היווצרות דימר פריימר. בדוגמה זו, פריימר קדמי שני תוכנן לייצר אמפליקון של 226 bp, גדול ב-71 bp ממגבר WT. בדוגמה מייצגת זו, רצפי הפריימר הם כדלקמן:
   FW1: AAAGCATTTCGCCGAACGCC
   RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
   FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG

איור 1: סכימה של תכנון פריימר משולש על הגן mutS WT והחדרת mutS IS10 מוטנטית. המשולש השחור מייצג את אתר החדרת IS10 בגן mutS. הגן WT הוא בכחול, וה-IS10 הוא בכתום. פריימרים FW1 ו-RV1 מסמנים את אתר החדרת IS10 ומפיקים מגבר WT של 155 bp. פריימר RV1 ופריימר FW2 intra-IS10 מייצרים אמפליקון שני של 226 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. אופטימיזציה של תנאי PCR

1. לגדל בן לילה תרבות של WT קבוע ושיבוטים של אללים מוטנטיים.
2. חלצו את הדנ"א באמצעות כל ערכה.
3. לכמת את הדנ"א.
4. הכינו את דגימת הדנ"א על ידי דילול מיצוי ה-WT והדנ"א המוטנטי ל-5 ננוגרם/μL. ערבבו את שתי דגימות הדנ"א ביחס של 50/50.
5. הגבירו 10 ננוגרם של שלוש דגימות הדנ"א (WT, מוטנט, תערובת 50/50) באמצעות תערובת מאסטר PCR מוכנה לשימוש פי 2, פריימר FW1 0.5 מיקרומטר, פריימר RV1 מיקרומטר 1 ופריימר FW2 0.5 מיקרומטר בנפח תגובה של 20 מיקרוליטר. השתמש בג'ל אגרוז 2% כדי להעביר את מוצר ה- PCR על ידי אלקטרופורזה קלאסית, ולקבוע את תנאי ה- PCR האופטימליים.
   הערה: יש למזער את זמני ההתארכות כדי למנוע היווצרות של אמפליקון FW1 ו-RV1 על האלל המוטנטי. יש להתאים את טמפרטורת החישול כדי למזער הגברה מוטה של האללים והגברה לא ספציפית.
   1. כדי לעקוב אחר התוכנית בדוגמה זו, השתמש בהגדרות הבאות: 98 ° C עבור 10 שניות, ולאחר מכן 25 מחזורים של 98 ° C עבור 1 s, 58 ° C עבור 15 שניות, 72 ° C עבור 8 שניות, ושלב התארכות סופי ב 72 ° C למשך דקה אחת.
      הערה: זמן ההתארכות קוצר ל-8 שניות כדי למנוע הגברה של תוצר >1,000 bp מהפריימר הקדמי והפריימר RV1 על האלל המוטנטי (mutS עם החדרת IS10).

3. עקומת כיול

1. ערבבו את שתי דגימות הדנ"א, WT ומוטנט, ביחסים של 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 ו-90/10.
   הערה: שכפולים ביולוגיים מוכנים מתרביות חיידקים עצמאיות בן לילה.
2. הגברה באמצעות תנאי PCR ממוטבים (ראה סעיף 2).
3. כמת את מכפלת האמפליקון.
4. יש לדלל את מוצרי ה-PCR ל-0.1 ננוגרם/מיקרוליטר.
5. הכן את מכשיר אלקטרופורזה נימי מקביל.
   1. מערבבים ג'ל וצבע טריים (ערכת ניתוח כמותי של NGS (22, 33 או 55); HS NGS קטע 1-6,000 bp עבור דוגמה זו).
      הערה: עיין במדריך השברים של אלקטרופורזה נימית מקבילית HS NGS לקבלת הוראות מפורטות (עיין בטבלת החומרים).
6. החלף את תמיסת האחסון הנימי ואת מאגר הכניסה, והנח את לוחית חיץ השטיפה במיקומי המגירה הנכונים של מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקביל.
7. הוסף 2 μL של סמן מדלל HS ל 22 μL של כל דגימה מדוללת בצלחת 96 באר.
8. הוסף סולם גודל (סולם גודל DNA; טווח 1-6,000 bp) מערכת ניתוח כמותי HS NGS לבאר אחת של צלחת 96 בארות.
9. הניחו את צלחת 96 הקידוחים במגירה הנכונה של מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקבילית, ובחרו באפשרות 'הפעל' בתוכנת מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקבילית.
10. נתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים, המזהה ומזהה כל שיא בסולם הגודל, ומקצה כל שיא של הדגימות לגודלן האמיתי הידוע.
    1. בעת שימוש בערכה כמותית, השתמש בתוכנה כדי לקבוע את כמות ה- DNA של כל מקטע על ידי שילוב האזור מתחת לשיא, כמו בניתוח נתוני כרומטוגרפיה. שוב, השוו דגימות עם כמויות ידועות בתקנים כדי לכמת כל שיא מדגימה, וחשבו את היחסים בין הפסגות השונות שזוהו בדגימות.
    2. בנו עקומת כיול (איור 2), המקשרת בין היחס הידוע בין האלל המוטנטי (תערובת הדנ"א) לזה שנמדד באמצעות מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקבילית. עקומת כיול זו מאפשרת להעריך ולתקן את אמינות השיטה עבור הטיית הגברה קלה.

4. הכנת מדגם

1. הגדל דגימות של נקודות זמן במהלך הלילה בתנאים סטנדרטיים.
2. לחלץ את הדנ"א.
3. לכמת את הדנ"א.
4. להגביר את הדגימות באמצעות תנאי PCR אופטימליים (ראה סעיף 2).
5. הפעל את הדגימות במכשיר אלקטרופורזה נימית מקבילית (ראה שלבים 3.5-3.10).

5. כימות אלל

1. חלץ כמויות אלל מוטנטיות מנתוני מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקבילית באמצעות התוכנה, וחשב את הפרופורציות בפועל על ידי התוויית ערכים אלה על עקומת הכיול.

Results

באמצעות דנ"א שהופק משיבוט קדמון ושיבוט היפרמוטטור שבודד מאוכלוסיית S2.11 בדור 1,000, ביססנו את עקומת הכיול שמוצגת באיור 2. הפרופורציות המוטנטיות בפועל מתערובות דנ"א שהוכנו במעבדה ונמדדו על ידי מכשיר אלקטרופורזה נימית מקביל קושרו על ידי יחס ליניארי של שיפוע 1.0706, עם R² של 0.9705. בנוסף, היה הסכם טוב בין העתקים ביולוגיים; סטיית התקן הייתה בין 0.61 ל-17.74 לאורך תשע הנקודות של עקומת התקן.

Discussion

כאן, הצענו שיטה חסכונית המאפשרת לעקוב אחר הדינמיקה של אללי SV אדפטיביים מתפתחים באוכלוסיות אבולוציה ניסיונית. שיטה זו משלבת טכניקות PCR קלאסיות ואלקטרופורזה קפילרית מקבילית אוטומטית, המאפשרת לקבוע את הכמויות היחסיות של שני אללים. לאחר ההגדרה, היא מאפשרת לכמת את פרופורציות האלל בדגימות רבות במקביל, והיא זולה בהרבה מ-WGS. ניתן לראות בשיטה זו מקבילה לריצוף אמפליקון עבור מוטציות שאינן SNP וכפתרון למגבלות הטכניות של ריצוף אמפליקון של SVs גדולים. הראינו שהשיטה מכמתת במדויק את שיעור המוטנטים שאינם SNP, באמצעות עקומת כיול שמתגבר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 צלחת PCR חצאית היטב	4titude	4Ti - 0740	PCR
אגרוז ביולוגיה מולקולרית כיתה	Eurogentec	EP-0010-05	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit מדריך מהיר למערכות מנתח השברים	Agilent		PDF מדריך הוראות
Buffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
לולאות ומחטים חיסון חד פעמיות מכוילות	LABELIANS	8175CSR40H	תרבית חיידקים
ערכת דם ורקמות Dneasy	Qiagen	69506	מיצוי DNA
ספק כוח אלקטרופורזה	Amilabo	ST606T	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
מנתח שברים מערכת CE אוטומטית	אלקטרופורזה נימית מקבילה	זריזה
שבר סולם DNA	Agilent	DNF-396, טווח 1-6000BP	אלקטרופורזה נימית מקבילה
GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT	Sigma-Aldrich	G1264-1G	תרבית חיידקים
סמן מדלל ברגישות גבוהה	Agilent	DNF-373	נימי מקביל אלקטרופורזה
ערכת ניתוח כמותי NGS רגישות גבוהה	Agilent	DNF-474	אלקטרופורזה נימית מקבילה
סולם עומס מהיר 1 kb פלוס סולם DNA	NEB	N0469S	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	תרבית חיידקים
Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
Primers	Eurogentec		PCR
Prosize תוכנת ניתוח נתונים v.4	Agilent	V.4	אלקטרופורזה נימית מקבילה
בדיקות Qubit	Invitrogen	MAN0010876	כימות DNA
Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	כימות DNA
Thermocycler	Eppendorf	Ep שיפועים	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Agarose ג'ל אלקטרופורזה הדמיה
מים להכנה להזרקה	Aguettant	PROAMP	PCR