מעקב אחר הדינמיקה של וריאנטים מבניים באוכלוסיות שהתפתחו בניסוי

Summary

פיתחנו שיטה חסכונית לעקוב אחר דינמיקת אלל פולימורפיזם של נוקלאוטידים שאינם יחידים, שניתן להתאים בקלות לארכיונים קפואים של אבולוציה ניסיונית. טכניקת PCR משולשת שולבה עם אלקטרופורזה אוטומטית מקבילית של נימים כדי לכמת את התדירות היחסית של אלל החדרה במהלך האבולוציה הניסויית.

Abstract

וריאנטים מבניים (SVs) (כלומר, מחיקות, הוספות, כפילויות והיפוכים) ידועים כיום כממלאים תפקיד חשוב בווריאציה פנוטיפית, וכתוצאה מכך בתהליכים כגון קביעת מחלות או הסתגלות לסביבה חדשה. עם זאת, וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים מקבלים הרבה יותר תשומת לב מאשר SVs, כנראה משום שקל יותר לזהות אותם, וההשפעות הפנוטיפיות שלהם קלות יותר לחיזוי. הפיתוח של טכנולוגיות ריצוף עמוק לקריאה קצרה וארוכה שיפר מאוד את הזיהוי של SVs, אך כימות התדירות שלהם מנתוני ריצוף מאוגד (poolseq) עדיין מורכב ויקר מבחינה טכנית.

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה וזולה למדי, המאפשרת לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה של תדירות אלל SV. כדוגמה ליישום, אנו עוקבים אחר התדירות של החדרת רצף החדרה (IS) באוכלוסיות אבולוציוניות ניסיוניות של חיידקים. שיטה זו מבוססת על תכנון שלישיות פריימרים סביב גבולות הווריאנטים המבניים, כך שהאמפליקונים המיוצרים על ידי הגברה של האללים מסוג פרא (WT) ונגזרים נבדלים בגודלם בלפחות 5%, וכי יעילות ההגברה שלהם דומה. הכמות של כל אמפליקון נקבעת על ידי אלקטרופורזה נימית מקבילה ומנורמלת לעקומת כיול. ניתן להרחיב שיטה זו בקלות לכימות התדירות של וריאנטים מבניים אחרים (מחיקות, כפילויות והיפוכים) ולגישות pool-seq של אוכלוסיות טבעיות, כולל אוכלוסיות פתוגנים בתוך המטופל.

Introduction

וריאנטים מבניים (SVs) הם שינויים ברצף הגנומי, המשפיעים בדרך כלל על 50 bp או יותר. ארבע הקטגוריות של SVs המתוארים הן הוספות גדולות, מחיקות גדולות, היפוכים וכפילויות. עד לאחרונה, תשומת לב רבה יותר הוקדשה לווריאנטים חד-נוקלאוטידים (SNVs) מאשר לווריאנטים מבניים, במונחים של ההשפעות הפנוטיפיות שלהם ותפקידם כגורמים גנטיים של מחלות, או תרומתם להסתגלות. זה כנראה בגלל שקל יותר גם לזהות SNV וגם לחזות את ההשפעות הפנוטיפיות שלהם. עם זאת, טכנולוגיות ריצוף עמוק לקריאה קצרה וארוכה שיפרו מאוד את הזיהוי של SVs, לפחות בגנום בודד או שבטי¹. במקביל, ההשפעות הפנוטיפיות שלהם אופיינו טוב יותר, ותועדו דוגמאות רבות להשלכותיהם כגורמים גנטיים של מחלות אנושיות

Protocol

הגדרת פרוטוקול זה דורשת ידע מדויק של נקודת ההכנסה, המחיקה, ההיפוך או השכפול בתוך רצף האבות. מידע זה מתקבל בדרך כלל על ידי ריצוף גנום שלם (WGS) של דגימות נקודת הקצה או הביניים. בפרוטוקול הבא ניתן העיקרון הכללי למקרה של מוטציית החדרה לכל שלב, לצד מקרה מייצג שבו עוקבים אחר תדירות החדרת IS10 לגן mutS באוכלוסיית אבולוציה ניסיונית של E. coli. באוכלוסייה זו, WGS של אוכלוסיית נקודות הקצה זיהה הכנסה של 1,329 bp IS10 בין מיקומים 2,463 ו- 2,471, וכתוצאה מכך נוצר שכפול של אתר החדרה זה. שיטה זו ישימה לשלושת סוגי SV האחרים, והספציפיות של כל מקרה ניתנת בדיון.

1. עיצוב פריימרים לשלישייה

1. השתמש בשיטות עיצוב פריימ....

Results

באמצעות דנ"א שהופק משיבוט קדמון ושיבוט היפרמוטטור שבודד מאוכלוסיית S2.11 בדור 1,000, ביססנו את עקומת הכיול שמוצגת באיור 2. הפרופורציות המוטנטיות בפועל מתערובות דנ"א שהוכנו במעבדה ונמדדו על ידי מכשיר אלקטרופורזה נימית מקביל קושרו על ידי יחס ליניארי של שיפוע 1.0706, עם R² של 0.9705. בנוסף, היה הסכם טוב בין העתקים ביולוגיים; סטיית התקן הייתה בין 0.61 ל-17.74 לאורך תשע הנקודות של עקומת התקן.

Discussion

כאן, הצענו שיטה חסכונית המאפשרת לעקוב אחר הדינמיקה של אללי SV אדפטיביים מתפתחים באוכלוסיות אבולוציה ניסיונית. שיטה זו משלבת טכניקות PCR קלאסיות ואלקטרופורזה קפילרית מקבילית אוטומטית, המאפשרת לקבוע את הכמויות היחסיות של שני אללים. לאחר ההגדרה, היא מאפשרת לכמת את פרופורציות האלל בדגימות רבות במקביל, והיא זולה בהרבה מ-WGS. ניתן לראות בשיטה זו מקבילה לריצוף אמפליקון עבור מוטציות שאינן SNP וכפתרון למגבלות הטכניות של ריצוף אמפליקון של SVs גדולים. הראינו שהשיטה מכמתת במדויק את שיעור המוטנטים שאינם SNP, באמצעות עקומת כיול שמתגבר.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 צלחת PCR חצאית היטב	4titude	4Ti - 0740	PCR
אגרוז ביולוגיה מולקולרית כיתה	Eurogentec	EP-0010-05	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit מדריך מהיר למערכות מנתח השברים	Agilent		PDF מדריך הוראות
Buffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
לולאות ומחטים חיסון חד פעמיות מכוילות	LABELIANS	8175CSR40H	תרבית חיידקים
ערכת דם ורקמות Dneasy	Qiagen	69506	מיצוי DNA
ספק כוח אלקטרופורזה	Amilabo	ST606T	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
מנתח שברים מערכת CE אוטומטית	אלקטרופורזה נימית מקבילה	זריזה
שבר סולם DNA	Agilent	DNF-396, טווח 1-6000BP	אלקטרופורזה נימית מקבילה
GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT	Sigma-Aldrich	G1264-1G	תרבית חיידקים
סמן מדלל ברגישות גבוהה	Agilent	DNF-373	נימי מקביל אלקטרופורזה
ערכת ניתוח כמותי NGS רגישות גבוהה	Agilent	DNF-474	אלקטרופורזה נימית מקבילה
סולם עומס מהיר 1 kb פלוס סולם DNA	NEB	N0469S	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	תרבית חיידקים
Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
Primers	Eurogentec		PCR
Prosize תוכנת ניתוח נתונים v.4	Agilent	V.4	אלקטרופורזה נימית מקבילה
בדיקות Qubit	Invitrogen	MAN0010876	כימות DNA
Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	כימות DNA
Thermocycler	Eppendorf	Ep שיפועים	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Agarose ג'ל אלקטרופורזה הדמיה
מים להכנה להזרקה	Aguettant	PROAMP	PCR